《木薯杂交种子幼胚挽救技术规程》（征求意见稿）编制说明

一、项目来源根据《广西标准化协会关于下达2022年第一批团体标准制定项目计划的通知》精神，由广西壮族自治区亚热带作物研究所提出，广西壮族自治区木薯研究所和江苏三黍生物科技有限公司起草的团体标准《木薯杂交种子幼胚挽救技术规程》。二、项目背景及目的意义作物杂交种子是农业中最重要的生产资料之一，种子数量和质量在很大程度上决定农业研究发展水平。作物品种携带的优良遗传信息是否表达以及能否获得高产都与种子萌发有关。木薯(ManihotesculentaCrantz)是重，是全球三大重要薯类作物之一，是全球粮食安全的重要保障。木薯杂交种子不成熟、败育等问题，采用木薯不同发育阶段种子进行体系细胞/幼胚诱导胚性愈伤发生，开展胚胎挽救技术再生技术研究，建立细胞学再生体系，获得再生株系，对其进行遗传学评价、筛选，为木薯育种提供创新型基础材料。（1）构建优良木薯杂交组合；（2）探讨木薯优良种质的体细胞胚胎发生杂交组合基因型与诱导条件的相关性，优化、建立木薯种子幼胚挽救技术；（3）通过研究获得相关再生株系材料。经查证，目前我区尚未建立起规范化、标准化的木薯杂交种子有胚挽救技术规程。因此，有必要建立我区该项技术规程，促进我区木薯产业“产、学、研、用”持续有效发展。三、项目编制过程（一）成立标准编制工作组团体标准《木薯杂交种子幼胚挽救技术规程》项目任务下达后，广西壮族自治区亚热带作物研究所成立了标准编制工作组，起草单位制定了起草编写方案与进度安排，明确任务职责，确定工作技术路线，开展标准研制工作。具体标准编制工作由广西壮族自治区亚热带作物研究所承担。编制工作组下设三个组，分别是资料收集组、草案编写组、标准实施组。资料收集组负责国内外有关木薯杂交育种、立体再生技术以及有胚挽救技术的文献资料的查询、收集和整理工作，查阅前人对相关技术研究情况和目前科学界对木薯杂交育种与种质创新的研究进展。草案编写组负责起草标准草案、征求意见稿和标准编制说明、送审稿及编制说明的编写工作，包括后期召开征求意见会、网上征求意见，以及标准的不断修改和完善。标准实施组负责《木薯杂交种子幼胚挽救技术规程》团体标准发布后，组织淮山相关科研、企业和种植户开展标准宣贯培训会，对标准进行详细解读，让种“产、学、研、用”等相关人员了解标准，并根据标准对木薯杂交育种技术的产地环境、亲本选择、杂交试验、外植体选择、体细胞胚胎诱导发生、植株再生技术、再生苗种植、田间管理以及生产应用等进行规范化操作，为木薯育种和种质创新发展提供技术保障，并对标准实施情况进行总结分析，不断对团体标准提出修正意见。（二）收集整理文献资料为完善木薯杂交育种试验技术，更好地利用自身的资源优势，丰富木薯种质资源遗传背景，推进木薯新品种的选育进程。（1）木薯杂交组合；（2）木薯杂交种子诱导萌发因子关联分析；（3）木薯杂交种子体细胞诱导发生及再生体系；（4）木薯再生苗和实生（种子）苗栽培。标准编制工作组收集了国内有关富硒淮山生产相关文献资料。主要有：[1]韦祖生，杨秀娟，付海天，田益农.木薯种子体细胞胚胎诱导发生及植株再生体系建立［J］.南方农业学报，2017，48（12）：219-2135；[2]韦祖生，杨秀娟，付海天，田益农.木薯种子诱导萌发因子关联分析［J］.2017，45（18）：89-93；[3]韦祖生，杨秀娟，田益农.木薯主要栽培品种高效再生体系的建立与优化［J］，安徽农业科学，2017，45（35）：9-12。（三）研讨确定标准主体内容标准编制工作组在对收集的资料进行整理研究之后，2022年08月，标准编制工作组召开了标准编制会议，对标准的整体框架结构进行了研究，并对标准的关键性内容进行了初步探讨。经过研究，标准的主体内容确定为木薯杂交育种技术的产地环境、亲本选择、杂交试验、外植体选择、体细胞胚胎诱导发生、植株再生技术、再生苗种植、田间管理以及生产应用等操作，记录实施情况并分析、讨论与总结。（四）调研、形成征求意见稿、送审稿2022年08月～10月，标准起草工作小组进行了广泛实地调研工作，查阅了大量的国内外文献资料，对木薯杂交育种、体细胞离体再升技术等文献资料进行系统归纳、分析。形成了标准的基本构架，对主要内容进行了讨论并对项目的工作进行了部署和安排。2022年11月～2022年12月，在前期工作的基础之上，通过理清逻辑脉络，整合已有的参考资料中有关木薯杂交种子幼胚挽救技术要求，并结合试验数据、分析基础，按照简化、统一等原则编制完成团体标准《木薯杂交种子有胚挽救技术规程（草案）。