浙江大学《分子生物学》课件-第1章核酸的结构和功能

第一章

核酸的结构和功能StructureandFunctionofNucleicAcid浙江大学《分子生物学》核酸(nucleicacid)

是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。一、核酸的发现和研究工作进展1868年FridrichMiescher从脓细胞中提取“核素”1944年

Avery等人证实DNA是遗传物质1953年

Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构1968年Nirenberg发现遗传密码1975年Temin和Baltimore发现逆转录酶1981年Gilbert和Sanger建立DNA测序方法1985年Mullis发明PCR技术1990年美国启动人类基因组计划(HGP)1994年中国人类基因组计划启动2001年美、英等国完成人类基因组计划基本框架DNA是主要的遗传物质1944，O.Avery肺炎双球菌转化实验1952，A.DHershey和M.Chase噬菌体感染实验RNA也可作为遗传物质RNA病毒病毒颗粒（virion）：由病毒RNA基因组和包被在外的蛋白质外壳组成.类病毒（viroid）:是使高等植物产生疾病的有传染性的因子，由很小的环状RNA分子构成。与病毒不同，类病毒的RNA本身就是感染因子。类病毒只由RNA组成，其中广泛存在不完全的碱基配对，形成一种特有的棒状结构。类病毒的基因组不能编码蛋白质。RNA功能的多样性1、参与蛋白质的合成2、RNA的转录后加工与修饰3、参与基因表达的调控4、生物催化作用二、核酸的分类及分布90%以上分布于细胞核，其余分布于核外如线粒体，叶绿体，质粒等。分布于胞核、胞液。(deoxyribonucleicacid,DNA)(ribonucleicacid,RNA)脱氧核糖核酸

核糖核酸携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型(genotype)。参与细胞内DNA遗传信息的表达。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体。第一节核酸的化学组成及其一级结构TheChemicalComponentandPrimaryStructureofNucleicAcid核酸的化学组成1.元素组成C、H、O、N、P（9~10%）2.分子组成——碱基(base)：嘌呤碱，嘧啶碱——戊糖(ribose)：核糖，脱氧核糖——磷酸(phosphate)嘌呤(purine)腺嘌呤(adenine,A)鸟嘌呤(guanine,G)碱基嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶(cytosine,C)尿嘧啶(uracil,U)胸腺嘧啶(thymine,T)戊糖（构成RNA）1´2´3´4´5´核糖(ribose)（构成DNA）脱氧核糖(deoxyribose)核苷：AR,GR,UR,CR脱氧核苷：dAR,dGR,dTR,dCR一、核苷酸的结构1.核苷(ribonucleoside)的形成碱基和核糖（脱氧核糖）通过糖苷键连接形成核苷（脱氧核苷）。1´1核苷酸：AMP,GMP,UMP,CMP脱氧核苷酸：dAMP,dGMP,dTMP,dCMP2.核苷酸(ribonucleotide)的结构与命名核苷（脱氧核苷）和磷酸以磷酸酯键连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。体内重要的游离核苷酸及其衍生物含核苷酸的生物活性物质：NAD+、NADP+、CoA-SH、FAD

等都含有

AMP

多磷酸核苷酸：NMP，NDP，NTP

环化核苷酸:cAMP，cGMPAMPADPATPcAMPNADP+NAD+5´端3´端3.核苷酸的连接核苷酸之间以磷酸二酯键连接形成多核苷酸链，即核酸。CGA二、核酸的一级结构定义核酸中核苷酸的排列顺序。由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列。5′端3′端CGAAGP5

PTPGPCPTPOH3

书写方法5

pApCpTpGpCpT-OH

3

5

ACTGCT

3

目录第二节DNA的空间结构与功能DimensionalStructureandFunctionofDNADNA的二级结构-双螺旋结构DNA双螺旋结构的研究背景和历史意义DNA双螺旋结构模型要点DNA的超螺旋结构及其在染色质中的组装DNA的超螺旋结构原核生物DNA的高级结构DNA在真核生物细胞核内的组装DNA的功能一、DNA的二级结构——双螺旋结构（一）DNA双螺旋结构的研究背景

