（正式版）DB37∕T 2031-2012 《奶牛DNA亲子鉴定技术规程》

DB37DB37/T2031—2012奶牛DNA亲子鉴定技术规程TechnicalSpecificationforDNAParentageIdentificationinDairyCattle2012-02-09发布2012-03-01实施山东省质量技术监督局发布I1NY/T1672-2008绵羊多胎主效基因FecB分子检SN/T1917-2007牛地方流行性白2 又称多重引物PCR或复合PCR，是指在同一PCR反应体系中加入两对以上引物，同时扩增出利用常染色体微卫星分型技术，选取不同染色体上的微卫星位点，采用多重PCR技术扩增微卫星标除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682的双蒸水；高压灭菌3从细管中取出精液放入1.5mL离心管中，然后，加入500µL生理盐水，混匀，1弃除上清液，保留底部的白色沉淀。重复上述步骤一次。加入精子DNA抽提液400µL及5µL蛋白酶K，旋小心吸取上清液，转至1.5mL离心管中，加产物扩增分4次PCR反应完成。同一扩增组合的引物加入同一PCR反应管中。25µL反应体系：10×Buffer2.5µL、50mmol/LMg组合)各1.0µL、待测个体模板DNA（或者阳性对照DNA）100ng、加双蒸水至反应总体积为25µL。PCR扩7.6.3将混合液缓慢倒入制胶板中，排除气泡，插入多齿梳子。待凝4PCR产物、去离子甲酰胺和TAMRA内标按0.5μL:10μL:0.5μL比例混合，95℃变性5min,ABIPRISM示蓝色、绿色和黑色。8结果判定8.1多重PCR产物检测若4个PCR管均出现清晰条带，表明产物扩增成功，可以进行测序。图1多重PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳图8.2微卫星标记分型利用ABI3100仪器对微卫星标记进行基因分型。检测个体的12个微卫星标记的基因分型结果如附录D所示，根据相对荧光强度和片段大小，可获得待测个体不同STR标记的基因型。不同亲缘关系的个体，其微卫星标记的等位基因大小不同，表现出不同的基因型。阳性对照样品12个STR标记不同等位基因的大小如附录E所示。8.3亲子关系判定根据待检个体STR标记的基因型，利用Cervux3.0软件分别计算其亲子指数的LOD值。当LOD>0时，候选亲本有可能是真实的亲代，LOD值最高的个体是最相似的亲本个体，其RCP值即表示该亲本是真实亲本的机会；当LOD<0时，候选亲本不可能是真实的亲本。9废弃物的处理按照NY/T1672的规定执行。10检测过程中防止交叉污染的措施58gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4、0.24gKH2PO4溶A.40.5mol/LNaCl（将121.1gTris溶于800mLA.9TE缓冲液6取1mol/LTris.HCl（p1mol/LTris.HCl(pH=在10mL水中加入100mg的溴化乙锭（EB溶解后分装成A.142%的琼脂糖72μL，10μL，20μL，100μL，8使用温度范围45-135℃,最高使用压力0.255Mpa。温控范围50-300℃,箱内尺寸350mm×350mm×450mm。9记1AAGATGTGATCCAAGAGAGAGAGGACCAGATCGTGAAAGGCA15AAAGTGACACAACAGCTTCTCAACGAGTGTCCTAGTTTGGCT22973ACAGACAGAAACTCAATGAAAAATCACATGGCAAATAAGTACA4ATCTTCACATGATATTACAGC3TAAC