免扩增式核酸检测在分子诊断中的发展与应用

免扩增式核酸检测在分子诊断中的发展与应用【摘要】免扩增式核酸检测（AFNAD）是一种无需扩增即可检测样本中核酸的高灵敏度分析方法。本文阐述三类AFNAD技术：单分子检测技术、基于酶促反应的检测技术和基于杂交捕获的检测技术，重点阐述各技术的性能特点及在感染性疾病的快速诊断、肿瘤性疾病的精准医疗、遗传性疾病早期筛查和公共卫生突发事件的现场即时检测等领域的应用。通过系统对比现有技术的优势与局限性，并展望其未来发展趋势，本文旨在为开发更快速、灵敏、低污染的核酸检测技术提供理论依据与实践指导。【关键词】免扩增式核酸检测；成簇规则间隔短回文重复序列及相关基因编码的系统；分子诊断；公共卫生一、免扩增式核酸检测概述AFNAD早期的研究主要集中在利用酶促反应和分子探针实现目标核酸的直接检测［34］，在灵敏度和特异性方面取得显著进展，但操作繁琐、成本高昂的问题限制其广泛应用。随着研究的深入，分子诊断急需一种更高效，特异的检测技术。成簇规则间隔短回文重复序列及相关基因编码的系统（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsandassociatedproteins，CRISPRCas）作为原核生物一种适应性免疫防御系统，存在于大多数细菌与古细菌中，起防御或消灭外来核酸入侵的作用［5］。2016年，Pardee等首次提出RNA等温扩增与CRISPRCas9联用技术，3h内鉴别美洲型和非洲型寨卡病毒，展示了该系统在核酸检测中的应用潜力［6］。利用CRISPRCas对靶核酸特异性识别与切割特性，研究人员开发了新一代AFNAD，这一技术的出现，标志着核酸检测模式从传统依赖扩增，向更高效、更特异的免扩增模式的跨越，为分子诊断领域带来了革命性突破，被誉为下一代分子诊断技术［7］。AFNAD直接检测目标核酸，或借助信号转换、信号放大机制，实现快速、灵敏、特异性检测。在多个医学与公共卫生领域得到广泛应用，如感染性疾病的快速诊断［8］、肿瘤性疾病的精准医疗［9］、遗传性疾病的早期筛查与诊断［10］、公共卫生突发事件的现场即时检测（pointofcaretesting，POCT）等［11］，展现出巨大的应用潜力和前景。本文通过系统综述AFNAD的分类、应用场景、技术发展前沿等，深入探讨该技术面临的挑战，并提出针对性解决方案，以期为后续相关研究及实践提供理论依据与参考。二、免扩增式核酸检测的技术分类AFNAD依据检测原理的不同分为：单分子检测技术、基于酶促反应的检测技术和基于杂交捕获的检测技术。（一）单分子检测技术单分子检测是无需核酸扩增，直接解析核酸分子的序列、电荷、构象等固有特性，实现单分子级检测的技术［12］。核心技术包括固态纳米孔传感器（solidstatenanoporesensors，ssNPs）、单分子测序（singlemoleculesequencing）和原子力显微镜（atomicforcemicroscope，AFM）。ssNPs利用DNA穿越纳米孔时电/光信号变化实现单分子检测［13］；单分子测序无需PCR扩增实现单个核酸分子的测序检测［14］；AFM通过纳米级探针直接扫描“观测”核酸分子形貌实现分子形貌可视化［15］。Pal等［16］使用ssNPs结合机器学习实现线粒体DNA（mitochondrialDNA，mtDNA）pmol/L级检测。OxfordNanoporeTechnologies公司开发的MinION平台是单分子检测技术商业化测序的代表，解析核酸易位引发的离子电流指纹信号实现序列测定，对结核分枝杆菌（mycobacteriumtuberculosis，MTB）耐药突变的检测符合率100%，阳性结果与传统测序一致性98%［17］。美国PacificBiosciences公司开发的单分子实时（singlemoleculerealtime，SMRT）测序用于遗传复杂变异类型病的基因检测，在地中海贫血的防控中作用日益广泛［18］。