HBV感染不同临床阶段的肝脏空间转录组研究

HBV感染不同临床阶段的肝脏空间转录组研究摘要乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus,HBV）感染严重威胁全球公共卫生健康，常发展为慢性乙型肝炎、肝硬化甚至肝癌。尽管疫苗接种和核苷类似物等药物治疗在一定程度上起到预防和治疗作用，但仍无法完全消除乙型肝炎表面抗原（HBsAg），这也导致了患者需要终身用药。因此，HBV感染的治疗仍然具有挑战性，开发新的治疗手段迫在眉睫。本研究收集了14例HBV感染不同临床阶段的肝脏组织活检样本，包括2例ENEG（HBeAg-negativechronichepatitisB）时期样本，3例IA（ImmuneActive）阶段样本，3例IC（InactiveCarrier）阶段样本，3例IT（ImmuneTolerant）阶段样本以及3例CT（Control）非HBV感染对照样本，并对这14例样本进行空间转录组测序。空间转录组数据分析结果揭示了HBV感染不同临床阶段的空间转录组学、细胞空间分布特征以及病毒感染情况的差异。具体而言，本研究发现HBV感染ENEG、IC和IT阶段肝脏代谢通路普遍下调，ENEG和IA阶段上调脂蛋白组装等相关通路，此外，IA阶段还上调免疫炎症相关通路，提示HBV感染可能导致肝脏代谢功能紊乱以及免疫炎症反应。HBV感染ENEG和IA阶段样本HE染色结果显示肝脏发生脂肪病变和肝细胞肿胀变性，同时ENEG时期肝细胞下调脂质分解代谢相关通路，IA时期肝细胞上调脂质生物合成代谢相关通路，还表现出高水平的死亡打分。最后，我们探索了肝星状/成纤维和内皮细胞间的细胞通讯，发现HBV感染ENEG和IA时期由促纤维化相关分子信号介导的肝星状/成纤维和内皮细胞间相互作用增强。这些信号包括玻连蛋白VTN信号、血小板反应素THBS信号、层粘连蛋白LAMININ信号、胶原蛋白COLLAGEN信号、血小板源性生长因子PDGF信号，NOTCH信号、纤维黏连蛋白-1FN1等。我们空间共定位了内皮细胞与肝星状/成纤维细胞以及JAG1-NOTCH2在内皮细胞与肝星状/成纤维细胞表达，进一步揭示了NOTCH信号在促进肝纤维的可能作用。本研究揭示了HBV感染不同阶段空间转录组学差异，综合探索了HBV感染不同临床阶段诱导的代谢功能失调、免疫炎症反应、肝损伤和肝纤维化。这些结果将进一步加深我们对HBV感染诱导相关疾病发生的理解，有利于指导HBV感染临床治疗。关键词：乙型肝炎病毒；慢性乙型肝炎病毒感染；空间转录组学；肝纤维化；肝损伤

SPATIALTRANSCRIPTOMICSTUDYOFTHELIVERATDIFFERENTCLINICALSTAGESOFHBVINFECTIONABSTRACTHepatitisBVirus(HBV)infectionseriouslythreatensglobalpublichealthandoftendevelopsintochronichepatitisB,livercirrhosisandevenHepatocellularcarcinoma.Althoughvaccinationanddrugtreatmentssuchasnucleosideanaloguesplayapreventiveandtherapeuticroletosomeextent,theystillcannotcompletelyeliminatehepatitisBsurfaceantigen(HBsAg),whichalsoleadstotheneedforlifelongmedication.Therefore,thetreatmentofHBVinfectionremainschallenging,andthedevelopmentofnewtreatmentmethodsisextremelyurgent.Inthisstudy,14livertissuebiopsysamplesfromdifferentclinicalstagesofHBVinfectionwerecollected,including2samplesfromthestageENEG(HBeAg-negativechronichepatitisB)and3samplesfromthestageIA(ImmuneActive),3samplesfromstageIC(InactiveCarrier),3samplesfromstageIT(ImmuneTolerant),and3samplesfromstageCT(Control).Spatialtranscriptomesequencingwasperformedonthese14samples.Theresultsofspatialtranscriptomedataanalysisrevealedthedifferencesinspatialtranscriptomics,cellularspatialdistributioncharacteristics,andviralinfectionstatusatdifferentclinicalstagesofHBVinfection.Specifically,thisstudyfoundthatthelivermetabolicpathwaysintheENEG,ICandITstagesofHBVinfectionweregenerallydownregulated.TheENEGandIAstagesupregulatedrelatedpathwayssuchaslipoproteinassembly.Inaddition,theIAstagealsoupregulatedimmuneinflammation-relatedpathways,suggestingthatHBVinfectionmayleadtolivermetabolicdysfunctionandimmuneinflammatoryresponses.TheHEstainingresultsofsamplesinstageENEGandIAofHBVinfectionshowedthatfattylesionsoccurredintheliverandhepatocyteswellinganddegenerationtookplace.Meanwhile,duringthestageENEG,hepatocytesdownregulatedthelipidcatabolismrelatedpathways,andduringstageIA,hepatocytesup-regulatedthelipidbiosynthesisrelatedpathways,andalsoshowedahighlevelofdeathscore.Finally,weexploredthecellularcommunicationbetweenhepaticstellate/fibroblastsandendothelialcellsandfoundthattheinteractionbetweenhepaticstellate/fibroblastsandendothelialcellsmediatedbypro-fibroticrelatedmolecularsignalswasenhancedduringtheENEGandIAstageofHBVinfection.ThesesignalsincludetheVTN(Vitronectin)signal,theTHBS(Thrombospondin)signal,theLAMININsignal,theCOLLAGENsignal,thePDGF(platelet-derivedgrowthfactor)signal,theNOTCHsignal,FN1(Fibronectin-1)signal,etc.Wespatiallyco-localizedendothelialcellsandhepaticstellate/fibroblasts,aswellastheexpressionofJAG1-NOTCH2inendothelialcellsandhepaticstellate/fibroblasts,furtherrevealingthepossibleroleofNOTCHsignalinginpromotinghepaticfibrosis.ThisstudyrevealedthespatialtranscriptomicdifferencesatdifferentstagesofHBVinfectionandcomprehensivelyexploredthemetabolicdysfunction,immuneinflammatoryresponse,liverinjuryandliverfibrosisinducedbyHBVinfection.TheseresultswillfurtherdeepenourunderstandingoftheoccurrenceofrelateddiseasesinducedbyHBVinfectionandareconducivetoguidingtheclinicaltreatmentofHBVinfection.Keywords:HepatitisBvirus;ChronichepatitisBvirusinfection;Spatialtranscriptomics;Liverfibrosis;LiverdamageHBV感染不同临床阶段的肝脏空间转录组研究第1章前言研究背景1.1.1HBV感染流行病学特征乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus,HBV）感染是全球范围的公共卫生问题，同样也是肝硬化、肝癌和病毒性肝炎死亡的常见原因[1]。研究估计2024年全球有2.54亿人感染乙型肝炎病毒，约82万人死于乙型肝炎相关疾病[2]。世界卫生组织2024年全球肝炎报告显示，中国乙型肝炎病毒感染者占全球乙型肝炎病毒感染的三分之一，约有7500万人罹患乙肝[3]。乙型肝炎病毒感染仍然是中国乃至全球公共卫生健康的严重隐患，尽管中国在控制乙型肝炎病毒感染方面取得了实质性进展，但早期诊断上的差距和抗病毒治疗覆盖不足的弊端，仍严重阻碍世界卫生组织2030年消除病毒性肝炎这一目标的实现。 1.1.2HBV感染现阶段临床治疗手段HBV感染临床治疗近年来已取得一定的进展，但仍缺乏可行的特异性治疗方法。当前HBV治疗仅能减缓肝硬化和肝纤维化发展速度，减少向肝癌的发展和延长生存时间，仍不能完全达到功能性治愈，即HBsAg丢失，检测不到HBVDNA，ALT水平恢复正常，伴有或不伴有乙肝表面抗体血清转化[4,5]。目前，临床上用于治疗HBV感染的药物包括聚乙二醇化干扰素（Pegylatedinterferonalfa）和核苷类似物包括恩替卡韦（Entecavir）、富马酸替诺福韦（Tenofovirdisoproxilfumarate，TDF）、富马酸丙酚替诺福（Tenofoviralafenamidefumarate,TAF）以及艾米替诺（Tenofoviramibufenamide,TMF）[4,6]。然而聚乙二醇化干扰素和核苷类似物都具有明显的局限和缺点，聚乙二醇化干扰素可能会导致流感样综合征、骨髓抑制以及自身免疫病等不良反应，此外，聚乙二醇化干扰素有大量禁忌症包括精神病史、心力衰歇等[7,8]。而核苷类似物服药周期长，停药后复发率高[9]。Wong等人总结了目前正在研究中的潜在HBV治疗药物[10]，这些药物可能会成为HBV治疗的有利手段，但目前这些药物开发仍处于临床试验阶段，它们主要包括4类：抗病毒药物如衣壳组装调制剂，翻译抑制剂如小干扰RNA，免疫调节剂如先天免疫激活剂TLR7激动剂、适应性免疫激活剂检查点抑制剂，直接作用与共价闭合环状DNA的方法如转录抑制剂。因此，开发高效新型HBV治疗药物刻不容缓。1.1.3HBV基因组结构HBV是一种直径为42nm的有包膜的DNA病毒,属于嗜肝病毒科，通过肝细胞表面的牛磺胆酸钠共转运蛋白或叫做钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白（Sodium-TaurocholateCotransportingPolypeptide,NTCP）侵袭肝细胞[11]，并可通过母婴传播、体液传播（包括血液，唾液，精液，阴道分泌物等），具有较强传染性。其基因组由长度为3200个碱基的松弛环状DNA构成，DNA分子由完整的负链和不完整的正链组成。在HBV基因组中，有四个相互重叠且产生特定病毒蛋白的开放阅读框（OpenReadingFrames,ORFs），分别为S、C、P、X。这四个开放阅读框分别编码乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg）与乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）、DNA聚合酶和、HBx蛋白[12]。其中，HBsAg是主要的包膜蛋白，有大、中、小三种（L-HBsAg,M-HBsAg,S-HBsAg），他们从S开放阅读框的两个不同转录起始位点转录；HBeAg作为HBV诊断的重要靶点，由C开放阅读框转录翻译；HBcAg由前基因组RNA（pregenomicRNA,pgRNA）翻译，构成核衣壳；HBx蛋白由X开放阅读框专门编码[13]。1.1.4HBV生命周期HBV感染肝细胞的生命周期如下：HBV颗粒通过L-HBsAg的Pre-S1结构域与肝细胞表面的NTCP受体结合进入肝细胞，经历HBsAg剥离，形成无包膜的衣壳颗粒并将松弛环状DNA运送到细胞核。在宿主细胞核中松弛环状DNA转化为共价闭合环状DNA，并作为RNA转录的模板转录为mRNA和pgRNA，mRNA运送到细胞质翻译为各种蛋白质。随之HBc蛋白、pgRNA、聚合酶组装成衣壳颗粒，pgRNA在逆转录酶的作用下逆转录生成松弛环状DNA，最后含有双链松弛环状DNA的成熟衣壳可以被重定向到细胞核补充共价闭合环状DNA，也可以被HBsAg包裹形成病毒颗粒[13,14,15]，分泌到细胞外侵染其他肝细胞，从而实现HBV在宿主体内的复制。1.1.5HBV感染自然史在慢性乙型肝炎病毒感染的进程中，HBsAg、HBeAg、HBVDNA、ALT（丙氨酸氨基转移酶）水平处于动态变化，国际上根据HBsAg、HBeAg、HBVDNA、ALT的水平将HBV感染自然史分为5个临床阶段[7,15,16]。第一阶段：免疫耐受期（ImmuneTolerant,IT）或HBeAg阳性慢性感染期，该阶段特征是极高的HBVDNA水平（通常大于7log11IU/mL）和HBsAg水平（通常大于3log11IU/mL）以及持续正常的ALT水平，且没有免疫介导的肝损伤。第二阶段：免疫激活（ImmuneActive,IA）或者HBeAg阳性慢性乙肝期，该阶段特征是具有较高水平HBVDNA水平（5-7log11IU/mL）和HBsAg水平（大于3log11IU/mL）,同时ALT水平升高，血清转换为乙型肝炎e抗体，具有清除HBeAg能力。第三阶段：非活动性携带者（InactiveCarrier）或HBeAg阴性慢性感染期,该阶段特征表现出HBeAg阴性，乙型肝炎e抗体阳性，持续正常的ALT和普遍低水平的HBVDNA（小于2000IU/mL）和HBsAg（1000IU/mL）。