碱基组成分析Chargaff规则：[A]=

[T][G]

[C]

碱基的理化数据分析A-T、G-C以氢键配对较合理DNA纤维的X-线衍射图谱分析目录（二）DNA双螺旋结构模型要点（Watson,Crick,1953）DNA分子由两条相互平行但走向相反的脱氧多核苷酸链组成，两链以-脱氧核糖-磷酸-为骨架，以右手螺旋方式绕同一公共轴盘。螺旋直径为2nm，形成大沟(majorgroove)及小沟(minorgroove)相间。目录（二）DNA双螺旋结构模型要点

（Watson,Crick,1953）碱基垂直螺旋轴居双螺旋内側，与对側碱基形成氢键配对（互补配对形式：A=T;G

C）。相邻碱基平面距离0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10对碱基。目录碱基互补配对TAGC（二）DNA双螺旋结构模型要点

（Watson,Crick,1953）氢键维持双链横向稳定性，碱基堆积力维持双链纵向稳定性。目录（三）DNA双螺旋结构的多样性目录A-DNAA-DNAwasthefirstDNAhelixcharacterisedbyRosalindFranklinintheearly1950’s.A-DNAhelicestendtobefavouredbystretchesofpurines(orpyrimidines)ofatleast4bp.A-DNAhelicesarefoundinRNA-DNAhybrids.B-DNAB-DNAisthe`classic´helixdescribedbyWatsonandCrickin1953.Ithas,onaverage,about10bp/turnofthehelixandistheAVERAGEstructureformanyDNAsequences.Z-DNAZ-DNAwasthefirstDNAhelixtobecrystallised(in1979),andcametothesurpriseofmanybiologists.Itisathin,LEFT-HANDEDhelix,with12bp/turn,andhasazig-zagbackbone(henceitsname).Certainalternatingpyrimidine/purinesequences(e.g.,CGCGCG)willformthishelix.ABZMiMaMaMiMiMa二、DNA的超螺旋结构及其在染色质中的组装（一）DNA的超螺旋结构超螺旋结构(superhelix或supercoil)DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。正超螺旋(positivesupercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方同相同负超螺旋(negativesupercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相反意义DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其调控对于DNA复制和RNA转录过程具有关键作用。（二）原核生物DNA的高级结构（三）DNA在真核生物细胞核内的组装真核生物染色体由DNA和蛋白质构成，其基本单位是核小体(nucleosome)。核小体的组成DNA：约200bp组蛋白：H1H2A，H2BH3H4三、DNA的功能DNA的基本功能是以基因的形式荷载遗传信息，并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动的信息基础。基因从结构上定义，是指DNA分子中的特定区段，其中的核苷酸排列顺序决定了基因的功能。第三节

RNA的结构与功能StructureandFunctionofRNARNA的种类、分布、功能一、信使RNA的结构与功能hnRNA内含子(intron)mRNA*mRNA成熟过程

外显子(exon)目录*mRNA结构特点1.大多数真核mRNA的5´末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C´2也是甲基化，形成帽子结构：m7GpppNm-。2.大多数真核mRNA的3´末端有一个多聚腺苷酸(polyA)结构，称为多聚A尾。帽子结构mRNA核内向胞质的转位mRNA的稳定性维系翻译起始的调控帽子结构和多聚A尾的功能*mRNA的功能把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。DNAmRNA蛋白转录翻译原核细胞细胞质细胞核DNA内含子外显子转录转录后剪接转运mRNAhnRNA翻译蛋白真核细胞*tRNA的一级结构特点含10~20%稀有碱基，如DHU3´末端为—CCA-OH5´末端大多数为G