AFM作为一种单分子检测技术，已成为在单分子水平研究生物相互作用的有力工具［15］。Shim等［19］开发的基于AFM的低丰度甲基胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸（cytosineguaninedinucleotide，CpG）DNA定量检测方法（图1），检测限低至1amol/L。（二）基于酶促反应的检测技术基于酶促反应的检测是利用CRISPRCas、Argonaute、核酸内切酶、DNAzyme、变构酶或类酶活性物质等，特异性识别靶核酸并激活催化功能，通过切割报告探针产生放大信号的技术［2023］。CRISPRCas凭借卓越的可编程性、高灵敏度、高保真度、单碱基分辨率、精准核酸定位能力［24］，在AFNAD领域获得到广泛应用。其检测主要依赖于Cas蛋白在成簇规律间隔短回文重复序列RNA（crRNA）的引导下对目标核酸序列的特异性识别与切割。当存在靶序列时，crRNA能够精准定位并结合目标核酸，从而激活Casx蛋白的内切酶活性，在特定位点完成切割。此外，Ⅱ型CRISPR效应蛋白（如Cas12、Cas13和Cas14）除具有特异性切割功能外，还表现出独特的反式切割活性［25］，在完成靶序列切割后，这些蛋白能够非选择性地降解体系中游离的单链DNA（singlestrandedDNA，ssDNA）或单链RNA（singlestrandedRNA，ssRNA），这一特性为信号放大提供了分子基础。基于酶促反应的检测技术核心应用策略分为4个方面：微量化反应体系提升靶核酸浓度：受空间限制效应启发，CRISPRCas通过微缩反应体系提升单位体积的靶标核酸浓度，实现高灵敏检测。Shan等［26］开发液滴微流控Cas13a技术（图2），在数千个30微升级的单分散液滴，30min内可检测低至470amol/L的新型冠状病毒（severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2，SARSCoV2）。Xue等［27］开发多分散液滴数字CRISPRCas，在皮升级多分散液滴中，通过Cas12a和Cas13a实现了人乳头瘤病毒（humanpapillomavirus，HPV）18亚型和SARSCoV2的检测，检测限分别低至100amol/L和10amol/L，较传统方法提升3000~10000倍。Wang等［28］用磁珠捕获浓缩靶标，融合CRISPR/Cas13a与微阵列技术，开发单分子数字检测系统。在飞升级微孔中，50min内完成SARSCoV2检测，检测限2amol/L。该系统无需样本预处理，大幅缩短检测时长，极大提高了检测的灵敏度与特异性，灵活应用于各类RNA分子的检测。Liu等［29］应用该体系，1h内便检测出甲型流感病毒，检测限为10拷贝/μl。2.多酶协同形成大量报告分子，信号级联放大：组合多种Cas蛋白与crRNA，或与PyrococcusfuriosusArgonaute蛋白（PfAgo）、核酸内切酶1等联合使用，显著提升灵敏度［2］。Tian等［30］开发横向流动分析（lateralflowassay，LFA）平台，串联Cas12a和Cas13a，实现微小核糖核酸21（miRNA21）pmol/L级的便携式监测，灵敏度比单用Cas13a提高266倍。Chen等［31］利用双茎环DNA增强CRISPRCasΦ对荧光基团与淬灭基团之间寡核苷酸接头的非特异性酶切作用，通过“茎环切割CasΦ激活荧光恢复”循环实现信号放大，检测限0.11拷贝/μl，40min完成血清中1.2CFU/mL病原菌检测。Hu等［32］开发NAPTUNE（nucleicacidsandproteinbiomarkerstestingviaultrasensitivenucleasesescalation）平台，通过核酸内切酶1和PfAgo的协同作用，45min内实现单管amol/L级核酸的检测。该方法不仅开创了生成Argonaute蛋白DNA向导的全新路径，更推动了核酸检测技术的多元化发展。