病理检验技术 课件 第7-13章 细胞学检验技术和细胞学诊断 -病理档案管理

病理检验技术

细胞学检验技术和细胞学诊断目

录第一节细胞学检验技术01第二节细胞学检查与诊断02第三节细胞形态学变化03第五节细胞学检验的质量控制05第四节液基薄层细胞检查技术04学习目标知识目标能力目标素质目标

1.掌握制作病理细胞标本的采集、制片、固定及染色技术；常用细胞学检查方法、液基薄层细胞制片技术和涂片的识别。2.熟悉常见正常细胞、核异质细胞、肿瘤细胞的形态特点。3.学会独立操作细胞学涂片及染色过程并评价制片效果。1.培养严格遵守操作规程、规范操作的职业精神，

具有认真细致的工作态度。2.热爱生命，树立正确的世界观、价值观和人生观。1.熟悉病理细胞学检验的概念，应用范围及注意事项。2.了解细胞学检查的应用范围、诊断方法及质量控制。案例导入患者，赵某，女性，47岁。临床检查：宫颈呈糜烂样改变，白带异味，考虑宫颈癌或癌前病变，建议做宫颈细胞学检查。宜选用哪种制片方法及染色技术呢？第一节

细胞学检验技术

第一节细胞学检验技术一、细胞学检验技术概述二、细胞学标本的采集三、细胞学制片四、细胞的固定五、细胞的染色第一节细胞学检验技术一、细胞学检验技术概述细胞病理学又称诊断细胞学或临床细胞学，是通过观察细胞的结构和形态来研究和诊断疾病的一门科学，与病理组织学改变关系密切，病理学的分支学科之一。临床上根据细胞标本来源分为脱落细胞学针吸细胞学第一节细胞学检验技术二、细胞学标本的采集（一）脱落细胞标本的采集

正常或病理情况下，自然脱落下来的细胞，随分泌物、排泄物等排出体外，称脱落细胞。（二）细针穿刺细胞标本的采集临床医师应用外径0.6～0.9mm细针头，10ml左右的一次性空针，穿刺近体表组织器官，如浅表淋巴结、甲状腺肿块、乳腺肿块、肝及软组织等，吸取少量细胞制成涂片；影像科医师也可在B超、X射线或CT引导下，施行内脏包块穿刺。（三）细胞学常用标本1.妇科涂片

包括宫颈刮片、阴道残端刮片、阴道穹刮片、阴道侧壁刮片及宫腔吸片等。

2.呼吸道涂片

包括痰涂片、纤维支气管镜刷片及细支气管肺泡灌洗液。

3.尿液及前列腺液、乳头溢液、体表溃疡刮片及体表或深部脏器包块细针穿刺涂片等。4.浆膜腔积液

包括胸腔积液、腹水及心包积液等。第一节细胞学检验技术三、细胞学制片1.涂抹法2.推片法3.拉片法4.印片法5.压片法6.甩片法7.喷射法8.液基薄层细胞制片法第一节细胞学检验技术四、细胞的固定固定目的是保持细胞的自然形态，防止细菌导致标本腐败或细胞自溶及丢失。新鲜标本应及时固定，可使染色效果更佳，利于检测。（一）常用固定液1.95％乙醇

2.乙醚-乙醇固定液

3.三氯甲烷乙醇固定液即Carnoy液4.甲醇

（二）固定方法固定可应用浸入法或滴加法。根据固定时机，又分为湿固定、潮干固定及干燥固定。第一节细胞学检验技术五、细胞的染色（一）巴氏（Papanicolaou）染色法（二）苏木精-伊红（HE）染色法（三）瑞氏（Wright）染色法（四）迈-格-吉（May-Grünwald-Giemsa，MGG）染色第二节

细胞学检查与诊断

第二节

细胞学检查与诊断一、细胞学检查与诊断概述二、细胞学检查与诊断的应用范围三、细胞学检查与诊断的优缺点四、细胞学检查与诊断的注意事项第二节

细胞学检查与诊断一、细胞学检查与诊断概述细胞学检查与诊断通过采集细胞标本，经过涂片、固定、染色等技术制片，在显微镜下观察细胞形态，包括细胞的大小和形状，核的大小和形状，核染色质颗粒和分布，核膜、核仁与核分裂，核质比等特征来诊断疾病，又称为细胞病理学、诊断细胞学或临床细胞学。根据标本来源不同分为妇科细胞学和非妇科细胞学，根据采样方式不同分为脱落细胞学和细针穿刺吸取细胞学。第二节

细胞学检查与诊断二、细胞学检查与诊断的应用范围1.良性病变的提示或诊断

如胸腔积液、腹水涂片，查见大量淋巴细胞提示结核；宫颈涂片发现大量线索细胞，提示细菌性阴道病；发现滴虫，可诊断为滴虫性阴道炎。2.癌前病变的发现

如宫颈上皮内瘤，及时治疗防止发生癌变。3.肿瘤的筛查与诊断

如宫颈涂片、痰涂片、食管拉网检查，为癌症早期治疗和进一步检查提供依据。4.癌瘤治疗后观察

如肿瘤切除或放疗后，观察疗效，判断复发与转移。5.阴道脱落细胞学检查

判断女性雌激素水平，了解卵巢功能，指导内分泌治疗。三、细胞学检查与诊断的优缺点第二节

细胞学检查与诊断（一）优点1.设备简单、技术简便、容易掌握、易于普及。2.取材安全方便，无创或微创，可反复取材，无任何不良反应。某些器官局部（如子宫颈）进行多位点的脱落细胞学检查。3.费用低，报告快，检出率较高，病人容易接受，受临床医生认可。4．癌细胞检出率较高，如技术条件好，采集细胞方法正确，某些肿瘤阳性率可达80％～90％。对某些无明显临床表现的恶性肿瘤，如隐性肺癌，能够得到早期诊断。（二）缺点1.取材部位不准，涂片过厚过薄，脱落细胞常有退变,影响诊断结果。2.对黏膜表面的脱落细胞和体腔抽出液中的脱落细胞，不能全面观察病变组织的结构层次，因此不利于对肿瘤做组织学分型。3.在某些情况下，不能确定肿瘤发生的具体部位，如腹水中检出癌细胞，不能判断肿瘤细胞的来源，浸润的程度和病灶范围。4.受病理技术和阅片经验影响，易出现假阴性或假阳性。第二节