2023年01月～2023年04月，标准起草工作组再次广泛、深入木薯育种、栽培以及种植生产等单位，针对性开展相关技术规程情况进行分组实地调研学习。通过实地调研，掌握各地方关于木薯育种及种质创新的具体技术要求。并实际征求意见，通过收集反馈了大量意见，标准编制工作组多次召开会议，对标准草案进行了反复修改和研究讨论。最终形成了团体标准《木薯杂交种子幼胚挽救技术规程》（征求意见稿）和（征求意见稿）编制说明。2023年05月～2023年08月，由起草单位申请挂广西标准化协会官方网站向社会公开征求意见；同时通过书面征询、座谈会等形式，广泛征求广西区种子管理站、广西大学、广西壮族自治区亚热带作物研究所、广西标准化协会、桂林市农业科学研究中心、玉林市农业科学院等相关领域单位（不少于10家）专家提出意见并汇总，根据征求意见处理汇总表修改完善形成团体标准《木薯杂交种子幼胚挽救技术规程》（送审稿）和（送审稿）编制说明。四、标准制定原则1、实用性原则《木薯杂交种子有胚挽救技术规程》是在充分收集相关资料和文献，分析木薯育种、栽培和种植生产当前现状，调研木薯产业发展的前沿信息，在现有国家、行业标准相关木薯再交育种技术基础上，结合广西壮族自治区农亚热带作物研究所多年的木薯种质创新、育种、栽培和推广示范经验而总结起草的。符合当前木薯育种与种植发展需求，有利于行业的长远发展，有利于木薯种质资源创新与育种发展，对推动我区木薯种植产业可持续发展，具有较强的实用性和可操作性。2、协调性原则《木薯杂交种子有胚挽救技术规程》编写过程中注意了与木薯种质创新与育种改良技术相关法律法规的协调问题，在内容上与现行法律法规、标准协调一致。3、规范性原则《规木薯杂交种子有胚挽救技术规程》严格按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的要求和规定编写本标准的内容，保证标准的编写质量。4、前瞻性原则《木薯杂交种子有胚挽救技术规程》在兼顾当前区内各木薯杂交育种技术现实情况的同时，还考虑到了实施现状，在标准中体现了个别特色性、前瞻性和先进性条款，形成木薯育种技术发展的指导。五、标准主要内容及依据来源团体标准《木薯杂交种子有胚挽救技术规程》编制遵循“科学、适度、可行”原则，考虑标准前瞻性又兼顾广西本土自然条件，确保标准可以作为监督、指导生产的依据，保障木薯育种、种植产品达到安全、稳定、优质。《木薯杂交种子有胚挽救技术规程》主要技术指标是经过多年的科学实/试验、生产实践以及调研访问等途径总结集成。此外，本标准还根据前人的研究结果及应用资料，参考了相关的植物体细胞胚胎诱导发生、植株再生技术基本要求。材料取不同成熟阶段的种子材料：（1）未成熟种子子叶（a1）、胚芽（b1）；（2）成熟种子子叶（a2）、胚芽（b2）；（3）诱导萌发种子子叶（a3）、胚芽（b3）、胚轴（c3）。2．培养基质制备（1）M1：MS（含维生素）（MurashigeandSkoog，1962）+2.00MCuSO4+2.00%蔗糖+0.30%Gelrite，PH5.8，灭菌；（2）M2：M1+10.00mg/LBAP，PH5.8，灭菌；（3）M3：M1+4.00mg/L2，4-D或12.00mg/LPicloram，PH5.8，灭菌；（4）M4：M1+0.10mg/LBAP，1.00mg/LNAA或0.05mg/LBAP+0.50mg/LNAA，PH5.8，灭菌；（5）M5：M1+0.10mg/LBAP+0.50mg/LIBA，PH5.8，灭菌；（6）M6：M1+0.40mg/LBAP，PH5.8，灭菌。3.消毒处理将木薯种子用ddH2O冲洗30s，2次；无水乙醇浸泡冲洗10s；ddH2O冲洗30s，2次；0.1%升汞浸泡冲洗1次：（1）未成熟/成熟种子，2.0min，（2）诱导萌发种子，60s；ddH2O冲洗30s，2次；75%乙醇浸泡冲洗20s，2次；ddH2O浸泡冲洗30S，2次；无菌滤纸吸干。将已经消毒材料在无菌条件下，解剖、切取2.0mm-3.0mm外植体材料：子叶（a）、胚芽（b）和胚轴（c），置于M1培养基上保湿、培养，备用。4.膨大诱导处理将外植体置于M1上进行预培养处理3d，以无预培养材料为CK，然后转移置于诱导膨大培养基M2上，26.00℃，16.00h光/8.00h暗，光照强度为800~1000Lx培养，1周；在体视显微镜下，用无菌针头挑取无褐化或者褐化不明显的膨大材料，备用。