T∕CVMA 387-2026 犬消化道相关五种病原体实时荧光RAA检测方法

Real-timeRAAdetectionmethodforfiveca中国兽医协会发布I请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。众创生物科技有限公司、山东远大富邦生物工程有1犬消化道相关五种病原体实时荧光RAA检测方法GB/T6682分析实验室用水规格和GB/T27401实验室质量控制规范NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范4缩略语CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammoniumbrDNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacFAM：6-羧基荧光素（6-carboxyfluorescein）MMLV：莫洛尼氏鼠白血病逆转录病毒（moloneymurineleukemiaretrovirus）PBS：磷酸盐缓冲液（phosphate-bufferedsalinebuffer）RNA：核糖核酸（ribonucleicaRAA：重组酶介导链替换核酸扩增（recombinase-aidamplificaRT-RAA：反转录重组酶介导链替换扩增（reversetranscription-recombinase-aidamplificatioTris：三（羟甲）基氨基甲烷（tri-methylolaminometh25.1.3CTAB提取缓冲液按附录A.2配5.1.7TE缓冲液按附录A.45.1.8PBS缓冲液按附录A.5.1.9启动剂按附录A.6配制。3样品的采集、保存与运输按照NY/T5粪便和肛拭子样品采集分别按照NY/T541中相关粪便样品加入适量PBS缓冲液充分振荡混匀。1000r/min低速离心5min去除大颗粒杂质，吸取中段用于核酸检测的样品应尽快送检，24h内检测的样本可置于4℃保存，8.1.1在样本制备区进行，核酸提取使用CTAB法提取，也可采用其他等效核48.1.7开盖，室温挥发干液体，加入50μLn+1分别配制五种反应体系，充分混匀后分装，每个反应管20μL，转移至样本制备区。9结果判断与表述9.1质量控制间20min，则重复一次。如再次检测结果仍然是T值（时间20min，则判定被检样品阳性，表述为“检出阳性核酸”。如无报告T值（时间）或无荧光对数增长则判定被检样品阴性，表述5A.3核酸抽提液（pH8.0）A.4TE缓冲液（pH8.0）A.5PBS缓冲液（pH7.4）A.6启动剂A.7犬冠状病毒、犬瘟热病毒、犬轮状病毒阳性对照制备病毒载体转化至大肠杆菌BL21（DE3）表达系统后诱导表达纯化获得装甲RNA病毒颗粒，并对提取后犬轮状病毒的阳性对照母液。将阳性对照母液10倍梯度稀释之后，选取1A.8犬细小病毒、胎儿三毛滴虫阳性对照制备微量分光光度计测定阳性重组质粒浓度，并将浓度换算成拷贝数（DNA拷贝/µL）=[6.02×1023×DNA浓6）），阳性对照母液10倍梯度稀释之后，选取107引物/探针序列（5'→3'）ATTGTTGGCTCGTCATAGCGGATTGCATATTAGGAAGTTTAGATTTGA[引物/探针序列（5'→3'）NGCTTCCACAATGTAGTTATCTATTGTTAGAAACAGGATTGCTGAGGACT[FAM引物/探针序列（5'→3'）GCATCCGCCAAAACAGATTCATTTGTTCATCACGCTACAGTTGGATTAAC[FAM-引物/探针序列（5'→3'）CCATACTTATATTTCTCGCCTCCATCACTCATTGGTGC8引物/探针序列（5'→3'）AATATGAGGTGGTGGTTTACTTCTTTTAGT[FAM-dT]引物/探针序列（5'→3'）ATGGGTTACTGTAACATATATGCGTGTTCTGGATTAGCTTTCTTTGCGACAAGTTCGA[FAM9C.1犬冠状病毒阳性对照参考序列（GenBankC.2犬瘟热病毒阳性对照参考序列（GenBGTCGGGGAATTTAGAATGAACAAAATCTGGCTTGATATTGTTAGAAACAGGAGACTTATCTTTGAGGCGATTCATGGTGGCACTCATCCTGGATATCAAACGATCCCGCCTAGAATTGCTGAAATGATTTGTGATATAGATAACTACATTGC.3犬轮状病毒阳性对照参考序列（GenBaCCATACTTATATTTCTCGCCAGCAGATCAACGCTTTATAGATCAAACTAGATTGGGGGGGGAAAATAGGACATTATTTTTTTAGAGCTAAAAAGGCAATTGCTCCAGTATTTGATACACCAGATCATCCATCAACATCAAGACCAACAAAACCAACTAAAAGAAGTAAACCACCCTCATATTTTCATCAATCTTGCAAAAAAAAAAAAAACCGGTGCAGGACAAGTAAAAAGAGACAATCTTGCACCAATGAGTGATC.5胎儿三毛滴虫阳性对照参考序列（GenCTTAGGCAATGGATGTCTTGGCTTCTTACACGATGAAGAACGTTGCATGGCTGGATTAGCTTTCTTTGCGACAAGTTCGATCTTTGAATGCACATTGCGCGCCGTTCTAGAACACGCATATATGTTACA犬冠状病毒、犬瘟热病毒、犬轮状病毒荧光RT-RAA反应体系表D.1犬冠状病毒、犬瘟热病毒、犬轮状病毒荧光RT体积(μL）RT-RAA荧光反应单元（25μL反应体系冻干粉）-正向引物(10μmol/L)反向引物(10μmo