细胞学检查与诊断四、细胞学检查与诊断的注意事项1.取材准确

2.操作规范3.认真观察

4.结合临床5.善于总结

6.加强学习第三节

细胞形态学变化

第三节细胞形态学变化一、正常上皮细胞与脱落后的形态变化二、常见正常非上皮细胞的形态变化三、良性上皮细胞变化四、核异质细胞五、肿瘤细胞学第三节细胞形态学变化一、正常上皮细胞与脱落后的形态变化（一）复层鳞状上皮细胞复层鳞状上皮细胞主要分布于全身皮肤、口腔、咽喉、食管、肛门、宫颈外口、阴道及阴茎等。鳞状上皮由紧密排列的上皮细胞构成，从底层至表层可分为内底层细胞、外底层细胞、中层细胞、角化前细胞和不完全角化细胞。不全角化细胞在生理或病理情况下，可逐渐衰老死亡，胞核碎裂成小片或逐渐变淡而消失，成为无核的“完全角化细胞”，胞质巴氏染色呈橘黄色。第三节细胞形态学变化一、正常上皮细胞与脱落后的形态变化细胞种类内底层细胞外底层细胞中层细胞角化前细胞不全角化细胞大小直径12～15μm15～30μm30～40μm40～50μm4～50μm形态圆形圆形或卵圆形卵圆形或菱形扁平多边形扁平多边形胞膜清楚清楚清楚清楚清楚胞质暗绿色稍淡于内底层细胞浅绿色浅绿色鲜红色核位置居中居中居中居中居中核形状圆形圆形圆形圆形固缩核直径8～10μm略小于内底层细胞略小于外底层细胞6～8μm约为4um核染色质均匀细颗粒状细颗粒状细颗粒状细颗粒状匀细核质比1:0.5～1:11:1～1:21:2～1:31:3～1:51：5以上表7-1复层鳞状上皮细胞各层的形态特点（巴氏染色）第三节细胞形态学变化一、正常上皮细胞与脱落后的形态变化（二）柱状上皮细胞主要分布于呼吸道、消化道、女性生殖道，如鼻腔、支气管、气管、胃、肠、宫颈管、宫内膜和输卵管等。组织学可分为单层柱状上皮、假复层纤毛柱状上皮和复层柱状上皮。脱落后，根据形态和功能不同可分为纤毛柱状上皮细胞和黏液柱状上皮细胞。一、正常上皮细胞与脱落后的形态变化第三节细胞形态学变化（三）移行上皮细胞移行上皮细胞分布于肾盂、肾盏、输尿管、膀胱及尿道起始部，为复层上皮细胞，其细胞层次和形态随器官的舒缩或充盈程度而改变。分为基底层，中间层和表层移行上皮。（四）间皮细胞间皮细胞是附着于胸腔、腹腔、心包腔表面的单层上皮细胞。呈圆形或卵圆形，直径10～20μm，甚至更大。核圆形，中央或偏位，常为单个，增生活跃时可为双核。核染色质细颗粒状，偶见小核仁。根据成熟程度及脱落时间长短分为幼稚型(碱性)间皮细胞、成熟型(嗜酸性)间皮细胞以及退化变性型间皮细胞。第三节细胞形态学变化一、正常上皮细胞与脱落后的形态变化（五）内皮细胞内皮细胞分布于血管和淋巴管内层，可见于穿刺细胞涂片中。游离的血管内皮细胞呈圆形或梭形，胞质丰富，其中可见空泡、异物或吞噬的色素颗粒。细胞核圆形或椭圆形，位于细胞中央或稍偏位，染色质细致均匀，可见核仁。淋巴管内皮细胞常为圆形，胞质中通常看不见空泡或吞噬物。（六）腺上皮细胞腺上皮细胞组成内分泌腺和外分泌腺，具有分泌功能。多不形成管腔通道，如甲状腺、肝、胰腺等，只有通过穿刺才能获得。1.柱状腺上皮细胞2.杯状细胞第三节细胞形态学变化二、常见正常非上皮细胞的形态变化（一）红细胞（二）白细胞（三）巨噬细胞或组织细胞（四）脂肪细胞（五）黏液细胞（六）成纤维细胞（七）肌细胞（八）多核巨细胞（九）骨及软骨细胞第三节细胞形态学变化三、良性上皮细胞变化（一）退化变性退化变性主要是细胞自然衰老死亡的过程，表现为肿胀性退化变性和固缩性退化变性两种类型。第三节细胞形态学变化三、良性上皮细胞变化（二）炎症变性炎症变性的上皮细胞形态可发生不同程度的改变，主要表现为细胞核的改变。1.鳞状上皮细胞炎症改变细胞核表现为核肥大、核固缩、核异型和核碎裂等。2.柱状上皮细胞的炎症改变

主要表现为明显的核固缩。3.鳞状上皮细胞化生

鳞状上皮细胞化生是细胞炎症变性的一种特殊类型，即为柱状上皮细胞在炎症等因素刺激下，上皮细胞坏死脱落，储备细胞增生，变为鳞状上皮细胞的一个过程，称为鳞状上皮细胞化生，简称鳞化。鳞化细胞常见于慢性宫颈炎的宫颈涂片中，亦可见于老年性慢性支气管炎的痰涂片中，根据形态可分为成熟型和不成熟型两种。4.修复细胞

修复细胞多见于宫颈涂片中，常在重度宫颈炎、宫颈活检、电热灼伤、放射治疗、子宫全切或锥切后出现。第三节细胞形态学变化四、核异质细胞核异质细胞是指细胞核异常，而胞质分化尚正常的细胞，表现为核增大、大小不一，形态多样，核染色质增多、深染，分布不均匀，核膜增厚，核边界不整齐等，可出现双核与多核。核异质细胞形态介于良性细胞和恶性细胞之间，又称间变细胞，相当于组织病理学的不典型增生。按细胞核异型的程度，核异质细胞分为轻度核异质细胞、中度核异质细胞和重度核异质细胞。第三节细胞形态学变化五、肿瘤细胞学（一）恶性肿瘤细胞的形态学特征1.大小

癌细胞核一般为正常细胞（如背景中的淋巴细胞）的1～5倍，甚至10倍以上。各个癌细胞核增大程度不一致，同一视野的癌细胞核大小相差悬殊。2.形态

恶性肿瘤细胞核可出现明显的畸形，表现为细胞核形态不规则，呈结节状、三角形、蝌蚪形等；有时核膜凹陷呈分叶或折叠状。可见多核、裸核及病理性核分裂象，如不对称分裂等。3.染色

癌细胞核的染色质增多、颗粒变粗，常聚集在核膜下，使核膜增厚，染色加深，可呈墨水滴样；核内染色质分布不均，染色深浅不一。4.核仁

体积增大，形态异常，数目增多，常呈嗜酸性。5.核质比

核质比增大是恶性肿瘤细胞最重要的形态特征。癌细胞分化愈差，核质比失常愈明显。癌细胞与核异质细胞均具有核的异质性第三节细胞形态学变化五、肿瘤细胞学鉴别点核异质细胞癌细胞核增大1倍左右，轻度增大1～5倍，显著增大核大小不一大小相似，差别不大明显核形状轻度至中度不规则畸形明显不规则畸形核仁一般不明显易见，增多、增大并有异型性核质比无明显变化，或轻度增高明显增高病理性核分裂无有表7-3癌细胞与核异质细胞核的鉴别第四节