第四阶段：HBeAg阴性、免疫激活期或HBeAg阴性慢性乙肝（HBeAg-negativechronichepatitisB,ENEG），该阶段特征是HBeAg缺失，乙型肝炎e抗体存在以及波动的HBVDNA水平（通常大于2000IU/mL）和通常升高的ALT水平。最后阶段：消退或隐性HBV感染（resolvedoroccultHBVinfection），该阶段HBsAg阴性及IgG乙型肝炎c抗体阳性，有或没有乙肝表面抗体，HBVDNA通常不会在患者血液中检测到，但在肝脏中持续存在并重新激活免疫抑制[17]。值得注意的是，HBV慢性感染自然史分期主要依据病毒学、生物化学及组织学特征，但尚缺乏直接的免疫学证据支持和免疫学指标界，所以该分期标准难以实现对所有患者进行分期。同时，并非所有患者都会经历这5个时期，且该分期与临床诊断名称并不完全一致[4]。综上，HBV慢性感染分期之间发展变化机制有待进一步阐述，尤其是免疫方面的相关机制，这有利于进一步在免疫层面对HBV慢性感染分期，也更有利于针对性的治疗。1.1.6HBV感染诱导肝脏纤维化机制HBV感染常伴随肝脏纤维化，肝脏纤维化是持续反复的肝损伤修复反应引起的细胞外基质非正常沉积的一种病理状态[18]。目前为止，肝纤维化发生的机制仍未完全明确[19]。肝纤维化与多种病理因素有关，包括肝细胞损伤、炎症反应、肝星状细胞激活以及细胞外基质过度积累。当肝细胞损伤后，释放炎症因子，诱导肝星状细胞激活，从而分泌细胞外基质[20]。HBV通过损伤肝细胞引起炎症反应诱导肝纤维化：HBV.X蛋白以髓样分化初级应答蛋白（myeloiddifferentiationprimaryresponseprotein88,88MyD88）依赖性通路刺激白介素6（IL-6）产生，加重炎症反应[21]；HBV感染晚期肝纤维化患者中肝Th17细胞和调节性T细胞富集可能由于肝星状细胞通过前列腺素E2（PGE2）/前列腺素E受体2（EP2）和前列腺素E受体4（EP4）通路调节，进而加重炎症反应[22]；HBV导致肝细胞损伤后，细胞损伤和激活免疫细胞产生的促炎因子、生长因子和细胞因子（如血小板衍生生长因子、结缔组织生长因子、转化生长因子-β和白细胞介素-13）激活间充质前体细胞诱导其转分化为肌成纤维细胞[23]；慢性HBV感染体内M2免疫调节样巨噬细胞积累，且在急性HBV感染导致的肝衰竭患者中发现M2免疫调节样巨噬细胞能加速肝脏纤维化[24]。Bai等人结合单细胞转录测序解析HBV感染肝硬化患者免疫微环境，具体表现为macrophage-CD9/IL18,macrophage-C1QA,NKCell-JUNB,CD4+Tcell-IL7R的积累和Bcell-IGLC1的丢失，表明HBV肝硬化与活化髓系细胞的积累和NK细胞的细胞毒性受损有关[25]；此外HBV感染后会刺激库普弗细胞产生促纤维化因子/抗炎因子TGFβ1[26],TGFβ1是肝星状细胞的激活因子，促进促纤维化基因表达，促进纤维化进程。RamachandranP等人在肝硬化病人中识别到促进纤维化的新亚群：TREM2+CD9+巨噬细胞，并提出TNFRSF12A、PDGFR和NOTCH信号通路在人类肝脏纤维化生态位间充质细胞功能的重要调节功能，加深了对肝纤维化的机制理解[27]。HBV感染除通过免疫炎症促进纤维化之外，还可通过肝细胞分泌生长因子和外泌体导致肝星状细胞激活：ARRB1通过调节自噬溶酶体/多泡体通路和Rab27A上调肝细胞来源的甘露多糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶1（MASP1）富集的细胞外囊泡，肝细胞来源的MASP1通过p38MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）/ATF2（激活转录因子2）信号传导促进肝纤维化激活肝星状细胞[28]；HBV.X蛋白激活JNK（氨基末端激酶）和ERK（细胞外信号调节激酶）通路，诱导SATB1表达，促进分泌结缔生长因子（CTCF）、白细胞介素6（IL-6）和血小板源性生长因子A（PDGF-AA）促进肝星状细胞激活[29]。Krenkel等人[30]以及Dobie等人[31]研究表明肝纤维化还与肝星状细胞活化相关。由此可知，HBV诱导肝纤维化十分复杂，仍发生机制仍未完全明确。在该研究中，我们将从空间转录组的角度出发，探究由配受体介导的肝纤维化，并以较高的分辨率展示配受体空间共定位关系，丰富人们对肝纤维化的理解。1.1.7HBV感染诱导免疫反应变化目前，HBV感染致病机制仍未完全阐明，HBV感染并不会直接导致肝细胞损伤和死亡，病毒引起的免疫炎症反应是HBV致病的主要机制[4]。MontanariNR等人结合RNA-seq和多重免疫荧光染色比较了HBV慢性感染四个时期（IA，ENEG，IT，IC）与健康对照的免疫组成和转录图谱[32]。结果显示慢性HBV感染样本免疫基因表达量和表达频率高于对照，干扰素刺激基因、免疫激活和衰竭基因以及趋化因子在IA和ENEG被显著诱导，同时慢性HBV感染表现出肝代谢功能衰竭[32]，全面地剖析了慢性HBV感染与对照间免疫组成的差异。Zhang等人利用单细胞测序技术揭示了免疫激活（ImmuneActive,IA）和急性恢复（AcuteRecovery,AR）耗竭CD8+T细胞（ExhaustedCD8+Tcells,Tex）不同来源和免疫细胞互作差异，以及HBV感染不同阶段的肝内和外周血免疫特征差异[33]，揭示了HBV免疫发病新机制。Jiang等人探究了聚乙二醇化干扰素（PegIFN-α）对慢性乙型肝炎患者外周血免疫系统的作用，PegIFN-α治疗将免疫细胞转录谱从肿瘤坏死因子（TumorNecrosisFactor，TNF）驱动转换为α干扰素（Interferonα,IFN-α）驱动并增强先天抗病毒反应，阐述了PegIFN-α治疗慢性乙型肝炎患者的免疫机制[34]。Shi等人研究在慢性HBV感染小鼠内皮细胞的功能异质性，揭示了VISFATIN/Nampt信号在调节内皮细胞特征与相关肝脏炎症中的重要作用[35]。综上，HBV感染诱导免疫炎症反应机制同样十分复杂，尽管已有大量研究指出HBV感染后免疫系统发生的变化及其机制，但HBV感染不同临床阶段免疫系统是否发挥不同的免疫功能以及如何发挥病毒清除功能尚未可知。1.1.8转录组学在探究乙肝病变机理的应用HBV感染常伴随着严重免疫炎症反应、肝细胞坏死、肝纤维化、肝功能衰竭和肝硬化等严重的生理病变。目前转录组学技术在HBV感染领域的应用，主要依赖Bulk-RNA测序和单细胞测序，比较缺乏HBV感染的空间转录组研究以及较高分辨率的空间维度的细胞相互作用。MontanariNR[32]等人通过研究HBV感染ENEG、IC、IA和IT阶段患者的转录组差异，揭示了HBV感染阶段表现出更强的免疫炎症反应和白细胞浸润，也表现出免疫耗竭的特征，同时代谢功能下降。但该研究并未涉及HBV感染导致的免疫细胞的异质性，HBV感染诱导的免疫细胞间相互作用尚未可知。ShengxiaYin[36]等人结合单细胞测序技术揭示CTLA4直接结合SHP-1，导致JAK-STAT和B细胞受体信号通路受损，从而导致HBV慢性感染患者B细胞缺陷。YueZhuo[37]等人通过单细胞测序首次发现LMO2可能与慢性HBV感染中单核细胞增殖相关，并识别出一个与纤维化密切相关细胞亚群：单核细胞-血小板聚集体（MPA）。FrancesWinkler[38]等人通过研究HBV和HCV特异性T细胞的代谢状态和耗竭状态，首次识别烯醇化酶作为耗竭性T细胞的代谢调节因子，并展示了代谢旁路如何改善糖酵解和T细胞效应功能，加深了我们对T细胞耗竭机制的理解。XiaoqiYu[39]等人结合空间转录组测序技术和实时qPCR技术，从空间转录组视野出发，发现了HBV基因随机整合到宿主染色体上，且可以整合到ALB、CLU和APOB等肝癌发生相关基因上，但该研究并未深入探究HBV感染引发的病变相关机制。