3.改良或整合电化学传感器，提高检测灵敏度：靶标诱导Cas蛋白活性变化，通过电极表面的生物功能化界面，转化为可检测的电化学信号。一方面，基于生物亲和性结合的电化学传感，通过靶标诱导的Cas蛋白与电极表面探针特异性结合引发界面电子传递阻抗变化。另一方面，基于切割活性的电化学传感，利用Cas蛋白对电极修饰核酸探针的切割作用，促使标记在探针上的电化学活性物质脱落或电极表面性质改变，实现信号放大。基于生物亲和性结合活性，Zheng等［33］将表面等离子体共振（surfaceplasmonresonance，SPR）芯片和CRISPR/dCas9偶联，分析仅具有三碱基突变的重组质粒，检测限低至1.3fmol/L。Sun等［34］将石墨烯场效应晶体管（graphenebasedfieldeffecttransistors，GFETs）和CRISPRCas10结合，开发CRISPRGFETRNA检测平台，优化条件下，对中等长度的RNA和miRNA检测限分别低至214和427amol/L。基于切割特性，Dai等［35］通过提升催化活性，构建球形前间隔序列相邻基序（peptidylglycineαamidatingmonooxygenase，PAM）触角增强型CRISPRCas12a，实现MTB亚fmol/L级检测。Wang等［36］将表面增强拉曼散射与CRISPR/Cas12a偶联，开发非洲猪瘟病毒的AFNAD。利用无限反式切割及磁性诱导探针聚集两种策略增强信号，提升灵敏度至fmol/L级，检测范围覆盖100nmol/L至10fmol/L，无需扩增，适用于现场快速检测。设计新型信号报告物，提升信号输出效率：设计新型信号报告物、优化报告物结构、使用高转换效率的酶或材料、构建多维度信号放大界面，均可提升信号输出效率。Zhang等［37］开发的升级版SCas12a（SCas12aV2），通过优化支架RNA长度、靶向不对称结构、引入杂交激活剂，克服空间位阻，实现对高度结构化RNA分子精准检测。混合激活剂的检测限246amol/L，单位点靶向检测限10pmol/L，同时对单核苷酸多态性具有高度特异性识别能力。Zhang等［38］将CRISPR/AsCas12a与改良的电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）生物传感器结合，开发具核梭杆菌检测平台。该平台由与淬灭剂偶联的四面体DNA纳米结构探针，和经发光剂功能化的珊瑚状金构建而成。ECL生物传感器线性范围10fmol/L至100nmol/L，可检测1CFU/ml的具核梭杆菌。通过设计特异性的crRNA，该方法可灵活适配其他细菌或生物标志物检测，助力多种疾病的诊断。4种策略技术性能比对见表1。（三）基于杂交捕获的检测技术基于杂交捕获的检测，利用核酸分子间互补配对原理，通过设计特定的捕获探针与目标核酸分子进行杂交，将目标核酸从复杂样本中分离出来并检测［39］。当其与纳米材料（如金纳米颗粒）或光学技术（如暗场成像）等结合时，通过信号放大，展现出广泛的应用前景。Lin等［40］构建了两种寡核苷酸修饰的中空钯钌纳米笼（PdRu捕获探针）（图3），应用双侧横向流检测法对HPV16和HPV18基因分型检测。该方法的创新在于赋予PdRu捕获探针双重功能，既能通过纳米材料的固有特性输出信号，又能通过寡核苷酸序列与目标核酸特异性杂交。优化条件下，HPV16和HPV18的检测限分别是0.93nmol/L和0.19nmol/L，具有操作简便与高灵敏度的优势。针对杂交捕获反应灵敏度不足的劣势，Mčala等［41］利用新型转移技术，通过2次杂交捕获上转换纳米颗粒标记的混合物，将短核酸检测灵敏度提升至amol/L级。Liu等［42］开发双相夹心杂交暗场单粒子等离子体成像技术，直接检测髓母细胞瘤患者血清中异常表达的miRNA，2h内完成fmol/L级浓度定量，并精准区分单碱基错配。该技术对不同序列和二级结构的miRNA具有通用性，有望推动颅内恶性肿瘤液体活检技术发展。