液基薄层细胞检查技术

第四节液基薄层细胞检查技术液基薄层细胞制片技术可应用于所有的脱落细胞学检查。目前主要用于妇科宫颈涂片制备，筛查宫颈癌，为宫颈癌的早期诊断和治疗提供了明确的诊断依据。也用于胸腔积液、腹水涂片，痰和尿液等检查及筛查癌和癌前病变，还可用于免疫组织化学、分子原位杂交、显微镜测量及流式细胞学检查，是目前应用较广泛的临床检验技术。第四节液基薄层细胞检查技术一、妇科液基薄层细胞学检查二、其他液基薄层细胞学检查一、妇科液基薄层细胞学检查第四节液基薄层细胞检查技术病变分级评价未见上皮内病变或恶性病变（NILM）①与炎症有关的反应性形态变化：细胞对炎症、损伤、放疗和化疗的反应性改变；②宫内节育环引起上皮细胞的反应性改变等情况；③子宫切除后的腺细胞；④萎缩性反应性改变。鳞状上皮细胞异常①非典型鳞状上皮细胞，意义不明确（ASC-US）；②非典型鳞状上皮细胞，不除外鳞状上皮内高度病变（ASC-H）；③低级别鳞状上皮内病变（LSIL）：相当于宫颈鳞状上皮轻度非典型增生（CINI）；④高级别鳞状上皮内病变（HSIL）：包括CINII、CINIII；⑤鳞状细胞癌：如能明确组织类型，则按下述报告：角化型鳞癌；非角化型鳞癌；小细胞型鳞癌。腺上皮细胞病变①非典型腺细胞，非特异性（AGC，NOS）：包括宫颈管非典型腺细胞和宫内膜非典型腺细胞；②非典型子宫颈管细胞，倾向肿瘤；③子宫颈管原位腺癌（AIS）；④腺癌：应判断腺癌的来源，如来自子宫颈管、子宫内膜或子宫外。宫颈其他恶性肿瘤原发或转移的肉瘤等，需具体说明表7-4非肿瘤病变和恶性肿瘤TBS分级及评价第四节液基薄层细胞检查技术二、其他液基薄层细胞学检查（一）支气管、肺脱落细胞学检查（二）脑脊液细胞学检查（三）浆膜腔积液细胞学检查（四）泌尿道脱落细胞学检查第五节

细胞学检验的质量控制

第五节细胞学检验的质量控制一、严格管理二、坚持复查制度三、建立室内和室间质控联系第五节细胞学检验的质量控制一、严格管理建立完善系统的细胞病理学检查管理制度，严格管理。根据标本接收、编号、记录、涂片、固定、染色、镜检、报告、归档等技术流程，建立健全规章制度，严格遵守操作规程。病理检验技师制片时做到准确采集标本、涂片，防止涂片过厚或过薄；及时固定；保证染色清晰、层次分明。在固定染色的过程中要防止细胞污染，定期过滤、更新固定液和染色液。细胞病理学医师阅片时应细心阅片，避免假阳性与假阴性的发生；减少人为因素影响及技术差错。第五节细胞学检验的质量控制二、坚持复查制度阳性病例和可疑病例应多人会诊，反复观察，减少误诊。如遇以下问题必须复查：1.涂片中发现难于诊断的可疑癌细胞。2.涂片中坏死细胞过多或细胞成分太少。3.细胞学检查结果与临床诊断明显不符。4.按细胞学检查结果治疗，病情无明显好转或反而恶化。5.诊断明确，但病情突然恶化。6.可疑技术工作中有差错时，如编号错误、涂片被污染、细胞自溶、染色不良等。第五节细胞学检验的质量控制三、建立室内和室间质控联系1.建立执行双人复检、多人会诊制度；2.建立岗位责任，检验结果定期抽查、核对制度；3.规定具体的试剂配制及定期更换条例；制作详细的操作卡片；4.尽量从管理制度上杜绝质量事故的发生，使实验室工作中每个与质量有关的问题都查有记录，有专人管理，有章可循。谢谢观看病理检验技术

尸体剖检技术高职高专医学检验技术专业系列教材目

录第一节尸体剖检的概念和意义01第二节尸体剖检过程和记录02第三节尸体剖检过程中的分工与配合03第四节尸体剖检注意事项04学习目标知识目标能力目标素质目标1.掌握尸体剖检的概念和意义。2.熟悉尸体剖检过程、方法及注意事项。1.能在尸体剖检过程中合理分工完成尸检流程。2.能进行尸体剖检过程的记录。1.具有实事求是、科学严谨的工作态度。2.具有敬畏生命、护卫健康的仁爱意识。第一节

尸体剖检的概念和意义一、尸体剖检的概念1.法医尸体解剖

在司法机关的委托或授权下，由法医专业人员对涉及刑事、民事或行政案件的死者的尸体进行的解剖检查，其目的是为了协助司法机关查明案件的真相，保障司法公正。2.尸体病理解剖

由病理专业人员对尸体进行的解剖检查，通过系统观察，发现死者各组织器官的病理变化，从而分析疾病的发生、发展过程，判断其直接死亡原因的技术和方法。本章重点介绍尸体病理解剖。二、尸体剖检的意义①查明死因和病变②发现新病种③积累医学资料④收集教学标本第二节

尸体剖检过程和记录

一、尸体剖检过程及方法（一）尸体剖检前的准备1.检查送检手续2.阅读送检单和临床病历摘要3.选择合适的解剖时间和地点4.准备解剖工具和防护用品

一、尸体剖检过程及方法（二）体表检查1.死亡征象检查生命体征消失、尸冷、尸僵、尸斑和尸体腐败等。2.体表检查（1）一般检查（2）头颈部检查（3）胸腹部检查（4）四肢检查

一、尸体剖检过程及方法（三）胸腹腔检查1.切口切口的形状和位置应根据尸检的目的和要求而定。（1）T形切口（2）Y形切口（3）I形切口（直切口）（4）其他切口

一、尸体剖检过程及方法（三）胸腹腔检查1.切口切口的形状和位置应根据尸检的目的和要求而定。（1）T形切口（2）Y形切口（3）I形切口（直切口）（4）其他切口2.腹腔检查

积液、黏连、出血、坏死等。3.胸腔检查呼吸系统和循环系统的功能和状况，以及有无胸膜炎、胸腔积液、气胸、血胸、脓胸、胸腔肿瘤等。

一、尸体剖检过程及方法（四）内脏器官的取出和检查方法尸体剖检时，内脏器官的取出方法有各脏器分别取出法和多脏器联合取出法，应根据尸体的情况和检验的目的适当选择。

一、尸体剖检过程及方法（五）病原学检查病原学检查的目的是在尸体的各个部位或体液中寻找和鉴定可能引起疾病的微生物或寄生虫，或者检测其特异性的抗原或抗体。

一、尸体剖检过程及方法（六）化学和毒物检查化学和毒物检查是指在尸体的各个部位或体液中检测和鉴定可能引起疾病或死亡的化学物质、毒物及其代谢产物等，以确定化学物质或毒物的含量和分布。送检样本可以是胃肠道及其内容物、血液、大小便、组织标本如心、肝、肾、脾、肺、脑、骨、肌肉及毛发等。

二、尸体剖检记录（一）尸检申请单1.死者的基本信息2.死亡原因3.申请尸检的目的4.家属签字5.尸检批准单位和批准时间

二、尸体剖检记录（二）临床病历摘要临床病历摘要应由送检医院主管该病人的医生填写，应包括：主诉、发病经过、主要症状和体征、临床诊断以及诊断的依据、治疗经过、各种化验检查结果以及检查的时间和地点、死亡前的表现、临床死亡原因等。

