3.1 重组DNA技术的基本工具（第1课时）课件高二下学期生物人教版选择性必修3

基因工程基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNA技术。别名：操作环境：操作对象：操作水平：原理：结果：意义：重组DNA技术主要在生物体外基因DNA分子水平创造出人类需要的新的生物类型和生物产品基因重组定向改造生物遗传特性；彻底打破种间界限基因工程活动1：阅读课本P68、P69“基因工程的诞生和发展”，回答下列问题：①梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了什么？②在什么生物中发现了第一个限制酶？DNA的半保留复制细菌③基因工程正式问世的标志事件？④第一个基因工程药物是什么？重组人胰岛素⑤世界上第一例转基因烟草使用了什么方法培育？农杆菌转化法⑥什么为获取目的基因提供了有效手段？PCR⑦最新的基因组编辑技术是什么？CRISPR技术CH2

HOHHHHH碱基

磷酸

5’4’3’2’1’回顾DNA的结构PA脱氧核糖TGCAGTTGACCA5′3′3′5′DNA分子平面结构图磷酸二酯键课堂导入讨论DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？第3章基因工程第1节重组DNA技术的基本工具（第1课时）重组DNA技术的基本工具“分子手术刀”作用：准确切割DNA分子限制性内切核酸酶“分子缝合针”作用：将DNA片段连接起来“分子运输车”DNA连接酶作用：将体外重组DNA分子导入受体细胞通常使用质粒1.简称一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”2.来源限制酶主要来自原核生物大肠杆菌3.种类数千种思考：你能推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。（限制酶不是一种酶，而是一类酶）蓝细菌一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”4.命名用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的例：一种限制酶是从大肠杆菌（

Escherichiacoli）的R型菌株分离来的，就用字母EcoR

表示；如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoRI。练一练：①粘质沙雷氏杆菌（Serratiamarcesens）中分离的第一种限制酶，即

；②流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）的d菌株中分离到的第3种限制酶，则命名为

。SmaⅠHind

Ⅲ5.作用特点一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”能够识别双链DNA分子的特定脱氧核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开TGCAGTGACC5′3′3′5′磷酸二酯键具有专一性一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”6.识别的序列特点①大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成；②少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成；中轴线③都可以找到一条中轴线；④中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称、重复排列的，称为回文序列。7.结果一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”产生的DNA片段末端通常有两种形式(1)黏性末端：限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开黏性末端5’3’3’5’中轴线EcoRⅠ限制酶：(在G与A之间切割)特异性识别GAATTC

序列7.结果一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”产生的DNA片段末端通常有两种形式限制酶在它识别序列的中心轴线处切开平末端5’3’3’5’中轴线SmaⅠ限制酶：(在G与C之间切割)特异性识别CCCGGG

序列(2)平末端：一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”5’3’3’5’思考：①限制酶切割一次可断开几个磷酸二酯键？②产生多少个游离的磷酸基团？③产生几个黏性末端？④消耗几分子水？黏性末端中轴线2个2个2个2个一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”试一试：写出下列限制酶切割形成的末端序列（教材P75）5'-A3'-TTCGAAGCTT-3'A-5'5'-A3'-TGATCCTAGT-3'A-5'5'-T3'-AGATCCTAGA-3'T-5'总结：不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端同尾酶识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶。--ATGCATGCAT……CCAGAATTCCCA……TCCCTAAGAATTCCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GGTCTTAAGGGT……AGGGATTCTTAAGGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---Bt蛋白基因3’5’5’3’苏云金杆菌DNA片段中的部分基因3’5’5’3’3’5’5’3’Bt蛋白基因5’3’3’5’EcoRⅠ识别5'-GAATTC-3'序列，并在G与A之间切割。一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”那么需要用到什么工具将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子呢？1.作用将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被

切开的两个核苷酸之间的

。限制酶磷酸二酯键2.种类类型E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源作用部位差别大肠杆菌T4噬菌体E.coliDNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4DNA连接酶磷酸二酯键二、DNA连接酶——“分子缝合针”试一试：写出下列限制酶切割形成的末端序列（教材P75）5'-A3'-TTCGAAGCTT-3'A-5'5'-A3'-TGATCCTAGT-3'A-5'5'-T3'-AGATCCTAGA-3'T-5'总结：不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端同尾酶识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶。5'-A3'-TGATCCTAGA-3'T-5'不能被Spe

Ⅰ

限制酶和Xba

Ⅰ限制酶识别二、DNA连接酶——“分子缝合针”—GGATC——CCTAG——G—CCTAGGATC——课堂小测1、已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。（均填“能/不能/不一定能”）①能被限制酶I切割的DNA，

被限制酶II切割；②能被限制酶II切割的DNA，

被限制酶I切割；③DNA1被限制酶I切割，DNA2被限制酶II切割，加入DNA连接酶可得到DNA1和DNA2的重组DNA片段，该重组DNA片段

被限制酶I切割，

被限制酶II切割。—GATC——CTAG——GGATCC——CCTAGG—能不一定能不一定能能DNA连接酶DNA聚合酶相同作用实质化学本质不同点模板作用对象作用结果用途都能催化形成磷酸二酯键不需要需要DNA的一条链作模板形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制在两个DNA片段间形成磷酸二酯键将单个核苷酸连接到已有DNA片段，形成磷酸二酯键蛋白质3.DNA连接酶VSDNA聚合酶二、DNA连接酶——“分子缝合针”种类作用部位作用结果限制酶DNA连接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶解旋酶RNA聚合酶将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸将两个DNA片段连接成完整的DNA分子切割双链DNA分子将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端将双链DNA分子局部解旋为单链将双链DNA分子局部解旋为单链、将单个的核糖核苷酸连接到RNA单链末端磷酸二酯键氢键和磷酸二酯键氢键4.几种相关酶的比较二、DNA连接酶——“分子缝合针”课堂小测2、(教材P74)

DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（）A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端C三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”1.目的将外源基因送入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制。2.种类种类用途不同点将外源基因导入

细胞将外源基因导入

等细胞将外源基因导入

细胞将外源基因导入

细胞质粒噬菌体植物病毒动物病毒(主)各种植物大肠杆菌动物来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”3.最常用的载体——质粒拟核质粒大肠杆菌细胞氨苄青霉素抗性基因目的基因插入位点复制原点定义：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。来源：主要存在于细菌和真菌体内本质：环状双链DNA分子(细胞质基因)三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”4.载体需具备的条件①有一个至多个限制酶切割位点氨苄青霉素抗性基因目的基因插入位点复制原点启动子终止子供外源DNA片段（基因）插入其中②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制③具有特殊的标记基因(便于重组DNA分子的筛选)如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等④对受体细胞无害DNA聚合酶的结合位点，能复制并带着插入的目的基因一起复制转录的起点转录的终点在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”5.标记基因的筛选原理重组DNA导入受体细胞不是100%，而且导入率较低培养含氨苄青霉素的培养基未导入质粒导入空载质粒导入重组质粒存活存活无法存活三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”5.标记基因的筛选原理思考：如何提高筛选的准确性？【资料】LacZ

基因表达产生的β-半乳糖甘酶能够分解X-gal，产生蓝色物质，从而使菌落呈蓝色；否则菌落呈白色。请分析下列3种大肠杆菌在含X-gal和青霉素的固体培养基上的存活情况及菌落颜色。La