三类AFNAD在灵敏度、通量、操作复杂性、成本、是否适用于POCT等方面存在差异。见表2。三、应用场景（一）感染性疾病：快速诊断与现场防控AFNAD直接检测标本中的病毒，显著提升了病毒感染的诊断效率，满足突发疫情中病毒的快速检测和资源匮乏地区便携使用。Zhou等［43］开发的基于M13mp18纳米支架信号放大技术的横向流层析试纸，20min内目视检测甲型流感病毒，检测限为1pmol/L。Hang等［44］开发的CRISPR/Cas13a和DNA滚轮技术在40min内实现埃博拉病毒最低291amol/L的检测，方便、快捷且无交叉污染。部分病毒检测性能见表3。AFNAD以其高灵敏度，广泛运用于细菌感染的检测［52］。针对MTB检测周期长，Wang等［53］借助Cas12aGFETs传感器，30min内从56个血清样本中区分出5个阳性标本，检测限2.42amol/L。Lim等［54］开发的CRISPRCascade，整合正反馈回路，突破检测场地限制，无需扩增即可检测amol/L级致病菌DNA。成功应用于POCT诊断血液中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乙肝病毒等。Bao等［55］基于CRISPRCas12a的时间分辨荧光免疫层析法，实现耐药沙门氏菌的“一锅法”检测。不依赖特别设备30min内完成检测限84CFU/mL的检测。联合多种技术，有效地解决了临床细菌快速检测和耐药菌有效鉴定的难题。（二）肿瘤性疾病AFNAD凭借其快速、精准的特性，能够敏锐捕捉与肿瘤发生发展密切相关的基因突变位点及相关分子标志物，在肿瘤早期诊断、临床分期、疗效动态评估及个体化治疗方案制定中发挥着重要作用。Sun等［34］研发的CRISPRGFETs传感器，在miRNA筛查中检测限amol/L级，1h内区分健康个体和乳腺癌患者。Masterson等［56］研发的纳米等离子体传感器，从未处理微量血浆中检测miRNA10b、miRNAlet7a，检测限amol/L级。其单指标区分胰腺导管腺癌（Pancreaticductaladenocarcinoma，PDAC）与慢性胰腺炎的敏感度和特异度均大于94%，助力PDAC的早期诊断。联合检测区分PDAC早期与晚期阶段的敏感度91%，特异度87%。Chen等［57］构建CRISPRCas12a和分裂crRNA组成的系统，实现宫颈癌患者血浆中miR21amol/L级检测，有效监测肿瘤进展。Zhao等［58］利用CRISPRCas12a反式切割活性，通过底物介导的纳米金双锥体蚀刻反应产生鲜明颜色变化，检测乳腺癌1基因，60min内实现30pmol/L的检测限，为优化乳腺癌1基因突变患者多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂治疗方案提供了新策略。（三）遗传性疾病检测碱基序列，可以识别遗传疾病、监测其基因表达。Ngo等［10］开发的基于光纤粒子等离子体共振（fiberopticparticleplasmonresonance，FOPPR）传感器的免扩增光纤纳米金连接吸附法，检测限100amol/L。通过测定血液样本游离基因组DNA中突变DNA与正常DNA比率，有望为胎儿β地中海贫血提供无创诊断方案。Xu等［59］将CRISPRCas9和纳米孔测序结合，检测家族性高胆固醇血症（familialhypercholesterolemia，FH）基因，提升了FH的诊断效率。Zheng等［33］开发的CRISPRCas9SPR芯片（CRISPRSPRChip），检测杜氏肌营养不良患者基因突变重组质粒，检测限1.3fmol/L，辅助了杜氏肌营养不良的诊断。（四）公共卫生和现场检测公共卫生安全涵盖食品、水质、环境致病菌检测等关键领域。现场检测是公共卫生防控的重要手段，使用便携化技术（如生物传感器、快速检测设备），应用“快速采样、现场分析”的工作模式，既能为食品安全监管、饮用水质监测提供实时数据支撑，又能在传染病疫情、食物中毒等突发公共卫生事件中快速响应。