Bio-RadQX200实验操作的指南

一、实验前准备：细节决定成败在开启任何实验之前，充分的准备工作是确保实验顺利进行的基石。这不仅包括对仪器状态的确认，也涵盖了试剂、耗材的准备与检查。1.1实验环境与个人防护确保实验台面洁净、整洁，无无关物品。操作前需用75%乙醇擦拭台面及移液器等工具。根据实验需求，佩戴合适的个人防护装备，如一次性手套、实验服，必要时佩戴护目镜。保持生物安全柜或超净台运行正常，营造一个洁净的操作环境。1.2试剂的准备与检查文章作者提醒您，务必仔细阅读所用数字PCR试剂（如探针法或EvaGreen法）的说明书，了解其储存条件、有效期及复溶方法。取出所需试剂，平衡至室温（通常为15-25℃）。检查试剂是否有浑浊、沉淀或颜色异常，若发现异常应立即更换。对于需要分装的试剂，应按照说明书进行，避免反复冻融对试剂活性造成影响。1.3仪器与耗材检查开机前，检查QX200dropletgenerator（液滴生成仪）和QX200dropletreader（液滴读取仪）是否连接正常，电源是否稳定。确认仪器内部无残留液滴或污染物，必要时进行清洁。准备好适配的ddPCR™96孔板、橡胶垫、箔片密封膜以及专用的液滴生成卡和吸头。吸头应无RNase、DNase污染，建议使用带滤芯吸头以避免交叉污染。二、实验操作流程：规范操作是核心2.1反应体系的制备这是实验的关键步骤，精确的移液操作至关重要。*模板准备：根据实验设计，提取并纯化所需的核酸模板（DNA或RNA，若为RNA则需先进行逆转录）。确保模板浓度和纯度符合实验要求，避免抑制剂的存在。*混合反应体系：在冰上按照试剂说明书推荐的比例，依次加入ddPCR™Supermix（根据探针或EvaGreen选择对应类型）、引物、探针（若为探针法）、模板DNA以及无核酸酶水。注意，总反应体积需严格按照试剂说明和后续液滴生成的要求进行（通常每反应为20μL或10μL）。*轻柔混匀：使用移液器轻轻吹打混匀反应体系，避免产生气泡。切勿剧烈震荡，以免导致引物二聚体形成或模板降解。*短暂离心：将混合好的反应管进行短暂离心（如几秒钟），使管壁和管盖的液体沉降至管底，确保反应体系均一。2.2液滴生成（DropletGeneration）QX200系统通过微流控技术将反应体系分割成数千个纳升级液滴，这一步是数字PCR的特色所在。*放置液滴生成卡：打开dropletgenerator，将新的ddPCR™液滴生成卡平稳放置于卡槽内，注意卡的方向。*加样：使用多通道移液器，将制备好的20μL（或按试剂要求）反应混合液小心加入到液滴生成卡的样品孔（SampleWells）中。注意避免产生气泡，若有气泡，可轻轻敲击卡片边缘尝试去除，或更换新卡。*添加油相：在液滴生成卡的油相孔（OilWells）中加入指定体积的ddPCR™液滴生成油。*运行液滴生成程序：盖好液滴生成仪的盖子，按照仪器操作界面的提示启动液滴生成程序。此过程通常需要一定时间，请耐心等待。生成完成后，仪器会有提示。*转移液滴：使用专用的8通道移液器（设置为40μL或按实际生成液滴体积），将生成好的液滴从液滴生成卡的收集孔（CollectionWells）小心转移至ddPCR™96孔板的对应孔中。操作时动作要轻柔、缓慢，避免液滴破裂。2.396孔板密封与PCR扩增*密封：将橡胶垫或箔片密封膜覆盖在96孔板上，确保每个孔都被完全覆盖。使用热封仪按照推荐的温度和时间参数进行密封。密封质量直接影响后续PCR扩增，务必确保密封完好，无泄漏。对于箔片密封膜，通常需要较高温度（如180℃左右，具体参照仪器和膜的说明）进行热封。*离心去气泡：将密封好的96孔板进行短暂的低速离心（如1000rpm，1分钟左右），目的是去除可能残留在孔内的气泡，并使液滴沉降至孔底。*PCR扩增设置：打开C1000Touch™PCR仪（或其他兼容的PCR仪），将96孔板放入样品槽。根据实验设计和试剂要求，设置PCR循环参数，包括预变性温度和时间、变性-退火-延伸的温度、时间及循环数，以及最后的保温步骤。特别注意，数字PCR的扩增程序可能与传统qPCR有所不同，尤其是退火温度和延伸时间，需严格按照试剂说明书设置。启动PCR程序。2.4液滴读取与数据分析PCR扩增完成后，即可进行液滴读取。*准备dropletreader：确保dropletreader已预热并校准。打开配套的QuantaSoft™软件。*放置96孔板：待PCR反应结束，将96孔板从PCR仪中取出，冷却至室温（或按试剂要求），然后平稳放入dropletreader的样品仓内。*设置读取参数：在QuantaSoft™软件中创建新的实验，选择对应的检测方法（如探针法选择FAM、VIC等通道，EvaGreen法则选择相应通道），并设置样品信息。*启动读取：开始液滴读取程序。仪器会自动逐孔读取液滴，并对每个液滴进行荧光信号检测和分析。*数据分析与结果导出：读取完成后，QuantaSoft™软件会自动生成结果，包括每个反应孔的液滴总数、阳性液滴数、浓度（拷贝数/μL）及其95%置信区间等。仔细检查扩增曲线和液滴簇的分离情况，确保结果的可靠性。根据实验需求，对数据进行进一步的分析和导出。三、实验后处理与维护实验结束后，及时清理实验台面，废弃的吸头、反应管等按生物安全要求处理。对于使用过的液滴生成卡属于生物危害废物，需妥善处理。定期对仪器进行清洁和维护，遵循厂家推荐的维护计划，确保仪器长期稳定运行。四、注意事项与故障排除*防止污染：严格遵守实验室操作规范，避免交叉污染。定期清洁移液器、工作台面和仪器表面。*试剂储存：按照试剂说明书的要求储存所有试剂，特别是酶和探针，通常需要-20℃保存，并避免反复冻融。*液滴质量：若发现液滴数量过少或大小不均，需检查试剂是否失效、操作是否规范、仪器是否需要校准。*扩增效率：如果扩增效率低或无扩增，需检查引物探针设计、反应条件是否合适、模板质量等。*数据