综上所述，Bulk-RNA和单细胞转录组测序技术在HBV感染领域研究已广泛使用，而HBV感染的空间转录组研究相对缺乏。Bulk-RNA和单细胞转录组测序缺乏组织原本的空间位置信息，细胞组织定位和精细的细胞间相互作用信息难以获取。空间转录组在解析组织不同细胞的异质性的基础上，具备空间位置信息，能更大程度上加深对疾病机制的理解。而在现今市面上的空间转录组测序技术中，华大自主研发的Stereo-seq比其他空间转录组测序技术如Visium、DBIT-seq、Slide-seqV2、HDST、Seq-scope有更高的分辨率、更广的捕获覆盖面积以及更高的基因捕获效率[40]。1.1.9华大Stereo-seq时空转录组测序技术目前，转录组测序技术已十分成熟。BulkRNA测序技术能表征组织基因平均表达量，单细胞转录组测序能够解析组织内不同细胞的基因表达异质性，而空间转录组测序技术在单细胞转录组测序的基础上，具备组织原本的空间位置信息，为疾病发生发展提供新见解。Spatialenhancedresolutionomics-sequencing（Stereo-seq）是由华大自主研发的空间转录组测序技术，其基本原理是利用DNA纳米球（DNANanoBall,DNB）阵列芯片对组织内核酸分子的原位捕获。每个DNA纳米球直径约220nm，相邻DNA纳米球中心距离为500nm，且DNB上连接有随机序列的空间标识（CoordinateIdentity,CID）、独特的分子标识（UniqueMolecularIdentifiers,UMI）和polyT，它们分别用于记录每个DNB的空间坐标信息，区分RNA分子以及捕获mRNA。当组织切片（约10μm厚）贴到芯片表面，经过固定、透化、RNA捕获、反转录以及文库制备等空间组实验后得到上游空间转录组测序数据[40]。相比于其他已发布的空间转录组测序技术，Stereo-seq分辨率更高，捕获视野更广。不仅如此，Stereo-seq还支持多种特异性捕获探针，用户可根据样本核酸分子的特点特异性设计捕获探针。如本项目依托于针对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本的华大空间转录组测序技术（StereoseqFFPE），由于FFPE样本RNA存在降解，PolyT探针捕获效率较低，因此设计随机引物探针捕获FFPE样本的RNA分子。图1-1Stereo-seq空间转录组测序技术原理（Chen,Aoetal.,2022）1.2主要研究内容本研究采集慢性乙型肝炎四个时期（IA,IT,IC,ENEG）的11例感染肝穿刺样本和3例未感染HBV的对照肝穿刺样本（CT）进行空间转录组测序。从空间转录组角度出发，研究HBV感染不同临床阶段肝脏的空间转录组差异，探究不同HBV感染阶段与肝纤维化、肝损伤相关的重要分子、调控因子以及关键信号通路，为理解HBV感染宿主机制和开发疾病治疗手段提供新的见解。科学问题本研究期望回答以下科学问题：1）.HBV感染肝脏微环境中细胞组成和空间定位如何？不同HBV感染临床阶段是否存在差异？2.）HBV感染不同临床阶段空间转录组差异？3）.HBV感染后肝脏发生哪些病理变化？哪些分子可能驱动这些变化？4）.HBV感染后细胞间相互作用发生哪些变化？不同细胞类型如何相互作用？1.2.2技术路线本项目将对HBV感染不同临床阶段的肝脏样本展开空间转录组分析，探究HBV感染不同临床阶段空间转录组差异。具体技术路线及实验设计如图1-2所示。图1-2技术路线与实验设计第2章材料与方法2.1样本收集本研究HBV感染样本和非HBV感染对照样本均来自于合作单位中山大学附属第五医院，非HBV感染对照样本来源于胆石症、急性髓系白血病、继发性肺结核等非HBV感染患者，且所有样本均通过伦理审查。HBV感染临床分组由合作单位临床指标鉴定。2.2空间转录组实验FFPE肝组织活检样本由切片机切割为厚度5μm左右的切片，保证切片展平无褶皱后将切片铺贴在Stereo-seq芯片上，并记录芯片编号。随后对切片进行固定、脱蜡和H&E染色，选择荧光显微镜进行H&E拍照，通过调整合适的模式、灯光、增益和曝光以及粗细准焦螺旋，使得组织形态和track线清晰可见。框选所需组织区域对焦后选择4-6个建模点进行手动建模，扫描切片后保存图像。最后使用StereoMap软件进行图像质量评估，通过质量评估的H&E图像方可开展图像分析。H&E拍照完成后对Stereo-seq芯片进行脱色和解交联，将脱色和解交联后的Stereo-seq芯片用甲醇固定，透化剂进行透化，加入FFPEMIX反应液42℃过夜孵化5-12h，期间随机探针可原位捕获组织中的RNA分子并进行逆转录获得cDNA。之后加入cDNAReleaseBuffer释放回收cDNA并使用磁珠进行cDNA纯化，cDNA纯化产物片段分布检测通过便可进行TEBuffer扩增cDNA获得时空测序文库，使用华大DNBSEQ-T7系列高通量测序仪完成测序，得到原始序列文件。2.3空间转录组测序下机数据SAW处理流程SAW（Stereo-seqAnalysisWorkflow,/STOmics/SAW）软件包整合了多个Stereo-Seq空间组基因表达分析工具，用于还原和可视化测序数据在芯片上的空间表达信息，这里我们使用SAWV6软件包，处理空间转录组测序数据，得到下游空间表达矩阵。SAW软件包的mapping工具输入Stereo-seq原始测序FASTQ文件和Stereo-seq芯片mask文件以及参考基因组（HBV&human）索引文件,将FASTQ原始reads的CID与Mask文件中的CID坐标键值配对，为reads添加坐标信息，过滤未匹配CID的reads得到CleanReads，并将其与人类基因组（hg18）和HBV基因组（GenBank:KC315399.1）[41]进行比对。将多个mapping分析结果使用merge工具进行合并，得到映射后CID列表文件，CID列表文件存储每个reads的坐标信息。随后利用count工具输入mapping比对结果和参考基因组注释文件，对mapping结果进行基因注释并量化，计算每个位置每个基因的表达量水平（包括内含子和外显子的MID数量总和），生成基因表达矩阵。使用StereoMap软件手动配准，将基因表达矩阵和ImageStudio处理的H&E染色图像以及H&E影像图图像报告为输入，在H&E影像图与count输出的基因表达矩阵间建立图像与空间表达的映射关系，并通过套索工具（lasso）圈选组织边界，分离芯片上单个组织的表达矩阵。套索得到单个样本gem格式的表达矩阵文件后使用R语言将gem格式的表达矩阵转化为Seurat对象，使用bin50作为分析单元，使用R包SeuratV4进行后续harmony去批次、标准化、归一化、降维、聚类，聚类分辨率选择0.5，对前20个PCA主成分进行降维。2.4反卷积细胞注释由于空间转录组测序数据尚未达到单细胞分辨率，仅基于marker基因的表达进行细胞注释存在一定缺陷。我们参考目前已发表的肝脏单细胞数据集[42,43]，借助R包spacexr（V2.2.0）反卷算法RCTD（Robustcelltypedecomposition）将单细胞数据细胞类型分配给空间转录组数据，并计算每个bin中已知细胞的占比，给每个bin分配概率最大的单种细胞和双种细胞类型[44]。RCTD反卷积细胞类型存储在@results$results_df中，储存列明为first_type和second_type。这里我们运行RCTD反卷积算法double模式并将预测分配的first_type作为空间转录组细胞类型注释，为了确保空间组芯片中反卷积细胞注释的准确性，我们还根据空间组芯片中细胞类型marker基因表达情况、参考单细胞数据中细胞类型和空间组芯片中细胞类型间相关性以及空间组芯片中细胞类型的差异基因功能富集对空间组芯片中细胞注释结果进行纠错和验证。