Tang等［60］开发CRISPR/Cas12a双酶机制3D打印传感装置，通过可视化信号变化，检测限10pmol/L。配套装置集成试剂与手机分析配件，操作简便，可视检测限100amol/L。虽集成后灵敏度略有下降，但凭借其便携性，有望用于临床诊断、公共卫生监测、环境检测、食品安全管控等领域实现现场快速检测。环境致病菌需简便、灵敏且无污染的定量检测方法。Han等［61］研发的便携式空气置换增强倏逝波荧光纤维嵌入微流体生物芯片，融合CRISPR/Cas12a微流控技术，无需扩增超灵敏检测大肠杆菌O157：H7，灵敏度达PCR级别（176CFU/ml），和张等［62］报道的灵敏度相当。该技术通用性强，可拓展检测其他致病菌；并能直接应用于地表水和废水样本，为水环境细菌污染的高频监测与预警提供了有效工具。四、面临的挑战和未来研究方向（一）面临的挑战1.单分子检测技术：仪器设备昂贵、需要专业的实验室和技术人员、环境要求高、不适用POCT场景。ssNPs存在控速与信号精度不足、复杂样本背景干扰及纳米孔堵塞［63］、碱基判读误差等问题。单分子测序信号弱易受噪声干扰，复杂样本背景核酸影响检测，化学反应偏差、碱基识别分辨率低、检测通量有限，且原始数据量大，对分析人员要求高。原子力显微镜检测通量低，单个或少数分子检测，自动化程度不足，操作维护依赖专业人员，对环境温湿度要求苛刻。2.基于酶促反应的检测技术：Cas蛋白特性局限，受PAM依赖性、反应温度范围窄、分子量大等因素影响灵敏度；脱靶效应引发非特异性反式切割，产生背景噪声。多重检测与标准化难题，CRISPR/Cas多重检测面临信号串扰、通道限制等［64］问题，多数仅支持单目标核酸检测。POCT场景中，反应体系、温度控制、抑制物污染等多因素易导致检测结果波动，缺乏统一标准。一体化与现场部署不足，难以实现高效一体化检测，现场应用适配性有待提升。3.基于杂交捕获的检测技术：检测灵敏度不足，低丰度靶标核酸难以检出；特异性欠佳，复杂背景下易发生交叉反应；难以兼顾高、低丰度核酸检测需求；操作流程繁琐，需对标本进行预处理。4.标准化流程和质量控制体系：除上述特性问题外，还面临标准化流程缺失，全流程质量控体系不完善的共性问题。缺乏统一的标本采集、运输、保存等标准操作规程；人员操作规范性差异大；不同品牌仪器性能、精度不同，数据缺乏可比性；试剂纯度、活性存在批次与品牌差异，自制试剂进一步加剧结果波动；数据处理方法与分析标准不统一，影响结果解读和准确性等。（二）未来研究方向1.单分子检测技术：ssNPs通过孔道功能化修饰调控核酸过孔速度，改进固态膜制造工艺降低背景噪声，开发便捷高效的样本前处理方法。单分子测序建立成熟样本处理技术，开发新型纳米材料与精密加工技术，借助人工智能构建一体化数据分析系统，推动与CRISPRCas9等技术整合，适配小型实验室应用［59］。AFM采用阵列式探针实现多通道并行检测，研发智能化、自动化设备简化操作，开发环境控制模块稳定检测条件。2.基于酶促反应的检测技术：优化Cas蛋白性能，挖掘新型Cas蛋白或定向改造现有蛋白，突破PAM限制，拓宽温度适应性，结合FRET等技术降低背景干扰。突破多重检测与标准化瓶颈，解决CRISPR/Cas多重检测的信号串扰等问题，建立全流程质量控制体系，推动官方标准化规范出台。强化技术集成，深度融合LFA、微流控、生物芯片、手机终端等技术，实现一体化检测与高效现场部署。将CRISPRCas与微流控器件相结合，开发出新的检测方法，实现快速响应、高灵敏度、低成本、自动化集成和现场化等目标［65］。3.基于杂交捕获的检测技术：通过跨平台技术集成（如结合微流控实现样本富集）、新材料应用（如纳米磁珠优化杂交效率），提升检测灵敏度与特异性，简化操作流程，借助液态芯片［66］等技术实现多重检测。Tian等［67］开发的固相提取和增强检测分析平台（SPEEDiCRISPR），将靶标识别、序列特异性富集和信号生成三重功能进行整合，实现了检测限从pmol/L到fmol/L的覆盖。