二、尸体剖检记录（三）病理解剖记录病理解剖记录是尸检的核心内容，是尸检的实证。病理解剖记录应由尸检医师或尸检助理在尸检过程中进行，包括以下内容：1.肉眼检查记录即对尸体的外观、体表、体腔、脏器等的直接观察和测量，以及对尸体的切开、切片、刮取等的操作和结果的描述。肉眼检查记录应按照尸检的顺序和方法进行。2.显微镜检查记录即对尸体的组织、细胞、涂片等的制作、染色、观察、分析、判断的过程和结果的描述。

二、尸体剖检记录（四）病理诊断及死亡原因病理诊断及死亡原因应由尸检医师或尸检助理在完成肉眼检查和显微镜检查后，根据尸检的所有资料，综合分析，作出病理诊断，明确死亡原因。病理诊断及死亡原因应注意与临床死亡原因的一致性和差异性，以及差异的原因和解释，如尸检发现的新的病变、未诊断的病变、误诊的病变、并发的病变等。

二、尸体剖检记录（五）讨论与结论讨论与结论由尸检者本人或上级病理医师根据病理诊断及死亡原因，结合临床资料和文献资料，进行客观、公正、科学、合理的分析和评价。包括对病变之间的关系和作用的分析、对临床与病理之间的联系和影响的分析、对未能解决的问题和困难的分析、对尸检的质量和效果的评价、对尸检的建议和改进等。第三节

尸体剖检过程中的分工与配合

一、主检医师1.根据死者的临床资料，制定合理的尸检方案，确定尸检的目的和重点，避免盲目和漏检。2.按照规范的尸检程序，正确地分离、取出、检查各脏器，注意观察和记录各种病变和异常情况，及时采取必要的特殊检查，如气胸试验、胆囊通畅试验等。3.准确、完整、清晰地描述尸检的过程和结果，使用专业的术语和符号，遵循一定的格式和顺序，不要遗漏或混淆重要的信息。4.根据肉眼检查和显微镜检查的结果，结合临床资料和文献资料，进行科学的分析和评价，作出正确的病理诊断和死亡原因。5.与技术员、送检医师、死者家属等进行有效的沟通和协作，明确各自的职责和要求，互相配合和支持，解决尸检过程中可能出现的问题和困难。

二、技术员1.理解和执行主检医师的指示，按照尸检的流程和要求，准备好所需的工具和器械，协助主检医师进行尸检。2.在主检医师的指导下，协助开颅、开胸、开腹等操作，注意保护尸体的完整性和尊严，避免造成不必要的损伤和污染。3.在主检医师的监督下，做好尸检的临时记录。4.制作各组织、细胞、涂片等的标本，进行常规的染色和特殊的染色，为显微镜检查提供必要的材料。5.在尸检前后，做好尸体的清洗和消毒，做好器械的清洗和消毒，做好个人的防护和消毒，避免感染和污染，注意个人和环境的卫生和安全。第四节

尸体剖检注意事项

尸体剖检注意事项1.尸检知情同意书、尸检申请书。2.牵涉纠纷的尸检，尸体未冷冻48小时以内，冷冻约7天以内解剖。3.尸检时谢绝死者直系家属参观。4.若发现法定传染病，应及时向卫生防疫部门报告。5.尸检结束后，将不需保留的脏器放回体内。谢谢观看病理检验技术

免疫组织化学技术和应用高职高专医学检验技术专业系列教材目

录第一节免疫组织化学概述01第二节免疫组织化学的基本技术02第三节免疫组织化学的常用染色方法03第四节免疫组织化学在临床病理工作的应用04学习目标知识目标能力目标素质目标掌握免疫组化技术的概念、操作步骤。熟悉免疫组化技术的注意事项。能进行免疫组织化学常用液体及抗体的配制，会操作免疫组织化学常用仪器进行染色。

严格遵守操作规程、规范操作的职业精神。严谨认真的工作态度、一丝不苟的工作作风。第一节

免疫组织化学概述一、免疫组织化学技术的基本原理

免疫组织化学技术(immunohistochemistrytechnique)又称免疫细胞化学技术，习惯简称免疫组化，是利用免疫学反应和化学反应在组织切片或细胞涂片上原位显示组织细胞中的抗原以及抗原的分布和含量，以了解相关抗原在组织和细胞中的变化及其意义的一种方法。二、免疫组织化学技术的特点

1.特异性强

2.敏感性高

3.定性、定位、定量相结合

4.方法基本相同

5.应用范围广三、免疫组织化学技术的局限性

病理诊断主要是依据常规HE染色切片，免疫组化技术只是一种辅助手段。高质量的免疫组化染色结果能辅助病理医师更准确地进行病理诊断，提高病理诊断水平；非特异性的免疫组化染色结果可能会引起漏诊和误诊甚至造成错误的病理诊断。目前，免疫组织化学技术逐步代替了许多特殊染色和组织化学技术方法，但仍无法完全取代。第二节

免疫组织化学的基本技术一、免疫组织化学标本的取材、固定、切片及注意事项(一)取材1.组织标本的取材(1)活体组织标本的取材(2)手术切除标本的取材2.细胞标本的取材(1)穿刺法(2)沉淀法(3)印片法一、免疫组织化学标本的取材、固定、切片及注意事项(二)固定1.常用的固定液用于免疫组织化学的固定液种类较多，不同的固定液有不同的作用。至今还没有一种固定液能用于所有染色组织的固定。(1)醛类固定液。(2)丙酮及醇类固定液。2.常用的固定方法(1)浸泡固定法。(2)注射或灌注固定法。(3)微波固定法。3.固定的注意事项一、免疫组织化学标本的取材、固定、切片及注意事项(三)切片

切片要求薄而平整，一般厚度在3～5μm之间，细胞密集的组织，如淋巴结，应当切3μm薄片，切片太厚会影响免疫组织化学染色的结果和结果判断，还容易在染色过程中发生脱片。1.石蜡切片2.冷冻切片二、免疫组织化学常用液体及抗体的配制(一)常用液体的配制1.常用的缓冲液（1）0.01mol/L磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersaline，PBS）

NaH2PO40.2gNa2HPO40.5gNaCl8.0g蒸馏水加至1000ml二、免疫组织化学常用液体及抗体的配制(一)常用液体的配制2.常用的抗原修复液（1）0.01mol/L柠檬酸缓冲液（pH6.0）

柠檬酸（C6H8O7·H2O）0.38g柠檬酸钠（Na3C6H5O7,·2H2O）2.41ml蒸馏水加至1000ml二、免疫组织化学常用液体及抗体的配制(二)抗体的稀释和保存1.抗体的稀释(1)影响抗体稀释度的因素(2)抗体最佳稀释度的测定方法1）直接测定法：在二抗或三抗的稀释度已知的情况下,用于检测第一抗体的最佳稀释度。可以将一抗稀释为1:50、1:100、1:200、1:400、1:500等几个稀释度，分别滴加在阳性抗原切片上，同时设置阴性对照。2）棋盘测定法：当两种以上抗体的最佳稀释度都未知时采用此法。将一抗和二抗分别按不同滴度稀释，对已知阳性切片进行染色。二、免疫组织化学常用液体及抗体的配制(二)抗体的稀释和保存2.抗体的分装和保存

分装在安瓿或0.25ml带盖塑料离心管中，可按每安瓿5～50μl分装，并标记清楚(名称、批号、效价、量)，密封后放入-40～-20℃冰箱中保存备用，一般可保存1～2年。3.孵育方法及时间