最后将空间组芯片中细胞类型注释为B细胞（B_Cells）、胆管上皮细胞（Cholangiocyte）、内皮细胞（Endothelial）、肝细胞（Hepatocyte）、肝星形/成纤维细胞（HSCs_Fb）、库普弗细胞（Kupffer）、中性粒细胞（Neutrophil,）、自然杀伤细胞（NK_Cells,）、浆细胞（Plasma）、T细胞（T_Cells）。2.5病毒阳性bin鉴定空间转录组测序技术成功捕获到了HBVDNA并表征了病毒表达特征。我们将四个HBV基因X、P、C、S表达量均大于0的bin鉴定为病毒阳性bin，并计算了病毒阳性率。病毒阳性率=病毒阳性bin数量/所有样本中bin数量*100%。2.6差异基因分析我们首先基于整张芯片分别进行了HBV感染组（ENEG,IA,IC,IT）与非HBV感染对照组CT差异基因的比较，FindMarkers函数被用来计算组间差异基因，差异倍数阈值参数设置logfc.threshold=0.01并使用wilcox方法进行显著性检验。肝细胞组间差异基因比较和肝星状/成纤维细胞组间差异基因比较同样采用FindMarkers函数和相同的参数。空间组芯片中细胞类型间差异基因识别采用FindAllMarkers函数计算，差异倍数logfc.threshold=0.01，显著性检验方法为wilcox检验，assay="Spatial"。在所有差异基因分析中，我们将|log2fc|>0.25且pvalue<0.05的基因鉴定未显著差异表达基因。2.7基因本体论功能富集分析R包clusterProfilerenrichGO函数[45,46]被用来运行GO（Geneontology）富集分析，差异基因集作为函数输入，分类选择生物学过程（BiologicalProcess,BP），函数参数选用默认参数。2.8基因集打分我们使用GSVA（GeneSetVariationAnalysis）方法进行基因集打分，具体执行使用R包GSVA（V1.46.0）中gsva函数，参数设置kcdf="Gaussian"，method="gsva"，其余参数选用默认参数。细胞焦亡、吞噬作用、氧化应激、程序性坏死、线粒体自噬、铁死亡、细胞凋亡等细胞死亡基因集来源于已发表文章[47,48]，其余基因集来源于GSEA数据库（/gsea/index.jsp）和Geneontology数据库（/）。2.9细胞通讯细胞间相互作用使用CellChat（v.1.6.1）R包分析[49]，以表达矩阵、细胞空间位置信息和细胞分组信息作为输入。我们使用bin50作为分析单元，bin50占面积约24.72μm*24.72μm。createCellChat函数中spatial.factors包含两个距离因子和的数据框，依赖于空间转录组学技术，这里根据bin50分辨率设置。computeCommunProb函数参数设置为raw.use=TRUE，population.size=TRUE，type="truncatedMean"，distance.use=TRUE，contact.knn.k=6，scale.distance=1。其余参数均使用默认参数。细胞通讯分析参考针对空间转录组数据的细胞通讯标准分析流程（https://htmlpreview.github.io/?/jinworks/CellChat/blob/master/tutorial/CellChat_analysis_of_spatial_transcriptomics_data.html）完成细胞通讯预处理、细胞通讯网络推断、细胞通讯可能性计算、以及可视化。第3章研究结果3.1HBV感染不同临床阶段肝脏的细胞组成3.1.1空间细胞类型注释我们收集了14个肝脏组织活检样本，包括3个HBV感染IA阶段样本、3个HBV感染IT阶段样本、3个HBV感染IC阶段样本、2个HBV感染ENEG阶段样本以及3个非HBV感染对照样本。使用Stereo-seq[40]空间转录组测序技术对这14个样本进行空间转录组测序，获得14个样本的空间基因转录表达谱。Stereo-seq测序技术中每个DNA纳米球直径约为220nm，相邻DNA纳米球中心距离约为500nm，下游空间组分析采用bin50作为空间分析单元，即以50个DNA纳米球为边长的正方形，覆盖面积24.72μm*24.72μm。bin50分辨率下样本基因检测平均数在281-1328不等，基因检测中位数在279-1313不等（表1）。样本检测到UMI（Uniquemolecularidentifier）中位数和基因中位数在几百到几千不等（附图-1C&D），样本线粒体基因表达比例中位数均低于10%（附图-1E）。表1bin50分辨率下样本基因数量样本编号芯片号病理分期样本位置bin50数量bin50基因平均数Bin50基因中位数样品bin50数量1-1C03030F1CTF1R4,3498578544,3491-2C03030F1CTF1C6,2558998926,2551-3C03030F1CTF1L13,19264662813,1922-1C03027D1ITD1R9,6036266169,6032-2C03027D1ITD1C6,5697126996,5692-3C03027D1ITD1L8,9647206978,9643-1C03027D2IAD2R12,5501,1851,19512,5503-2C03027D2IAD2C12,3011,3281,31312,3013-3C03027D2IAD2L11,05159758311,0514-1C03036E1ICE1R141724-2C03036E1ICE1C11,38862560711,3884-3C03036E1ICE1L6,9582812796,9585-1C03137A3ENEGA3R9,2877386899,2875-3C03137A3ENEGA3L10,16368166010,163样本经过上游质控、整合、去批次后进行细胞类型注释。细胞类型注释利用R包spacexr（V2.2.0）反卷算法RCTD（Robustcelltypedecomposition）[44]，以MacParlandSA[42]等人和HatjeK等人[43]发表的肝脏单细胞数据集作为参考单细胞数据集并根据空间组芯片中细胞类型marker表达情况进行矫正和辅助（图3-1，附图-1A&B）。空间组芯片中细胞类型marker表达较为特异，但由于数据质量和免疫细胞数量限制，marker基因表达比例较低。反卷积细胞注释识别到10种细胞类型（图3-2），包括B细胞（B_Cells）、胆管上皮细胞（Cholangiocyte）、内皮细胞（Endothelial）、肝细胞（Hepatocyte）、肝星形/成纤维细胞（HSCs_Fb）、库普弗细胞（Kupffer）、中性粒细胞（Neutrophil,）、自然杀伤细胞（NK_Cells,）、浆细胞（Plasma）、T细胞（T_Cells）。为了进一步确认空间组芯片中细胞注释的准确性，我们计算了空间组芯片中细胞类型和参考单细胞数据集中细胞类型的相似相关性（图3-3），结果显示了空间组芯片中内皮细胞、库普弗细胞、肝细胞、肝星状/成纤维细胞、B细胞与参考单细胞数据集中内皮细胞、库普弗细胞、肝细胞、肝星状/成纤维细胞、B细胞间高度正相关。尽管空间组芯片中胆管上皮细胞、T细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞与浆细胞和参考单细胞数据中胆管上皮细胞、T细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞与浆细胞间没有显著相关性，但空间组芯片中胆管上皮细胞与参考单细胞数据中胆管上皮细胞间相关性仍是胆管上皮细胞与所有细胞间相关性最特异的。