具有T

C二、转运RNA的结构与功能N,N二甲基鸟嘌呤N6-异戊烯腺嘌呤双氢尿嘧啶4-巯尿嘧啶

稀有碱基*tRNA的二级结构——三叶草形

氨基酸臂

DHU环反密码环额外环

TΨC环氨基酸臂额外环*tRNA的三级结构——倒L形*tRNA的功能活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。*rRNA的结构三、核蛋白体RNA的结构与功能*rRNA的功能参与组成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所。*rRNA的种类（根据沉降系数）真核生物5SrRNA28SrRNA5.8SrRNA18SrRNA原核生物5SrRNA23SrRNA16SrRNA核蛋白体的组成原核生物（以大肠杆菌为例）真核生物（以小鼠肝为例）小亚基30S40SrRNA16S1542个核苷酸18S1874个核苷酸蛋白质21种占总重量的40%33种占总重量的50%大亚基50S60SrRNA23S5S2940个核苷酸120个核苷酸28S5.85S5S4718个核苷酸160个核苷酸120个核苷酸蛋白质31种占总重量的30%49种占总重量的35%四、其他小分子RNA及RNA组学除了上述三种RNA外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA，统称为非mRNA小RNA(smallnon-messengerRNAs,snmRNAs)。snmRNAssnmRNAs的种类核内小RNA核仁小RNA胞质小RNA催化性小RNA小片段干涉RNA

snmRNAs的功能参与hnRNA和rRNA的加工和转运。RNA组学研究细胞中snmRNAs的种类、结构和功能。同一生物体内不同种类的细胞、同一细胞在不同时间、不同状态下snmRNAs的表达具有时间和空间特异性。RNA组学核酸的理化性质ThePhysicalandChemicalCharactersofNucleicAcid第四节目录一、核酸的理化特性核酸的稳定性（StabilityofNucleicAcids）酸效应（EffectofAcid）碱效应（Effectofalkali）化学变性（ChemicalDenaturation）粘性（Viscosity）浮力密度（Buoyantdensity）1.核酸的稳定性（StabilityofNucleicAcids）碱基对间的堆积力（stackinginteractions

betweenbasepair）是核酸稳定性的根源。2.酸效应（EffectofAcid）Strongacid+hightemperature（perchloricacid高氯酸+100°C）:nucleiacidarecompletelyhydrolyzedtotheirconstituents:bases,riboses/deoxyrobose,andphosphate强酸和高温下完全水解这是MaxamandGilbert化学测序法的基础3.碱效应（Effectofalkali）HighpHchangesthetautomeric(互变异构)stateofthebasesketoform酮式enolateform烯醇式ketoformenolateformDNADenaturation（变性）:thedouble-strandedthesingle-strande4.化学变性（ChemicalDenaturation）Anumberofchemicalagents,suchasureaandformamide,candenatureDNAandRNAatneutralpHbydisruptingthehydrophobicforcesbetweenthestackedbases.(破坏氢键，使DNA或RNA在中性pH条件下变性）Urea(H2NCONH2)(尿素）:denaturingPAGEFormamide(HCONH2)（甲酰胺）:Northernblot5.粘性（Viscosity）Reasonsforhighviscosity:Highaxialratio(高轴比）：DNA直径只有2nm，但长度可以达到µm,mm,cm(CellarDNAisverylongandthin)Arelativelystiffmolecule(刚性分子）Applications:LongDNAmoleculescaneasilybeshortenedbyshearingforce.WhenisolatingverylargeDNAmolecule,alwaysavoidshearingproblem.6.浮力密度（Buoyantdensity）DNAdensity，1.7gcm-3,asimilarto8MCsCl.用于：1.DNA纯化

2.DNA分析：DNA浮力密度Rho=1.66+0.098(GC)%平衡密度梯度离心RNApelletsatthebottomProteinfloats蛋白质漂浮二、核酸的光谱学和热力学特性（SpectroscopicandThermalPropertiesofNucleicAcids）紫外吸收（UVabsorption）减色现象（Hypochromicity）热变性（Thermaldenaturation/melting）复性（Renaturation）1、紫外吸收（UVabsorption）