5.体细胞胚胎诱导发生将膨大材料转移置于体细胞胚胎诱导培养基M3上，26.00℃，24.00h/暗培养，2周。每3天在体视显微镜下观察一次胚性愈伤的发生情况，当出现球型胚、鱼雷型胚茧状嵌合体，则将其分离、继代到新鲜M3上培养。6.体细胞胚分化、增殖将体细胞胚胎转移置于M4，26.00℃，16.00h光/8.00h暗培养，光照强度为800~1000Lx培养，诱导胚状体分化、增殖，每2周继代一次。7.体细胞成熟及子叶器官诱导发生将2-3个体细胞胚组成的小团簇放置到成熟诱导培养基M5，26.00℃，24.00h光培养，光照强度为800~1000Lx培养，直至子叶明显长大并变绿，及时处理褐化材料，避免污染；每周一次更换新鲜培养基。8.茎叶器官伸长及生根诱导发生将成熟不定芽或绿色子叶切取3.00-5.00cm或约0.04cm2，至于茎叶器官伸长及生根诱导培养基M5上，26.00℃，16.00h光/8.00h暗，光照强度为800~1000Lx培养，每周一次更换新鲜培养基，观察茎叶器官的伸长生长及生根发生情况。9.不定芽及再生株系的继代培养将不定芽及再生株系小苗转移至于培养基M1的培养瓶中，26.0℃，16.0h光/8.0h暗培养，光照强度为800~1000Lx，继代培养，进行无性株系繁育。10.再生苗移栽试验10.1炼苗打开瓶口，逐渐降低湿度，并逐渐增强光照，降低气孔口开度，逐渐恢复气孔功能，减少水分散失，促进新根发生，以适应环境，其湿度降低和光照增强进程依植物种类、品种、环境条件而异其合理程序应使原有叶片缓慢衰退，新叶逐渐产生。初始光线应为日光的1/10，其后每3d增加10%，摆放室外早晚见太阳余光；中午或太阳光太强，覆盖遮阴网；3天内饱和湿度，其后每2d～3d降低5%～8%。10.2移栽时期经过10d～15d炼苗，将根系的琼脂去处干净，即可移栽入田间基质，保湿炼苗，但一定要避免强光照射。10.3移栽设施栽培容器可用软塑料容器，也可用育苗盘，苗床也可作为试管苗移栽的场所，移栽后的栽培容器放在温室中培养。10.4移栽基质适合移栽再生苗基质要具备透气性、保湿性和保肥的特点，且容易灭菌处理，选用用珍珠岩，蛭石，草炭土或腐殖土比例为1：1：0.5；人工小温棚培养基质细沙：草木灰：腐殖土=1：1：1，装营养杯种植。10.5盆栽试验栽培容器可用软塑料育苗杯，培养基质细沙：草木灰：腐殖土=1：1：1。炼苗→自来水冲洗干净根部培养基→1000×甲基托布津溶液浸泡，30～60S→1000×多菌灵溶液浸泡，45～60S→800×生根粉浸泡，60S→移栽入营养杯中→定根水→温室大棚栽培管理、观察、记录。10.6移栽流程自来水冲洗培养基干净→1000×甲基托布津溶液浸泡，30S→1000×多菌灵溶液浸泡，45～60S→800×生根粉浸泡，60S→移栽入营养杯或沙床上→定根水→栽培管理、观察。图1木薯种子体细胞诱导发生及再生体系发生过程a.未成熟种子材料；b.成熟种子材料；c.诱导萌发种子材料；d-e.诱导膨大；f.鱼雷形胚状体；g.球形胚状体；h-i.体细胞胚分化、增殖；j.嵌合胚状体发育；k.单个胚状体成熟；l-m.胚状体子叶簇；n.茎叶器官发育；o.茎器官伸长、生根图2木薯种子不同组织材料体细胞诱导发生及再生体系发生过程的差异性分析（Duncan'sanalysis,"*",P＜0.05,"**",P＜0.01）Ⅰ.诱导膨大，萌发种子胚芽（b3）呈现极显著性差异；Ⅱ.诱导体细胞，萌发种子胚轴（c3）、成熟种子胚芽（b2）和萌发种子胚芽（b3）之间呈极显著性差异，不同激素水平对成熟种子胚芽（b2）的结果呈现极显著性差异；Ⅲ.诱导体细胞胚胎分化、增殖，混合激素水平对子叶（a）、胚芽（b）和胚轴（c）的诱导结果均呈极显著性差异；Ⅳ.诱导体细胞成熟及子叶器官发育，萌发种子胚芽（b3）呈现极显著性差异，成熟种子胚芽（b2）呈现显著性差异；Ⅴ.诱导茎叶器官发育及生根，萌发种子胚芽（b3）呈现极显著性差异。表1木薯种子组织材料体细胞胚胎诱导发生率处理诱导率，%a1a2a3b1b2b3c32,4-D(4.00mg/L)/3.3313.336.6736.6753.3350.00Picloram(12.00mg/L)/6.6713.3310.0030.0053.3333.33六、国内同类标准制修订