空间组芯片中T细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞与浆细胞间与参考单细胞数据中对应细胞间没有显著相关性可能是由于空间组芯片数据中免疫细胞数量少，表达免疫细胞特征基因比例少。此外，我们还对空间组芯片中反卷积注释的细胞类型间差异基因进行了基因本体功能富集分析，结果显示空间组芯片中反卷积细胞注释结果与基因本体功能富集结果较为吻合，进一步证实了空间组芯片中反卷积注释的细胞类型的准确性（附图-1F）。图3-1空间组芯片中细胞类型marker基因表达。点的颜色表示基因的平均表达量，点大小表示基因表达比例图3-2空间组芯片中细胞类型注释结果。不同颜色表示不同细胞类型，横轴和纵轴表示空间位置坐标图3-3参考单细胞细胞类型与空间组细胞类型间相似相关性，相关性系数为斯皮尔曼相关系数，*表示pvalue<0.05,**表示pvalue<0.01,***表示pvalue<0.001。颜色表示相关性，点的大小表示显著性3.1.2空间细胞类型比例变化细胞比例分析结果显示肝细胞是样本中主要的细胞类型，占总细胞数量的绝大多部分，而免疫细胞数量较少（图3-4A），这可能是与肝脏组织采样方式有关。与非HBV感染相比，我们发现HBV感染阶段肝星状/成纤维细胞、B细胞比例上升，而内皮细胞和胆管上皮细胞比例下降，尽管显著性检验表明并不存在显著差异，但仍存在肝星状/成纤维细胞、B细胞比例上升，内皮细胞和胆管上皮细胞比例下降的趋势（图3-4B&C）。与非HBV感染相比，HBV感染ENEG阶段内皮细胞和肝星状/成纤维细胞比例显著下降，但这可能并不能完全代表整个肝脏真实的细胞比例变化。综上，我们解析了HBV感染肝脏组织的细胞组成和比例变化，这将有利于我们进一步分析HBV感染相关机制以及解析细胞间相互作用。图3-4A.不同肝脏样本细胞比例条形图，颜色表示不同细胞类型；B.非肝细胞在不同HBV感染阶段的细胞比例，颜色表示不同细胞类型，子图A&B共用图例；C.细胞、胆管上皮细胞、内皮细胞以及肝星状/成纤维细胞在不同阶段细胞比例箱线图，不同颜色表示不同HBV感染临床阶段，NS表示组间无显著差异，*表示pvalue<0.053.2HBV基因检测情况和病毒阳性率统计3.2.1HBVDNA空间表达情况空间转录组测序技术不仅在神经科学、癌症研究、生长发育等多个研究领域具有广泛应用前景，在病原感染领域同样有无限潜力，有利于揭示病原-宿主相互作用，从而解析病原致病机制。同时还能根据病原体遗传物质的特点特异性设计不同的捕获探针，实现高精度病原临床检测。在HBV感染肝脏活检组织样本中，我们通过空间转录组测序技术，成功捕获到了HBV基因，包括P基因、S基因、X基因以及C基因（表2）。空间转录组测序数据在HBV感染阶段均捕获到了HBV基因，而HBV感染IC阶段临床上并未检测到HBV基因，但在空间转录组数据上，我们仍检测到较高水平的HBV基因表达（表2），显示空间转录组HBV基因的检测甚至比临床HBV基因检测灵敏度更高，并且我们还发现HBV感染IA、ENEG和IT阶段检测到更高水平的HBV基因。不同样本病毒阳性bin占比结果显示HBV感染IA和ENEG时期阳性率更高（图3-5）。为了更好的体现HBV基因表达在组织中发空间表达分布特点，我们将HBV基因表达量映射到空间位置信息（图3-6），结果同样显示HBV感染IA、ENEG、IT阶段HBV基因表达量更高，但HBV基因表达弥散在整个芯片空间上，并未能得出HBV基因空间位置分布的特点。样本编号芯片号病理分期样本位置临床HBVDNA（IU/mL）HBV基因总数HBV.PHBV.CHBV.SHBV.X1-1C03030F1CTF1R0000001-2C03030F1CTF1C0000001-3C03030F1CTF1L0000002-1C03027D1ITD1R97,7541,2408214,1091,5842-2C03027D1ITD1C8.234,4735216122,4289122-3C03027D1ITD1L6.816,6201,8128782,9979333-1C03027D2IAD2R7.7136,1298,9035,09916,8735,2543-2C03027D2IAD2C863,75218,96910,74124,7379,3053-3C03027D2IAD2L8.2320,4433,0133,47410,1073,8494-1C03036E1ICE1R0408343285864-2C03036E1ICE1C01286280404-3C03036E1ICE1L0299641861035-1C03137A3ENEGA3R8.317,1912,4013,2658,4373,0885-3C03137A3ENEGA3L7.191,639194270867308表2样本HBV基因检测情况图3-5不同样本中病毒阳性bin占比，不同颜色表示不同样本。若某个bin中HBV四个基因表达量均大于0，则将该bin鉴定为病毒阳性bin。图3-6不同样本中HBVP、S、C、X基因表达总和在组织中的空间表达特征，颜色深浅表示HBV基因总表达量高低，颜色越红，表示HBV基因总表达量越高。3.2.2病毒阳性率统计HBV是一种嗜肝病毒[11]，其首要的感染细胞是肝细胞，但也有研究在外周血单核细胞中发现HBV基因，证实了外周单核细胞可能也是HBV感染的靶器官[50-52]。为了比较细胞的病毒检测阳性率，我们统计了每个bin中HBV基因表达量，若该bin中P基因、S基因、C基因以及X基因表达量均大于0，则鉴定该bin为HBV阳性bin。结果显示HBV感染IA和ENEG阶段病毒检测阳性率相对较高，而肝细胞、中心粒细胞、内皮细胞、B细胞、库普弗细胞以及肝星状/成纤维细胞是主要的病毒检测阳性细胞，其中肝细胞病毒检测阳性率最高（图3-7，图3-8）。中心粒细胞、内皮细胞、B细胞、库普弗细胞以及肝星状/成纤维细胞存在病毒检测阳性的细胞数量相对较少，但由于这些细胞数量较少，导致这些细胞总体病毒检测阳性率偏高。综上，我们统计了HBV基因在空间组芯片数据中的表达情况以及细胞病毒检测阳性率，结果显示空间组数据捕获HBV基因具有良好灵敏度，HBV感染阶段HBV基因检测量的差异。

图3-7不同HBV感染阶段细胞病毒检测阳性率柱状图，颜色表示不同HBV感染阶段图3-8不同HBV感染阶段细胞病毒检测阳性情况柱状图，红色表示病毒检测阳性，浅蓝色表示病毒检测阴性。3.3HBV感染诱导肝脏代谢紊乱和免疫炎症浸润3.3.1差异基因功能富集揭示肝脏代谢功能紊乱有研究指出肝代谢相关通路如脂肪酸代谢通路和胆汁酸代谢通路等在HBV感染各阶段，尤其是HBV感染IA和ENEG阶段下调[32]。为了在空间转录组角度探究HBV感染过程中可能发生的免疫反应和代谢紊乱，我们基于整张芯片，整体比较了HBV感染四个阶段与非HBV感染对照的差异表达基因（图3-9A）。由于数据质量限制，以Log2FC的绝对值大于0.25且p值小于0.05为标准，我们只鉴定到少量显著差异表达基因。ENEG阶段我们共鉴定到130个下调基因以及39个上调基因，IA阶段鉴定到12个下调基因和66个上调基因，IC阶段鉴定到129个下调基因和10个上调基因，IT阶段鉴定到28个下调基因以及13个上调基因（图3-9B）。在相对于非HBV感染对照组的差异表达基因中，我们发现HBVP基因、S基因、C基因和X基因在IA中表达上调，且差异倍数较高，与在HBV感染IA阶段检测到高水平的HBV基因一致，显示在HBV感染IA阶段HBV可能发生DNA复制等生命活动。图3-9A.