抗体孵育应在特制的湿盒内进行，以免切片因水分蒸发、干燥而导致染色失败。孵育温度为室温或37℃，孵育时间常为1小时左右，也在4℃冰箱过夜。二、免疫组织化学常用液体及抗体的配制(三)显色与显色剂配制1.显色

免疫组织化学技术中，抗原抗体反应所形成的复合物本身没有颜色，无法进行观察和判断，需要借助某些化学基团的呈色反应使其显色，才能在显微镜下观察。二、免疫组织化学常用液体及抗体的配制(三)显色与显色剂配制2.显色剂及其配置1）DAB显色液DAB2mg0.05mol/LTris-HCI缓冲液（pH7.6)10ml30%H2O2水溶液10μl二、免疫组织化学常用液体及抗体的配制(三)显色与显色剂配制2.显色剂及其配置2）AEC显色液AEC2mg二甲基甲酰胺0.5ml0.02mol/L醋酸盐缓冲液（pH7.4)10ml30%H2O2水溶液10μl二、免疫组织化学常用液体及抗体的配制(四)背景复染及复染剂1.背景复染

免疫组织化学染色后，还必须用其他染料对切片进行复染，才能更好地观察阳性结果与周围组织细胞的关系，使免疫组织化学染色结果定位更为清晰。2.复染剂

常用的细胞核复染剂有苏木精、甲基绿和核固红三种。其中苏木精呈蓝色、甲基绿呈绿色、核固红呈红色。一般情况下，石蜡切片常用苏木精，冷冻切片常用甲基绿，而免疫金银法染色常用核固红。三、免疫组织化学常用仪器的使用方法

免疫组织化学制片所需仪器与常规病理制片基本相同，主要有显微镜、恒温箱、烤箱、冰箱、高压锅、微波炉、湿盒、切片架、冲洗瓶、微量加样器等。其中微量加样器和微波炉的使用需要特别注意。四、载玻片的防脱片处理常用的防脱片方法有以下几种：1.多聚左旋赖氨酸2.

3-氨丙基-3-乙氧基硅烷(APES)五、抗原修复抗原修复(antigenretrieval,AR)是将固定时分子之间形成的交联打开，恢复到原有空间状态，以提高组织抗原检出率。但是，并不是所有的抗体染色都需要抗原修复，不当的抗原修复会引起假阳性或者假阴性的结果。常用的抗原修复方法1.蛋白酶消化法2.热诱导的抗原修复(HIAR)第三节

免疫组织化学的常用染色方法一、免疫组织化学常用染色方法及注意事项免疫组织化学技术根据加入抗体的次数分为直接法和间接法。直接法用标记抗体与组织中的相应抗原直接结合，因为只加一次抗体，所以又叫一步法。间接法包括二步法、三步法等。（一）一步法抗体标记酶直接标记在第一抗体上，染色时，滴加第一抗体与组织细胞抗原结合，形成抗原-抗体结合物，然后加入显色剂显色。目前常用的一步法为增强聚合物（enhancedpolymeronestep，EPOS）一步法。一、免疫组织化学常用染色方法及注意事项（二）二步法抗体标记酶标记在第二抗体上，染色时，滴加第一抗体与组织细胞抗原结合，形成抗原-抗体结合物，然后加入第二抗体与第一抗体结合，把抗原-抗体结合物放大，最后加入显色剂显色。二抗上的标记酶与显色剂起反应，形成有色沉淀定位在组织细胞中。常用的二步法有LDP法、EnVision法等。一、免疫组织化学常用染色方法及注意事项（三）三步法三步法的抗体标记酶标记在第三抗体上。第二抗体标记有生物素，第三抗体为链菌素，染色时，滴加第一抗体与组织细胞抗原结合，形成抗原-抗体结合物，然后加入第二抗体与第一抗体结合，把抗原-抗体结合物放大，再加入第三抗体，三抗链菌素通过生物素与二抗连接，把一抗和二抗结合物放大，最后加入显色剂显色。三抗的标记酶与显色剂起反应，形成有色沉淀定位在组织细胞中。二、常用免疫组织化学染色方法的评价

一般来说，抗体与抗体的连接步骤少，干扰染色结果的因素少，染色特异性高，但由于没有将抗原-抗体结合物放大，所以染色敏感性低；二步法和三步法，连接抗体步骤多，能把抗原-抗体结合物进行特异性放大，因此敏感性高，但由于在放大抗原-抗体结合物过程中，影响染色结果的因素增多，因此，染色特异性相对低。三、免疫组织化学染色结果的判断原则1.HE染色的观察2.对照片结果的观察3.阳性结果定位的观察四、自动免疫组化染色机的应用

免疫组化染色过程步骤繁多，手工操作从第一张片开始滴加试剂到最后一张，很难保证每张片子的时间一样，特别是染片量大的时候。自动免疫组化染色机的应用有利于规范化和标准化操作和染色质量控制，保证染色结果的准确性，也减轻技术人员的工作负担。染色机通过连接实验室信息化管理系统可以实现科室与医院临床科室间的信息共享，这也是未来病理科室发展趋势之一。五、免疫组织化学染色质量控制1.及时取材，及时固定。固定时间一般为为4～6小时，不超过24小时。固定不足或过度固定都不利于免疫组化染色。2.石蜡切片脱蜡要彻底，脱蜡不干净会造成局灶性阳性等染色不均匀的现象，甚至染色失败。3.是否进行抗原修复以及用何种方法修复，应当参考一抗说明书和实验室预实验结果来决定。不当的抗原修复会引起假阳性或假阴性的结果，或者导致抗原定位发生改变。4.使用的二抗为HRP/鼠/兔，不需要考虑所用的一抗是鼠抗还是兔抗。五、免疫组织化学染色质量控制5.不同厂家不同批次的同一种抗体其染色效果不尽相同。6.不同试剂盒标记的酶可能不同，应根据一抗和显色剂合理选择。试剂盒配套使用的一抗所用显色剂HRP/鼠AP/鼠鼠源单克隆抗体DAB,AEC固蓝，固红，CIP/NBTHRP/兔AP/兔兔源单克隆抗体和兔源多克隆抗体DAB,AEC固蓝，固红，CIP/NBTHRP/鼠/兔AP/鼠/兔鼠源单克隆抗体，兔源单克隆抗体和兔源多克隆抗体DAB,AEC固蓝，固红，CIP/NBT五、免疫组织化学染色质量控制7.加抗体前要尽可能甩干切片上的PBS。8.滴加抗体要完全覆盖组织。9.加抗体前后均应用PBS充分浸洗切片，一般用3缸PBS。10.组织切片背景染色深的原因可能是：①第一抗体浓度太高。②抗体孵育时间过长。③抗体孵育温度过高。④DAB显色剂中DAB浓度过高或H2O2太多。⑤正常血清封闭之后、滴加第一抗体之前用了PBS洗切片。⑥抗体纯度不高。⑦抗体孵育后洗不干净。⑧内源性过氧化物酶的干扰。⑨内源性生物素的干扰。⑩在染色过程中发生干片现象。第四节