UsingSpectroscopytoanalyzeDNADNAabsorbsUVlightwithamajorpeakat260nmThisabsorptionisusefulbecauseitvarieswiththestructureofDNA(&RNA)i.e.extinctioncoefficient

（消光系数）dependsonthestructureDNAandRNA：lmax=260nm,Protein:lmax=280nmApplications:detection,quantitation,assessmentofpurity(A260/A280)OpticalDensity260WaveLength透光度（t）：入射强度（Io）与透过溶液后的强度相比发生了变化I/Io透光率（T）：I/Io×100%吸光度（A）或光密度（OD）：A=-log（I/Io）=log（Io/I）=ODA或OD与溶液中的浓度和厚度成正比；在分光光度计中厚度为1cm，所以A与浓度成正比

A260nm（核酸），A280nm（蛋白质），在波长为260nm的紫外线下，1OD的光密度相当于约50ug/ml的双链DNA，40ug/ml的单链DNA或RNA，20ug/ml的单链寡核苷酸可通过A260nm/A280nm判断核酸的纯度

DNA：A260nm/A280nm=1.8RNA：A260nm/A280nm=2.01.DNA或RNA的定量OD260=1.0相当于50μg/ml双链DNA40μg/ml单链DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0OD260的应用目录DNA纯化（PurityofDNA）A260/A280:dsDNA--1.8pureRNA--2.0protein--0.5IfA260/A280＞1.8,RNAcontamination(RNA污染）IfA260/A280＜1.8,proteininthesample(蛋白质存在）2.减色现象（Hypochromicity）Causedbythefixingofthebasesinahydrophobicenvironmentbystacking,whichmakesthesebases.(是由于碱基在疏水环境中的堆积所造成的）UVabsorption：dsDNA＜

ssDNA/RNA＜

nucleotide

dsDNALowextinctioncoefficientssDNAHigherextinctioncoefficient3.DNA的变性(denaturation)定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。变性后其它理化性质变化：OD260增高 粘度下降比旋度下降 浮力密度升高酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失目录DNA变性的本质是双链间氢键的断裂例：变性引起紫外吸收值的改变DNA的紫外吸收光谱增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。目录热变性（Thermaldenaturation/

melting）解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。目录Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度(meltingtemperature,Tm)。其大小与G+C含量成正比。目录heatingleadstothedestructionofdouble-strandedhydrogen-bondedregionsofDNAandRNA.MeltingtemperatureofDNAisthemid-pointofthetransitionwhenduplexDNAtodenaturedbyheatingtoseparateintosinglestrandsFactorsaffectingmelting:TheG+CcontentoftheDNAfromdifferentorganismsvariesfrom22%-73%G+CcontentaffectsTmsincehigherG+CratiomeanstheDNAisjoinedby3hydrogenbondsversus2forA+TOrganicsolvents（有机溶剂）suchasDMSO(dimethylsulfoxide二甲亚砜)andformamide（甲酰胺）disruptHbondingbetweenDNAstrandspHchangesalsodisruptHbondingLoweringsaltconcentrationsremovesionsthatshieldnegativechargesonDNAfromoneanother,candenatureDNAarelativelylowtemp4.DNA的复性与分子杂交

DNA复性(renaturation)的定义在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。减色效应DNA复性时，其溶液OD260降低。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing)。目录RenaturationisthereassociationofdenaturedcomplementarysinglestrandsofaDNAdoublehelix.（ssDNAdsDNA)Rapidcooling:onlyallowtheformationoflocalbaseparing.快速降温只能形成局部的dsDNA

Absorbanceisslightlydecreased（A260

下降很小）Slowcooling:wholecomplementationofdsDNA.（慢速冷却可以形成完全的dsDNA）Absorbancedecreasesgreatlyandcooperatively.（A260

相应下降）HybridizationisthepairingofcomplementaryRNAandDNAstrandstogiveanRNA-DNAhybrid.Annealing:BaseparingofshortregionsofcomplementaritywithinorbetweenDNAstrands.在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，