相较于非HBV感染对照，HBV感染阶段上调和下调的基因，并展示每组Log2FC排名前10的基因名，Down表示下调，NS表示不显著，Up表示上调；B.HBV各感染阶段相对于CT组上调和下调基因数量差异基因功能富集分析指出ENEG时期上调极低密度脂蛋白颗粒重塑等脂蛋白组装、重塑和清除相关通路，此外，ENEG还上调磷脂转运调控和胆固醇代谢调控相关通路（图3-10A），说明HBV感染可能影响脂蛋白转化。有研究指出HBV感染影响肝脏分泌的脂蛋白代谢转化[53]。IA时期同样上调脂蛋白组装、重塑和清除相关通路以及磷脂转运调控和胆固醇代谢调控通路，不仅如此，IA阶段还上调甘油三酯、酰基甘油、中心脂质以及脂肪酸等有机物代谢过程通路，猜测可能与IA时期高水平的HBV基因表达复制等生命活动有关。有研究发现HBx蛋白通过与肝脏X受体α（LCRα）互作，增强LXRα与LXR反应元件（LXRE）结合，从而促进固醇调节元件结合蛋白1（SREBP1）的上调，诱导脂质积累[54,55]。也有研究显示TNFR1和NF-κB依赖性通路调节HBx介导的脂肪变性[56]。在HBV感染IC阶段，上调突触组装和组织相关通路，而IT阶段由于上调基因较少，并未显著富集到任何通路。在HBV感染时期下调基因功能富集中，我们发现HBV感染ENEG、IT和IC时期，均下调异生素代谢过程通路、氨基酸分解代谢过程通路、羧酸以及有机酸生物合成和分解代谢过程等代谢通路（图3-10B），更进一步表明HBV感染诱导肝脏代谢功能损伤。代谢相关通路基因表达进一步揭示了HBV感染阶段肝脏代谢功能下调。有趣的是，在HBV感染IA时期，观察到脂肪酸代谢和分解过程通路基因、脂质稳态通路基因以及羧酸生物合成过程通路基因上调（图3-11），猜测该阶段HBVDNA复制过程加快，需要的营养物质来满足HBV的生命活动。图3-10A.HBV感染阶段上调基因GOontology生物过程功能富集气泡图；B.HBV感染阶段下调基因GOontology生物过程功能富集气泡图图3-11GOontology生物过程功能富集结果中代谢相关通路基因差异表达热图3.3.2差异基因功能富集揭示IA阶段发生强烈免疫炎症反应大量HBV肝脏感染转录组学研究揭示HBV感染过程中复杂的免疫反应，如NoeRicoMontanari等人研究揭示免疫基因和炎症通路在IA和ENEG阶段富集[32]，ChaoZhang等人研究揭示HBV感染IA阶段以高水平的肝内耗竭CD8+T细胞为特征[33]，Wen-TaoWang等人同样指出HBV感染各时期自然杀伤细胞产生γ干扰素能力下降，ENEG时期促炎因子表达上调的特征[57]。通过HBV感染各阶段与非HBV感染差异基因的功能富集分析，我们发现IA阶段还上调免疫相关通路如补体激活、吞噬作用、急性炎症应答以及γ干扰素介导的通路等（图3-10A），同时IA时期还上调急性炎症反应、补体激活、病毒防御反应以及对干扰素应答相关基因（图3-12A）。为了进一步证明该发现，我们对GSEA数据库中关于细胞凋亡、补体、炎症反应、干扰素应答以及NF-κB介导的TNFA信号相关基因集进行了GSVA打分，结果显示相较于非HBV感染对照，HBV感染ENEG和IA时期显示更高水平的免疫得分，尤其是干扰素应答基因集在HBV感染IA时期显示出最高水平得分（图3-12B），揭示HBV感染IA时期发生强烈的免疫反应和炎症反应。这与我们在HE染色上观察到大量免疫细胞浸润的结果基本一致（图3-13A）。综上，我们通过分析HBV感染四个时期的差异基因、功能富集以及免疫打分，发现HBV感染诱导代谢紊乱，同时发现HBV感染IA时期具有较强水平的免疫炎症反应。图3-12A.GOontology生物过程功能富集结果中免疫相关通路基因在HBV感染不同临床阶段差异表达热图，颜色表示基因的平均表达水平；B.HBV感染不同临床阶段免疫相关基因集GSVA打分热图3.4HBV感染导致不同程度肝损伤3.4.1肝细胞代谢功能紊乱HBV持续慢性感染导致肝脏微环境中炎性细胞因子聚集[54,58]，募集炎性细胞到炎症部位，帮助机体清除病毒的同时会损伤肝实质细胞，从而引发炎症反应[59]，最终引发肝脏代谢紊乱、肝纤维化以及肝细胞坏死等。通过观察HBV感染肝脏组织活检样本HE染色，我们在ENEG和IA样本中观察到免疫炎症细胞浸润、脂肪变性以及肝细胞肿胀等变性（图3-13A）。为了探究肝细胞是否发生变性以及发生哪些变性，我们分别比较了HBV感染阶段与非HBV感染对照组中肝细胞之间的差异表达基因。在HBV感染IA阶段的肝细胞上调的差异基因中，HBV基因仍是显著上调基因（图3-13B），与肝细胞是主要的病毒阳性细胞结果基本一致。随后我们分析了HBV感染阶段上下调基因的功能富集（图3-14）。结果显示ENEG、IC和IT时期肝细胞普遍下调代谢相关通路，包括脂肪酸分解代谢过程、羧酸分解代谢过程、有机酸分解代谢过程、氨基酸分解代谢过程等通路，同时下调脂质分解代谢通路。在HBV感染ENEG阶段，可能由于HBV感染导致脂质分解代谢通路下降，脂质分解能力降低，脂质异常积累，引发脂肪变性。有趣的是，IA上调代谢相关通路，包括上调脂质和甘油三酯稳态通路，脂质存储通路、脂肪酸、胆固醇和羧酸生物合成过程通路，推测在HBV感染IA阶段，可能由于脂质存储通路和脂肪酸、胆固醇生物合成通路上调，导致脂质合成增多，脂质异常积累，从而引发脂肪变性。HBV感染ENEG和IA阶段差异基因功能富集结果与脂肪变性现象相符合。在HBV侵染肝细胞后，损伤的肝细胞激活和募集免疫细胞[60]，在肝细胞IA阶段上调的通路中，还发现肝细胞IA阶段上调细胞因子介导的信号通路、干扰素应答通路以及急性炎症应答通路，说明肝细胞在HBV感染免疫中发挥重要作用，并且HBV感染IA阶段样本的HE染色图像也能够观察到强烈的免疫细胞浸润的现象，再一次证明了HBV感染导致肝脏免疫激活，引发肝损伤。图3-13A.HBV感染IA和ENEG时期肝组织活检样本HE染色；B.相较于非HBV感染组的肝细胞，HBV感染各阶段的肝细胞上调和下调基因，Down表示下调，NS表示无显著差异，Up表示上调图3-14相较于非HBV感染组的肝细胞，HBV感染各阶段的肝细胞上调（A）和下调（B）基因GOontology生物过程功能富集。颜色表示qvalue，点大小表示富集到该通路的基因数。3.4.2肝细胞死亡由于在IA和ENEG时期的HE染色中观察到肝细胞明显的肿胀坏死，并且有研究指出HBx可以直接或间接增强死亡信号从而促进细胞凋亡[61]，也有研究指出肝细胞死亡水平与HBV感染肝内炎症和纤维化程度呈正相关[62]，此外还有研究揭示焦亡是HBV相关慢加急性肝衰竭肝脏的主要死亡方式[63]。于是我们收集了细胞焦亡、吞噬作用、氧化应激、程序性坏死、线粒体自噬、铁死亡、细胞凋亡等细胞死亡方式基因集[47,48],并通过GSVA打分的方式比较了肝细胞在非HBV感染对照与HBV感染四个阶段死亡方式得分（图3-15A）。GSVA打分结果显示了在上述提到的死亡方式中，所有死亡得分均在IA和ENEG时期得分最高，提示HBV感染IA和ENEG阶段肝细胞可能发生严重的细胞死亡。同时我们还发现HBV感染IA时期肝细胞高表达线粒体DNA以及损伤相关分子模式基因[64]（图3-15B）。损伤相关分子模式是由损伤或者缺氧组织或细胞释放的一种内源性危险信号，通过与模式识别受体结合激活先天免疫系统，监控细胞死亡、病原入侵以及应激反应[65-68]。研究指出，坏死的肝细胞能够释放损伤相关分子模式[69]，以提醒免疫系统应对潜在威胁从而促进免疫反应和肝损伤[70]，同时线粒体成分也是主要的内源性损伤相关分子模式的主要来源，其中包括线粒体DNA[69]。IA时期肝细胞高表达的线粒体DNA以及损伤相关分子模式与IA时期肝细胞高水平的死亡得分吻合，进一步揭示了HBV感染IA时期严重的肝细胞损伤。我们猜测HBV感染肝细胞线粒体损伤和裂解，从而释放大量的线粒体DNA和线粒体内容物，作为损伤相关分子模式激活免疫系统参与免疫反应和氧化应激。