免疫组织化学在临床病理工作的应用一、肿瘤良恶性的诊断和鉴别诊断有些肿瘤单纯依靠形态学变化，很难作出确切的诊断，可结合免疫组织化学检查综合判断肿瘤的良恶性。比如滤泡型淋巴瘤与淋巴结滤泡性反应性增生，仅从形态学上很难作出正确诊断，可选用免疫球蛋白轻链k和λ进行标记，如果滤泡内的淋巴细胞单克隆表达k或λ，则提示为淋巴瘤，如果滤泡内的淋巴细胞同时表达k和λ，则提示为反应性增生。二、判断肿瘤的组织学起源

一些组织来源不明的肿瘤，可通过免疫组织化学检测，判断其组织起源。如上皮细胞膜抗原、细胞角蛋白等抗体染色为阳性，支持癌的诊断；波形蛋白抗体染色为阳性，则支持肉瘤的诊断。三、评价肿瘤细胞的增生程度和生物学行为

通过Ki-67和增殖细胞核抗原(PCNA)等抗体的免疫组织化学检查，可对肿瘤细胞增殖核抗原进行定位、定量检测，更加全面、可靠地评价肿瘤细胞的增生程度和生物学行为。Ki-67或PCNA表达越高的肿瘤，恶性程度越高，预后越差。四、指导肿瘤的临床治疗和判断疗效通过免疫组织化学方法，对肿瘤细胞内的各种激素受体进行定位、定量分析，既可指导临床治疗，也可判断肿瘤的预后及疗效。如雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)阳性的乳腺癌病人，内分泌治疗有效率较阴性者高，预后好，治愈率高，复发率低。在子宫内膜癌、子宫内膜肉瘤、输卵管腺癌和卵巢癌的研究中，发现有同样的意义。五、判断肿瘤恶性程度及预后肿瘤细胞内常有癌基因的扩增、突变等变化，这些变化通过mRNA控制肿瘤蛋白的合成水平而表达出来。如P53蛋白根据其功能的不同可分为野生型和突变型两种，其中突变型P53蛋白在人体的许多肿瘤如胃肠道肿瘤、乳腺癌、肺癌中均有表达，其表达强度随肿瘤分级的增高而增强，在癌旁组织或癌前病变中则表达较弱，在正常组织细胞中几乎没有突变型P53蛋白的表达。谢谢观看病理检验技术

电镜技术和超薄切片高职高专医学检验技术专业系列教材目

录第一节概述01第二节超薄切片技术和透射电镜02第三节扫描电镜技术03第四节电镜冷冻制片技术04第五节免疫电镜技术05第六节

电镜细胞化学技术06学习目标知识目标能力目标素质目标掌握超薄切片技术、超薄切片染色技术和制作扫描电子显微镜标本。熟悉电子显微镜冷冻抽样技术、免疫电子显微镜技术和电子显微镜细胞化学技术。了解电子显微镜种类、基本构造和成像原理，以及扫描电子显微镜的工作原理。学会制作超薄切片、独立完成扫描电子显微镜技术、电子显微镜冷冻制样技术和免疫电子显微镜技术。培养学生的团队协作和沟通能力，能够在团队中发挥积极作用并与其他成员有效协作。增强学生的创新意识和独立思考能力，能够提出新的研究思路和方法，为未来的科学研究做出贡献。第一节

概述

一、电镜的种类透射电镜：用来观察细胞内部和断裂面复型膜的平面超微结构。扫描电镜：用来观察细胞表面和断裂面的立体结构。专用电镜：用于满足特殊需要，如超高压电镜、扫描探针电镜、分析电镜、数码电镜等。二、电镜的基本组成电子光学系统：是电镜的核心组成部分，包括电子照明系统、成像系统和观察记录系统。电子照明系统产生和聚焦电子束，成像系统将电子束信息转化为可观察的图像，观察记录系统记录图像。真空系统：由机械真空泵、扩散泵和真空网门组成，与镜筒相连接，排除空气，保持真空状态，避免电子散射。电源系统：包括高压电源、透射电源、发生器、稳流器和调节控制单元，确保电源系统稳定运行。三、电镜的成像原理电镜成像原理类似光镜。电子枪发射电子，经过透镜聚焦后照射样品，与样品原子碰撞散射。散射电子能力不同，透过的电子形成明暗不同的黑白影像。电子影像通过荧光屏转变为可见图像或拍照记录。扫描电镜通过检测器收集样品表面散射电子转变为图像。第二节

超薄切片技术和透射电镜超薄切片技术基本程序：取材

→

前固定

→

漂洗

→

后固定

→

漂洗

→

脱水

→

浸透

→

包埋

→

修块

→

半薄切片

→

光镜定位

→

超薄切片

→

染色

→

电镜观察（一）组织样本超薄切片的制备（二）血液样本超薄切片的制备（三）骨髓样本超薄切片的制备（一）组织样本超薄切片的制备取材前固定漂洗后固定脱水浸透聚合切片捞片和染色在4℃下，准确取样，大小1x1x1mm左右。在0～4℃下，将待检组织块固定于2%～4%戊二醛磷酸钠缓冲液(pH值7.2～7.3）中，浸泡30～90分钟。在4℃下，将经过戊二醛固定的组织块用0.1mol/L磷酸缓冲液漂洗1小时或过夜，其间换液3次。在0～4℃下，将组织块置于四氧化锇磷酸缓冲固定液中浸泡60～120分钟。细织块依次经30%或50%、70%、90%丙酮液各10分钟，最后进入纯丙酮（更换3次，共10分钟），总计40分钟。组织块依次浸入：①纯丙酮：树脂包埋剂（1:1)，室温下1小时。②纯丙酮：树脂包埋剂（1:2），室温下2小时。③纯树脂包埋剂，室温下3小时以上或过夜。将充分浸透的组织块置入装满包埋剂的胶囊中，在37℃烤箱内聚合1小时，然后在60℃烤箱内聚合24小时。用超薄切片机先做半薄切片（1u）或薄切片（3um左右），进行光镜检查定位后再做超薄切片。用镊子夹取一个铜网，将满意的切片捞在铜网的中央，然后用2%醋酸铀和6%柠檬酸铅各染色30分钟。（二）血液样本超薄切片的制备1．取经过1%肝素或5%EDTA抗凝的静脉血2～4mL。2．每分钟1000～1500r离心10分钟。3．尽量吸除离心后的上清液，沿管壁缓慢加入2%～4%戊二醛1～2mL，进行固定。固定2～4小时，使浅黄色层凝结成块。4．取浅黄色层凝块，切成1mm3细条，然后置入缓冲液漂洗。5．按组织样本超薄切片的制备方法进行后固定、脱水和包埋（注意：应将检材细条平放包埋)。（三）骨髓样本超薄切片的制备1．取经过1%肝素或5%EDTA抗凝的骨髓穿刺物0.5～1mL。2．每分钟1000～1500r离心后取髓粒。3．2%～4%戊二醛磷酸钠缓冲固定液固定2～4小时。

按组织样本超薄切片的制备方法进行后固定、脱水和包埋。二、超薄切片染色技术（二）柠檬酸铅染色柠檬酸铅是一种染色剂，可与醋酸铀一起使用。该染色方法可以提高切片反差，使图像更清晰。常用的柠檬酸铅染色液配置方法如下：硝酸铅1.33g，枸橼酸钠1.76g，双蒸水30mL。

