DB14T 1403-2017 黄芩种子ITS2 序列鉴定方法_第1页
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2017-07-30实施2017-07-30实施I I 1 13术语和定义 14原理 1 16黄芩种子ITS2序列特征 3 3 39种子DNA提取方法 4 4 5 6GB/T3543.2农作物种子检验规程扞样5.4聚乙烯吡咯烷酮(PVP)2 (121℃)条件下灭菌20min。称取292.2g氯化钠(NaCl),加800mL水溶解后，再加水定容到1000mL。在103.4kPa(121℃)量取1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(5.7)100mL,5mol/L氯化钠溶液(5.9)280mL,kPa(121℃)条件下灭菌20min。分别量取10mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(5.7)和2mL乙二铵四乙酸二钠溶液(5.8),加水定容至1000mL。在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20min。5.12酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)溶液按体积比为25:24:1配制酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)称取242.2g三羟甲基氨基甲烷，加入300mL水加热搅拌溶解后，加入100mL乙二铵四乙酸二钠溶液(5.8),用冰乙酸调pH至8.0,然后加水定容到1000mL。使用时用水稀释成1×TAE。5.14加样缓冲液称取250.0mg溴酚蓝，加入10mL水，在室温下溶解12h;称取250.0mg二甲基苯35.17TaqDNA聚合酶(5U/μL)及PC同产地黄芩有不多于四个变异位点，分别为88、111倍点T-C变异，171倍点A-G变异，210倍点C-A黄芩种子表面经无水乙醇处理后，用中药材粉碎机或研磨仪粉碎，粉碎后颗粒直径小于1mm,取100mg粉末置于2mL离心管中备用。a)在有100mg粉末的离心管中加入1000μL65℃b)取上清液转入另一个1.5mL的离心管，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25:24:1),缓慢翻转混匀，在14000r/min离心10min。c)重复上述步骤一次。d)取上清液，加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，置于-20℃30min。在4℃条件下144室温下静置并自然风干10min。f)将此沉淀加入100mL的无菌双蒸水或TE缓冲液，4℃终浓度单样品体积10×PCR缓冲液5U/μLTaq酶(热启动)注：10×PCR缓冲液含氯化镁，以上反应试剂按顺序添加.ITS2序列扩增程序：94℃,变性5min;94℃变性30s,56℃退火30s,

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