第十单元　第54课时　基因工程的基本工具和基本操作程序(含DNA的粗提取)(1)-2026版一轮复习

第54课时基因工程的基本工具和基本操作程序(含DNA的粗提取)课标要求1.概述基因工程是在微生物学、生物化学和分子生物学等学科的基础上发展起来的。2.阐明重组DNA技术的三种基本工具。3.DNA的粗提取与鉴定。4.阐明基因工程的基本操作程序。考情分析1.基因工程的基本工具2024·湖南·T52.基因工程的基本操作程序2024·贵州·T212024·湖南·T212024·甘肃·T212024·全国甲·T382023·湖北·T42023·新课标·T62023·广东·T202023·海南·T202023·山东·T252023·天津·T172022·广东·T222022·北京·T212022·山东·T253.DNA的粗提取与鉴定2024·安徽·T142024·山东·T132022·山东·T13考点一基因工程的基本工具1．基因工程的概念[提醒]基因工程的理论基础[教材隐性知识]源自选择性必修3P68“科技探索之路”肺炎链球菌的转化实验不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了____________________________________；科学家发现，在细菌拟核DNA之外的________有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移；多种______________、__________________和逆转录酶的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件；__________________技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。2．重组DNA技术的基本工具(1)限制性内切核酸酶(简称“限制酶”)[提醒]①限制酶的识别序列一般由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。②限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键。③在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割两次此DNA分子，产生4个末端。只有这样才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。我用夸克网盘分享了「与您分享-国家、地方、行业、团体标准」，点击链接即可保存。打开「夸克APP」，无需下载在线播放视频，畅享原画5倍速，支持电视投屏。链接：/s/45a9f612fe59提取码：t9EX联系qq:1328313560我的道客巴巴：/634cd7bd0a3f5a7311db139533c20794

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(2)DNA连接酶(3)载体3．DNA的粗提取与鉴定(1)基本原理(2)操作流程[提醒]①本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核和其他细胞器(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。②加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。(1)使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端(2024·贵州，13D)()(2)羊的成熟红细胞可作为提取DNA的材料(2020·海南，10A)()(3)向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可见玻璃棒上有白色丝状物()(4)动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行(2022·湖北，4A)()分析限制酶的作用和选择将从苏云金杆菌中获取的Bt基因转入棉花细胞内培育转基因抗虫棉的过程中，需借助多种分子工具且经历多个操作步骤。实验人员使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割质粒。如图表示常用的限制酶识别序列和切割位点以及质粒上的限制酶切割位点。请思考以下问题：(1)限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割产生的黏性末端分别是_______________和______________。(2)切割图示中的目的基因应选用哪类限制酶？请说明理由。________________________________________________________________________________________________________________________________________________限制酶的选择(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率，防止只有一个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选)。(3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用是：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接，即用DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的，否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。考向一辨析基因工程的基本工具1．(2023·新课标，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是()A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA连接酶连接B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA连接酶连接C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA连接酶连接D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接2．(2024·连云港调研)质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是()项目细菌在含氨苄青霉素的培养基上生长情况细菌在含四环素的培养基上生长情况①能生长不能生长②能生长能生长③不能生长能生长A.质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点B．①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是bC．质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个D．将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶与DNA有关的几种酶的比较考向二DNA的粗提取与鉴定3．(2024·安徽，14)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是()A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNAC．DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质4．(2024·山东，13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是()A．整个提取过程中可以不使用离心机B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰考点二基因工程的基本操作程序1．目的基因的筛选与获取(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞________或获得预期______________等的基因。(2)筛选合适的目的基因①从相关的已知__________________的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。②利用________________和序列比对工具进行筛选。(3)目的基因的获取①人工合成目的基因。②PCR________和扩增目的基因a．PCR(聚合酶链式反应)：是一项根据______________的原理，在体外提供参与DNA复制的各种________与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行______________的技术。b．PCR反应的条件：一定的______________、DNA模板、2种________、4种____________、________________DNA聚合酶，以及能自动调控________的仪器。c．PCR扩增的过程d．PCR产物的鉴定：常采用________________________________________________来鉴定。[归纳提升](1)耐高温的DNA聚合酶的作用：催化合成DNA子链。(2)引物(2种)的作用：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。(3)缓冲液的作用：维持反应体系pH稳定。(4)复性温度过高，则引物难以与模板链结合，温度过低则易使两条母链配对结合，均无法获得PCR产物。③通过构建________________来获取目的基因。2．基因表达载体的构建——基因工程的核心(1)目的：使目的基因________________________________________，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。(2)基因表达载体的组成及作用(3)构建过程[提醒]启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比项目启动子终止子起始密码子终止密码子本质DNADNAmRNAmRNA位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA使转录在所需要的地方停下来翻译的起始信号(编码氨基酸)翻译的结束信号(正常情况下，不编码氨基酸)3.将目的基因导入受体细胞生物种类植物动物微生物常用方法农杆菌转化法、__________显微注射法_______处理法受体细胞原核细胞转化过程将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入[辨析](1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。