将溶液倒入容量瓶中，摇动30分钟后加入8mL浓度为1mol/L的NaOH溶液，加双蒸水至50mL，过滤后使用。染色时间为2～5分钟。为防止污染切片，染色过程中应避免与空气接触，可以在染色的培养皿中添加NaOH吸收CO2。（一）醋酸铀染色组织块染色：组织块经固定、脱水至70%乙醇或丙酮后，放入饱和醋酸铀溶液中染色2小时或置于4℃冰箱过夜。超薄切片染色：在清洁的培养皿中放入石蜡片，滴加染液至蜡片上。将载网贴合在切片上，放置在染液上静置10～30分钟。染色完成后，使用双蒸水彻底冲洗干净。第三节

扫描电镜技术一、扫描电镜的工作原理扫描电镜使用电子束在样品表面扫描，收集产生的次级电子，形成电信号送到显像管。电子束不穿过样品，仅在表面激发次级电子。次级电子被闪烁晶体接收，放大并用于调制显像管的电子束强度，改变荧光屏亮度。显像管的偏转线圈与样品表面的电子束同步扫描，显示样品表面形貌图像。最终在荧光屏上看到的是物体表面的立体构象。二、扫描电镜的标本制作取材样品大小一般为(3～5)mmx(1～1.5)mm清洗采用缓冲液、有机溶剂或酶消化等方法清除或清洗附着在样本表面的黏液、血液、组织液和灰尘等。固定使用戊二醛、锇酸等固定剂固定样本，固定时间为1小时脱水采用梯度乙醇或丙酮逐级脱水，从低浓度至高浓度。置换样品脱水至100%乙醇或丙酮后，再用纯丙酮进行置换，时间为15～20分钟，以促使醋酸异戊酯渗透到样本中醋酸异戊酯处理将样本浸泡在醋酸异戊酯中15～30分钟，以促使液态CO2渗透到样本中。观察将样本装入扫描电镜的样本室中进行观察喷涂将样本放置于离子溅射镀膜仪的样本台上进行金属镀膜，以使样品表面导电，有利于形成清晰的图像。排气打开排气阀门，每分钟排气1.0-1.5L，排气时间45-60分钟。步骤6-11在临界点干燥仪中进行，通过以上干燥处理，使样本保持干燥。气化将温度旋钮调至35-40℃，随着温度升高，CO2由液态变为气态，界面消失。当气压接近1.0132×10Pa，持续5分钟后，即可排气。置换在20℃下，使样本中的醋酸异戊酯与CO2充分置换。注入干冰依次打开CO2钢瓶排气阀和仪器进气阀，在0～10℃下，逐渐向样本室注入液态CO2，注入量为样本室容积的80%；关闭进气阀，停止注入。装样将样本从醋酸异戊酯中取出，并放入样本笼中，然后将样本笼放入临界干燥仪的样本室内，在0℃下预冷10～15分钟，以确保液态CO2浸入样本室第四节

电镜冷冻制片技术扫描电镜技术一、快速冷冻固定技术

使用物理方法对生物样品进行瞬间冷冻固定的技术，冷冻速率可达106℃/s。二、冷冻超薄切片技术

通过快速冷冻固定取代化学固定，省去了繁琐的脱水、浸透和包埋步骤，能够在低温下获得清晰的切片图像。三、冷冻蚀刻技术

透射电镜样品制备的一种方法，经过多年的研发与完善，在全球范围内广泛应用，为研究生物膜结构提供了重要支持。三、冷冻蚀刻技术冷冻蚀刻技术基本原理：冷冻蚀刻技术通过液氮冷冻样品，使其断裂并展现细胞器；升高温度使冰升华，暴露细胞器的膜结构；喷镀碳-铂在断裂样品表面形成复型膜，展现细胞切面的立体结构；通过透射电镜观察复型膜，可深入了解细胞内部和膜内部的结构。冷冻蚀刻技术制备方法：取材

前固定

清洗

冷冻保护

冷冻固定

断裂

蚀刻

喷镀

腐蚀

捞膜

电镜观察第五节

免疫电镜技术免疫电镜技术—、免疫铁蛋白技术二、免疫胶体金标记技术(一）包埋后染色法（二）包埋前染色法三、免疫电镜技术应注意的问题免疫铁蛋白技术是一项由Singer于1959年首创的技术；最早开展的一种免疫技术；由于其应用的局限性，目前已逐渐被免疫胶体金技术所取代。免疫电镜技术—、免疫铁蛋白技术二、免疫胶体金标记技术(一）包埋后染色法（二）包埋前染色法三、免疫电镜技术应注意的问题1.标本用PBS洗涤两次后，用0.5%戊二醛和2%多聚甲醛室温固定30～60分钟。2.PBS漂洗5次，每次20分钟。3.用0.1mol/L甘氨酸漂洗组织5分钟，灭活自由醛基。4.用0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液或PBS漂洗组织后，室温下用1%～2%锇酸后固定1小时。5.脱水、包埋。6.超薄切片厚度在50～70nm，捞在镍网上。7.置1%H2O2内10分钟～1小时(视树脂的硬度和切片的厚度而定）。操作时，滴入1%H2O2液1滴于蜡板上，将网的载片面轻浮于液滴上。8.去离子双蒸水洗3～5次。9.切片用5%正常羊血清孵育15分钟。10.用无钙镁DulbeccoPBS漂洗切片5次。11.孵育于一抗血清滴上，室温1～2小时。12.PBS漂洗5次。13.室温下用适当稀释的胶体金探针孵育30分钟。14.PBS漂洗5次。15.用去离子双蒸水洗净。16.用醋酸铀硝酸铅染色后双蒸水洗净。17.电镜观察。18.对照组可省略一抗或用正常血清、无关抗体代替一抗。免疫电镜技术—、免疫铁蛋白技术二、免疫胶体金标记技术(一）包埋后染色法（二）包埋前染色法1.细胞表面抗原标记法（间接法）2.细胞表面抗原标记法（直接法)三、免疫电镜技术应注意的问题（1）细胞用PBS洗2次后，用0.5%戊二醛和2%多聚甲醛室温固定30～60分钟。（2）PBS漂洗3～5次，每次20分钟。（3）用0.1mol/L甘氨酸漂洗组织5分钟，灭活自由醛基。（4）用无钙镁DulbeccoPBS漂洗细胞15分钟，以阻断对一抗的非特异性结合。（5）室温下用适当稀释的第一抗体孵育细胞1～2小时后，用无钙镁DulbeccoPBS漂洗细胞5次，每次5分钟，以洗去未结合的一抗。（6）用适当稀释的胶体金探针在室温下孵育30分钟。（7）用无钙镁DulbeccoPBS漂洗细胞5次，每次5分钟。（8）用2%戊二醛+2%多聚甲醛室温下再次固定细胞1小时。（9）用0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液漂洗，1%锇酸后固定，常规脱水、包埋、超薄切片铀铅染色后透射电镜下观察。(10）对照组可省略一抗或用正常血清、无关抗体代替一抗。免疫电镜技术—、免疫铁蛋白技术二、免疫胶体金标记技术(一）包埋后染色法（二）包埋前染色法