总之，我们在HBV感染IA和ENEG时期观察到脂肪变性，肝细胞肿胀等损伤，同时在空间转录组数据上证明了肝细胞脂质积累和代谢紊乱。此外，通过损伤相关分子模式和线粒体DNA表达以及死亡打分，揭示了IA和ENEG时期肝细胞出现死亡损伤。图3-15A.不同HBV感染阶段肝细胞死亡信号GSVA得分比较，不同颜色表示不同分组；B.肝细胞线粒体DNA和损伤相关分子模式基因差异表达热图3.5内皮细胞与肝星状/成纤维细胞互作可能促进肝脏纤维化3.5.1肝星状/成纤维细胞病理变化肝纤维化是一种以肝损伤部位持续过度累积细胞外基质为主要特征的病理状态，被广泛认为是严重肝脏类疾病的病理基础，如肝硬化和肝癌[71]。肝星状细胞被转化生长因子β（Tgfβ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）以及血小板源性生长因子（PDGF）[72-74]激活后成为激活肝星状细胞，激活肝星状细胞被认为是主要的细胞外基质来源细胞[75]。激活肝星状细胞除了产生细胞外基质，还能产生降解酶调控细胞外基质的更新[76]，通过产生血管生成素Ⅰ促进血管生成[77]。已有研究证明肝窦内皮细胞在肝纤维化的中重要作用[78,79]。这里我们重点关注了肝星状/成纤维细胞与内皮细胞之间的相关作用，探究介导肝星状/成纤维细胞与内皮细胞相互作用并加重肝纤维化的配受体对。我们基于整张芯片比较了组间促纤维化相关的通路基因集GSVA得分（图3-16），包括TGFβ信号通路、经典WNT信号通路、细胞黏附分子产生通路、细胞黏附、胶原蛋白激活信号通路、胶原蛋白生物合成过程通路、胶原纤维组织通路、细胞外基质组装通路、细胞外基质组分分泌通路、非经典WNT通路、NOTCH信号通路、损伤修复通路、损伤修复中的血管生成通路以及成纤维细胞增殖。GSVA得分结果显示，这些纤维化相关通路基因集在HBV感染ENEG时期具有更高得分，提示ENEG时期可能发生较严重的肝脏纤维化。图3-16基于整张芯片比较HBV感染各阶段以及非HBV感染对照组之间纤维化相关通路基因集GSVA打分由于肝星状/成纤维细胞是主要的细胞外基质来源，我们分别比较了肝星状/成纤维细胞在HBV感染阶段与非HBV感染对照之间的差异表达基因以及差异基因的功能富集分析（图3-17）。差异基因的功能富集分析结果显示肝星状/成纤维细胞在HBV感染ENEG阶段上调纤维化相关通路胶原原纤维组织通路、细胞外基质组织通路、细胞外结构组织通路、细胞基底黏附通路、损伤修复通路、细胞基质黏附通路、经典与非经典WNT通路以及整合素介导的信号通路，而IA时期肝星状/成纤维细胞上调免疫相关通路（图3-17B），IC和IT阶段并没显著富集到任何通路。此外，ENEG时期肝星状/成纤维细胞上调Ⅲ型胶原纤维α1链编码基因（COL3A1）、Ⅰ型胶原纤维α1链编码基因（COL1A1）、Ⅴ型胶原纤维α1链编码基因（COL5A1）、血小板反应蛋白Ⅰ编码基因（THBS1）、整合素亚基α9编码基因（ITGA9）等纤维化相关通路基因（图3-18）。综上我们发现了纤维化相关通路在HBV感染ENE时期GSVA得分更高，肝星状/成纤维细胞在ENEG上调细胞外基质和细胞黏附相关通路，进一步说明了HBV感染导致肝星状/成纤维细胞功能改变，促进纤维化形成。图3-17A.与非HBV感染对照相比，肝星状/成纤维细胞在HBV感染阶段差异表达基因，Down表示下调，NS表示无显著差异，Up表示上调；B.肝星状/成纤维细胞在HBV感染阶段上调基因的GOontology功能富集图3-18肝星状/成纤维化细胞上调通路中与细胞外基质、细胞黏附等纤维化有关通路基因在不同病理分组肝星状/成纤维细胞表达气泡图。颜色表示平均表达量，点大小表示基因表达比例3.5.2细胞通讯为了进一步探究肝纤维化过程中复杂的细胞相互作用，我们利用CellChat（v.1.6.1）分别解析了HBV感染ENEG和IA时期与非HBV感染对照的细胞相互作用差异。我们发现几乎所有的细胞接收和发出信号数量在HBV感染ENEG和IA时期都显著增加（附图-2A）且ENEG和IA时期具有更多特异性信号，如PDGF和VISFATIN信号在ENEG时期更特异，GDF和ncWNT信号在IA时期更特异（附图-2B），所以我们更加关注HBV感染ENEG和IA阶段的细胞间相互作用。细胞间相互作用数量热图显示与非HBV感染对照相比，HBV感染ENEG时期内皮细胞与肝星状/成纤维细胞之间的相互作用增强，HBV感染IA时期同样上调内皮细胞与肝星状/成纤维细胞之间的相互作用（图3-19）。空间转录组数据分别在HBV感染ENEG和IA时期以及非HBV感染对照组识别出了介导细胞相互作用的配受体对（图3-20）。与非HBV感染对照组相比，HBV感染ENEG时期肝星状/成纤维细胞与内皮细胞之间特异性上调玻连蛋白VTN信号、血小板反应素THBS信号、层粘连蛋白LAMININ信号、胶原蛋白COLLAGEN信号、血小板源性生长因子PDGF信号，NOTCH信号、纤维黏连蛋白-1FN1信号等（图3-20A）。与非HBV感染对照组相比，HBV感染IA时期肝星状/成纤维细胞与内皮细胞之间特异性上调玻连蛋白VTN信号、血小板内皮细胞黏附分子-1PECAM1信号、层粘连蛋白LAMININ信号、NOTCH信号、肝细胞生长因子HGF信号、纤维黏连蛋白-1FN1信号以及胶原蛋白COLLAGEN信号等（图3-20B）。纤维黏连蛋白-1FN1、胶原蛋白COLLAGEN、层粘连蛋白LAMININ和玻连蛋白VTN是细胞外基质的主要成分，HBV感染ENEG和IA时期这些信号在肝星状/成纤维细胞与内皮细胞间相互作用增强，再一次证明ENEG和IA时期细胞外基质累积，从而导致肝纤维化程度加重。血小板源性生长因子PDGF、NOTCH信号以及肝细胞生长因子HGF在肝纤维化中同样发挥重要作用，血小板源性生长因子PDGF作为促纤维化因子，能够促进胶原形成和沉积，同时促进肝星状/成纤维细胞活化和增值[80]，内皮细胞特异性NOTCH信号激活能加重纤维化，而抑制该信号能减轻甚至逆转肝纤维化[81]，而肝细胞生长因子HGF信号能够刺激肝脏增殖，增加沉积胶原转移，促进细胞外基质分解，从而改善肝纤维化[82]。通过比较NOTCH信号在非HBV感染对照CT时期与HBV感染ENEG和IA时期的相对强度差异，发现相对于CT时期，ENEG和IA时期NOTCH信号在内皮细胞中的信号强度增强，尽管ENEG时期内皮细胞NOTCH信号强度增加并不明显（附图-2D-F），NOTCH信号介导的细胞间相互作用弦图显示ENEG和IA时期由NOTCH信号介导的肝星状/成纤维细胞与内皮细胞间互作增强（附图-2F）。图3-19与非HBV感染对照相比，HBV感染ENEG（A）和IA（B）阶段互作数量变化。红色表示相对于非HBV感染对照增加的互作数量，蓝色表示相对于非HBV感染对照减少的互作数量。图3-20气泡图展示非HBV感染对照和HBV感染ENEG（A）、IA时期介导肝星状/成纤维细胞与内皮细胞相互作用的配受体对（B）；点颜色表示某配受体对介导细胞互作的可能性，点的大小表示细胞互作的显著性为了证明NOTCH信号介导肝星状/成纤维细胞和内皮细胞相互作用，我们对肝星状/成纤维细胞和内皮细胞以及NOTCH信号配受体JAG1-NOTCH2在肝星状/成纤维细胞和内皮细胞的表达进行了空间共定位（图3-21）。空间共定位结果显示肝星状/成纤维细胞和内皮细胞在空间上存在紧密共定位关系（图3-21A&C），同时NOTCH信号配受体JAG1-NOTCH2在肝星状/成纤维细胞和内皮细胞的表达同样存在紧密的共定位关系（图3-21B&D）。而且从病理切片HE染色上看，在肝星状/成纤维细胞和内皮细胞共定位的对应区域也能够发现轻微的肝纤维化（图3-22）。综上所述，我们指出HBV感染ENEG时期具有高水平纤维化相关通路得分，并且ENEG时期肝星状/成纤维细胞