(2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入4．目的基因的检测与鉴定分析基因工程的基本操作程序接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙型肝炎病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙型肝炎病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题：(1)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。为确保目的基因可以正常表达，其上下游序列需具有______________________________。(2)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取________________________并用__________扩增，电泳后观察是否扩增出目的基因。(3)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。________________________________________________________________________________________________________________________________________________。考向三辨析基因工程的基本操作程序5.(2023·湖北，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是()A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落双标记基因与影印接种法筛选含重组质粒的菌落(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。(2)被转化的细菌有三种：含自身环化目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。(3)筛选方法：将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的细菌即为含重组质粒的细菌，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。6．(2024·河池模拟)研究人员将目的基因插入质粒，构建重组质粒的过程如图所示，再将该重组质粒导入大肠杆菌中。由LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可分解X－gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，否则菌落为白色。下列叙述错误的是()A．将目的基因插入质粒中时，需要用到的酶有XhoⅠ、NheⅠ和DNA连接酶B．需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种易于吸收周围环境中DNA分子的状态C．按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后，大肠杆菌可正常表达该目的基因D．在含X－gal的培养基上培养导入了重组质粒的大肠杆菌，可出现蓝色菌落1．下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是()A．与洋葱相比，猪血更适合作为DNA的粗提取与鉴定实验的材料B．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低C．因DNA溶于酒精但蛋白质不溶于酒精可分离DNA与蛋白质D．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，取沉淀进一步实验E．预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解F．加入预冷酒精析出白色丝状物的过程中用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌G．两次离心，第一次DNA主要存在于上清液中，第二次主要存在于沉淀物中H．将提取的丝状物溶解在2mol/LNaCl溶液中，将二苯胺试剂加入就能出现蓝色2．下列关于基因工程中工具酶的叙述，正确的是()A．限制性内切核酸酶可以从某些原核生物中提取B．限制性内切核酸酶也可以识别和剪切RNAC．不同限制性内切核酸酶可能切割出相同的黏性末端D．DNA连接酶连接的是两条链碱基对之间的氢键E．E.coliDNA连接酶只能将有互补黏性末端的两个DNA片段连接起来3．下列关于基因工程中载体的叙述，错误的是()A．基因工程中所用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等B．基因工程中用的载体大多数为天然质粒C．质粒是常用的载体，有2个游离的磷酸基团D．必须具有自我复制能力E．具有一个至多个限制酶切割位点，以便目的基因的插入F．载体质粒中必须有抗生素抗性基因，便于重组DNA分子的筛选4．下列关于基因表达载体及其构建过程的说法，正确的是()A．基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建B．构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中能稳定存在且遗传给下一代C．一个基因表达载体一般包括目的基因、标记基因、起始密码子和终止密码子等结构D．基因表达载体的构建至少需要两种工具酶E．基因表达载体的构建过程中会发生碱基互补配对F．诱导物与诱导型启动子结合可激活或抑制目的基因表达G．基因表达载体中启动子具有DNA聚合酶的结合部位，启动复制过程5．下列关于将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测和鉴定的叙述，正确的()A．农杆菌转化法是利用土壤农杆菌侵染植物细胞，然后将重组Ti质粒整合到受体植物细胞的染色体DNA上B．将重组Ti质粒导入土壤农杆菌中时，可以用钙离子处理细菌C．应该将抗虫基因插入农杆菌Ti质粒的T－DNA片段内D．将目的基因导入动物细胞常用体细胞作受体细胞，采用显微注射技术进行操作E．可采用PCR检测目的基因是否转录和翻译F．某抗虫基因转基因是否成功，最简便的方法是观察该植物有没有抗虫性状答案精析考点一整合1．DNA分子转基因遗传特性生物类型基因重组教材隐性知识DNA可以在同种生物的不同个体之间转移质粒限制酶DNA连接酶基因组编辑2．(1)原核生物数千特定核苷酸序列磷酸二酯键(2)磷酸二酯键大肠杆菌黏性末端黏性末端(3)环状双链DNA分子噬菌体有一个至多个自我复制受体DNA标记3．(1)不溶于2mol/L二苯胺(2)95%沸水判断正误(1)√(2)×[羊属于哺乳动物，其成熟红细胞没有细胞核，不可作为提取DNA的材料。](3)×[向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，鸡血细胞吸水涨破，DNA溶于蒸馏水，观察不到白色丝状物。](4)×[动、植物细胞DNA的提取不需要在无菌条件下进行。]提升(1)(2)用限制酶MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。限制酶MunⅠ和EcoRⅠ切割后形成的黏性末端相同，限制酶NheⅠ和SpeⅠ切割后形成的黏性末端相同，实验人员使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割质粒，应选用MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。评价1．C[酶3切割后得到的是平末端，应该用T4DNA连接酶连接，A不符合题意；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到黏性末端，二者不能连接，B不符合题意；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C符合题意；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D不符合题意。]2．C[质粒的复制原点上有DNA聚合酶的结合位点，A错误；①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是b，②是c，③是a，B错误；将外源基因与质粒连接时需用DNA连接酶，D错误。]3．D[研磨液中含有NaCl，有利于DNA的溶解，若换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，因此利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA，B正确；DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺试剂可用于鉴定DNA，不能检测溶液中是否含有蛋白质杂质，D错误。]4．A[研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误；鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误；加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。]考点二整合1．(1)性状表达产物(2)①结构和功能清晰②序列数据库(3)②获取a．DNA半保留复制组分大量复制b．缓冲溶液引物脱氧核苷酸耐高温的温度c．90单链50引物72耐高温的DNA聚合酶d．琼脂糖凝胶电泳③基因文库2．(1)在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代(2)启动子标记基因3．花粉管通道法Ca2＋体细胞或受精卵受精卵提升(1)用于筛选含有重组表达载体的细胞启动子和终止子(2)染色体DNA(基因组DNA)PCR(3)从酵母细胞中提取蛋白质，再用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测是否出现杂交带评价5．D[若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；DNA凝胶电泳技术可以分离出不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与原质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。]6．C[按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后，由于目的基因的转录方向和启动子的方向相反，大肠杆菌不能正常表达该目的基因，C错误；重组质粒含有LacZ基因，其编码产生的β-半乳糖苷酶可分解X－gal产生蓝