1.细胞表面抗原标记法（间接法）

2.细胞表面抗原标记法（直接法)三、免疫电镜技术应注意的问题（1）按间接法步骤（1）～（4）操作。（2）用适当稀释的一抗-胶体金复合物在室温下孵育细胞1小时。（3）按间接法步骤（7）～（10）操作。免疫电镜技术—、免疫铁蛋白技术二、免疫胶体金标记技术(一）包埋后染色法（二）包埋前染色法1.细胞表面抗原标记法（间接法）2.细胞表面抗原标记法（直接法)三、免疫电镜技术应注意的问题1.处理生物样品时，需同时关注微细结构和抗原活性的保存。固定液可能影响抗原活性，H2O2可能对微细结构造成损伤。在选择固定液和处理方法时需权衡。2.免疫染色实验中，清洗工作必须彻底，建议使用塑料水壶搭配锥形喷水头进行冲洗，喷洗方向与镍网面平行。用滤纸吸干残留水滴时，小心不要触碰到载网本身，可使用剪成三角形的滤纸尖端吸干水分。操作过程中需使用双蒸水，并确保容器专用。第六节

电镜细胞化学技术免疫电镜技术一、基本原理二、基本要求三、基本步骤基本原理电镜细胞化学技术通过化学反应在细胞内形成金属沉淀物；在电镜下观察和分析，以定位和鉴定细胞内的物质；了解细胞的超微结构和功能。免疫电镜技术一、基本原理二、基本要求三、基本步骤基本要求切片中的样品需保持细胞的超微结构和酶的活性，以确保结果的准确性。为确保观察的顺利进行，反应产物需在原位保持稳定。对反应物的特异性进行分析，有助于明确酶的特异性，为实验提供有力依据。免疫电镜技术一、基本原理二、基本要求三、基本步骤基本步骤取材：将组织切成1mmx1mmx2mm的小块。前固定：用2%戊二醛（二甲砷酸钠缓冲液)，pH值7.2～7.4。漂洗：0.01mol/L二甲砷酸钠缓冲液，PH值7.4，4℃，2小时或过夜。预切片：震荡切片，厚度20～40um。预孵：将切片浸入无底物的孵育液中，20℃，18～24小时。孵育；将切片置入孵育液中，在恒温水浴箱中孵育。孵育的温度和时间需根据不同的反应来确定。漂洗：用与孵育液中相同的缓冲液洗2～3次，每次5分钟，再用0.01mol/L二甲砷酸钠缓冲液漂洗2～3次，4℃。后固定：用1%锇酸，4℃，1小时。脱水、包埋、切片和染色：均同常规超薄切片法。电镜观察。谢谢观看

病理检验技术

病理检验前沿技术高职高专医学检验技术专业系列教材目

录第一节

分子病理学技术01第二节组织芯片技术02学习目标知识目标能力目标素质目标掌握原位核酸分子杂交的基本原理；熟悉分子病理学技术的操作步骤；了解组织芯片技术的应用。能运用病理检验前沿技术进行科学研究；能熟练进行分子病理学技术常规操作。培养严格遵守规范操作的职业精神；培养临床思维能力及科学严谨的学习态度。第一节

分子病理学技术一、原位核酸分子杂交（一）基本原理

在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知DNA或RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则(A=T，A=U，C=G)，将探针（含放射性或非放射性的外源性核酸)与染色体、细胞或组织上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经过一定的检测手段将待测核酸在染色体、细胞或组织上的位置显示出来。一、原位核酸分子杂交（二）原位核酸分子杂交技术的材料和步骤1.材料：冰冻切片、石蜡切片、细胞涂片或贴片2.步骤：（1）杂交前（2）杂交（3）杂交后二、原位聚合酶链反应技术

（一）原位聚合酶链反应技术基本原理

聚合酶链反应在体外对DNA特定序列进行高效快速扩增的一项新技术，经过高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环，将细胞核内的双股DNA经过加热变性形成两条单链的DNA链，可以成百万倍地特异性扩增某一DNA片段，其反应过程类似于体内的DNA半保留复制过程。

原位聚合酶链反应技术是PCR和原位杂交两种技术原理的综合，根据检测信号的不同，可分为直接法和间接法两种。

二、原位聚合酶链反应技术（二）原位聚合酶链反应技术基本步骤

包含：标本制备、预处理、反转录反应(检测mRNA要做此步)、扩增、扩增后处理及原位检测。三、DNA序列测定DNA序列测定也称DNA测序技术，即分析特定DNA片段的碱基序列的排列顺序，可进一步研究或改造目的片段。测序的目的是确定重组DNA的方向与结构，其广泛应用于肿瘤诊断、生物技术、法医生物学等领域，已成为不可缺少的技术，极大地推动了生物学和医学的研究和发现。

根据出现时间的顺序不同及测序方案的不同，目前DNA测序技术大致可分为一代测序(Sanger测序)、二代测序及三代测序。第二节

组织芯片技术

（一）概述

组织芯片技术又称“组织微阵列（tissuemicroarray，TMA）技术”，是以形态学为基础的分子生物学新技术，通过微加工和微电子等微缩技术，将大量生物检测相关的材料依靠生物分子间的特异性相互作用、整齐有序的集成于同一张芯片表面，建立一个微型的生化分析系统，从而实现对基因、蛋白质等生物分子准确、快速、高通量的检测。

（二）制备组织芯片蜡块的常用设备

主要包含：组织阵列仪、电热恒温箱、-20℃及4℃冰箱、医用高压锅、医用烤箱、电子分析天平、光学倒置显微镜、小型高速离心机、全自动组织脱水机、全自动石蜡组织包埋机、石蜡切片机、摊片烤片机。（三）制备组织芯片蜡块的工作步骤

组织芯片制作的基本步骤包括：蜡块的制备及选取、提取组织芯片、构建阵列及数据库、组织芯片的裱片等。（四）组织芯片技术的应用

组织芯片技术不论是在人类基因组的研究方面，还是在人类疾病的基础研究、临床病理的研究与诊断、药物的筛选、癌基因的寻找，乃至肿瘤发生、发展及预后相关的生物分子标记物的确定，甚至整个生命科学的基础研究、应用研究领域都得到广泛的应用。（五）组织芯片技术的优缺点优点：疾病研究、药物研发及个体化用药方案制订等具有重大意义；

缺点：受到技术设备、操作、费用等因素的限制，目前组织芯片尚难以走出实验室。

谢谢观看病理检验技术

远程病理诊断高职高专医学检验技术专业系列教材目

录第一节

概述01第二节远程病理诊断系统02第三节远程病理诊断数据和图像的采集、处理与传送03学习目标知识目标能力目标素质目标掌握远程病理诊断的概念；熟悉远程病理诊断系统的基本设施；了解远程病理诊断系统中图像的采集、处理和传送。能熟练运用远程病理诊断系统进行图像的采集、处理和传送。培养刻苦严谨、求真务实、坚持真理的职业精神；培养严谨认真的工作态度。第一节

概述一、远程病理诊断的概念

远程病理诊断是利用计算机及通信网络技术在相距遥远的两个或两个以上的地域，通过病理学数据和图像信