同时还能够和两种床旁检测策略结合，基于智能手机的荧光检测器和LFA检测，为现场快速检测提供了高效解决方案。4.标准化流程和质量控制体系：目前，国内外尚未建立AFNAD用于临床检验的标准化流程和质量控制体系。尽管相关专家共识［68］为其临床实践提供参考，我们仍需完善全流程质量控制。制定相关标本采集、运送、保存程序；加强人员培训，统一操作规范；改进仪器制造工艺，建立校准维护体系与标准化比对机制；完善试剂质量控制标准与验收制度，开发长效稳定易保存试剂；构建标准化数据处理流程，借助人工智能研发专业分析软件，提高结果准确性与一致性。五、结语综上所述，AFNAD具有快速响应、操作简捷、低污染风险及高效能等优势，在感染性疾病快速诊断、肿瘤精准医疗、遗传性疾病筛查及公共卫生现场检测等领域展现出巨大潜力。从CRISPRCas的靶向切割能力与微流控芯片的集成创新，到纳米等离子体传感器对amol/L级生物标志物的捕获，再到便携式生物检测装置与智能手机终端的联合应用，该技术通过跨学科融合突破了传统检测的灵敏度与场景限制。尽管当前技术仍面临多重检测体系能力不足、复杂样本背景干扰、标准化流程缺失等挑战，但随着新型Cas蛋白的不断挖掘、纳米材料应用、信号放大技术的成熟及人工智能对检测数据的深度解析，AFNAD正加速向高灵敏度、多靶标同步分析、全流程自动化的方向发展。随着标准化指南的制定与POCT设备普及，该技术有望变革临床诊断与公共卫生监测的模式，推动精准医学与大健康产业发展。参考文献[1]PaulR,OstermannE,WeiQ.Advancesinpoint-of-carenucleicacidextractiontechnologiesforrapiddiagnosisofhumanandplantdiseases[J].BiosensBioelectron,2020,169:112592.DOI:10.1016/j.bios.2020.112592.[2]LauCH,HuangS,ZhuH.Amplification-freenucleicacidsdetectionwithnext-generationCRISPR/dxsystems[J].CritRevBiotechnol,2025,45(4):859-886.DOI:10.1080/07388551.2024.2399560.[3]LamtureJB,BeattieKL,BurkeBE,etal.Directdetectionofnucleicacidhybridizationonthesurfaceofachargecoupleddevice[J].NucleicAcidsRes,1994,22(11):2121-2125.DOI:10.1093/nar/22.11.2121.[4]LiS,SpearRN,AndrewsJH.QuantitativefluorescenceinsituhybridizationofAureobasidiumpullulansonmicroscopeslidesandleafsurfaces[J].ApplEnvironMicrobiol,1997,63(8):3261-3267.DOI:10.1128/aem.63.8.3261-3267.1997.[5]BarrangouR,MarraffiniLA.CRISPR-Cassystems:Prokaryotesupgradetoadaptiveimmunity[J].MolCell,2014,54(2):234-244.DOI:10.1016/j.molcel.2014.03.011.[6]PardeeK,GreenAA,TakahashiMK,etal.Rapid,Low-CostDetectionofZikaVirusUsingProgrammableBiomolecularComponents[J].Cell,2016,165(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