IBRV复制相关miRNA的筛选

目录TOC\o"1-4"\h\u22533摘要 ScreeningofIBRVreplication-relatedmiRNAsAbstract:Infectiousbovinerhinotracheitis(IBR)isabovinerespiratorycontactinfectiousdiseasecausedbyInfectiousbovinerhinotracheitisvirus(IBRV)infection,anditspathogenesisiscloselyrelatedtotheinteractionbetweenthehostandthevirus.Itspathogenesisiscloselyrelatedtotheinteractionbetweenthehostandthevirus.DatasuggestthatmiRNAsplayanimportantregulatoryroleintheprocessofviralinfection,andmiRNAscanaffectviralreplicationbytargetingtheviralgenomeorhostcell-relatedgenes.However,thespecificfunctionalmechanismofIBRVmiRNAswheninfectingthehostremainsunclear.Inthisstudy,wescreenedmiRNAsandtheirtargetgenesrelatedtoIBRVreplicationbycombiningthehigh-throughputsequencingresultsoftheteam'spreviousresearch,screeningthepotentialregulatorytargetgenesofmiRNAsbasedonbioinformaticsmethods,andanalyzingthetargetgenesofmiRNAsbyKEGGenrichment;andwealsoutilizedthequantitativepolymerasechainreaction(qPCR)toidentifythetargetgenesandmiRNAsrelatedtoIBRVreplication.Quantitativepolymerasechainreaction(qPCR)wasusedtoverifythemiRNAhigh-throughputsequencingresults.Theresultsshowedthatatotalof16miRNAswithsignificantdifferences,correspondingto13414targetgenes,werescreenedoutusingthehigh-throughputsequencingresults;8miRNAswereselectedtobeassociatedwithIBRVreplicationbycombiningKEGGenrichmentanalysisandqPCRresults.Inthisstudy,themiRNAsassociatedwithIBRVreplicationwerescreenedout,whichisintendedtoprovideareferenceforfurtherinvestigationofthevirusinfectionmechanismandpreventionandcontrolstrategies.Keywords:MiRNA;Herpesvirus;Virusreplication;IBRV牛传染性鼻气管炎病毒（Infectiousbovinerhinotracheitisvirus,IBRV），即牛疱疹病毒Ⅰ型（Bovineherpesvirus1,BHV-1）是引发牛传染性鼻气管炎（Infectiousbovinerhinotracheitis,IBR）的主要病原体，根据抗原性和遗传特征，将BHV-1菌株分为1.1、1.2a、1.2b和1.3亚型REF_Ref10779\r\h[1]。主要引起的症状包括鼻腔流脓涕、鼻黏膜红肿充血、发炎坏死，伪膜脱落后呈红色溃疡面，故该病又称“红鼻病”REF_Ref11044\r\h[2]。此外，还可能引起母牛流产，以及传染性脓疱性外阴阴道炎和乳房炎等并发症。牛群感染无明显的季节特征，一年四季均可发病。IBRV可建立潜伏感染，病毒潜伏于三叉神经节中，逃避免疫检测，引起宿主持续感染，感染牛可以向外排毒造成IBRV扩大流行，影响肉牛的健康、奶牛的产奶量等REF_Ref11472\r\h[3]。IBRV目前在全世界广泛存在，多数国家都受其影响。目前在亚洲、拉丁美洲和非洲呈快速传播态势REF_Ref11586\r\h[4]。RaizmanEA等从哥斯达黎加中部太平洋地区的35个牛群中随机抽取496头未接种疫苗的牛进行病毒中和试验（VirusNeutralizationTest,VN），检测IBRV抗体，调查结果显示IBRV的个体血清阳性率为48%REF_Ref11677\r\h[5]。田陆妹等从京、津、冀、鲁、豫等5省市共计10个规模化养牛场采集1000份牛血清样品，通过酶联免疫吸附实验（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA）检测IBRV抗体，结果显示样本总体阳性率为12.9%REF_Ref11765\r\h[6]。王旭通过采用ELISA技术检测来自新疆6个不同地区（包括石河子、塔城、乌鲁木齐、克拉玛依、巴州以及阿克苏）的380份犊牛血清样本，涉及13处集约化养殖场，检测结果显示，在所有被调查区域中，均存在IBRV抗体，且巴州和克拉玛依两地IBRV阳性率高达100.00%REF_Ref11890\r\h[7]。自1928年便已获得实验性确证，IBRV就在世界各地广泛存在，虽然其流行情况不尽相同，但给全球各个国家的养牛业均造成了不同程度的经济损失。现有疫苗虽能够实现部分防控效果，但难以彻底根除IBRV的流行态势，其根本是因为关于IBRV感染机制的研究尚不完善。miRNA是一种非编码的单链RNA，其作用机制主要依赖于碱基互补配对原则特异性识别并结合宿主或病毒基因组中的特定序列区域。这类分子通过作用于目标基因的3'非翻译区（3'UntranslatedRegion,3'UTR）实现转录后调控功能，其典型作用模式表现为对靶标基因表达水平的负向调控。近年来研究发现，病毒感染可诱导宿主细胞内miRNA的变化，这种异常表达变化可进一步调控病毒的复制和致病性。刘正泽使用鸭甲型肝炎病毒1型（DuckHepatitisAVirustype1,DHAV-1）感染鸭胚成纤维细胞（DEF）48h后进行高通量测序，发现有65个miRNA和2297个mRNA的表达量发生了显著变化，筛选影响DHAV-1复制相关的miRNA并对其进行功能验证，证实过表达apl-miR-130b-5p和apl-miR-425-3p显著增加了细胞中的病毒载量，表明apl-miR-130b-5p和apl-miR-425-3p可以促进病毒在DEF细胞中的复制REF_Ref27895\r\h[8]。ChenYu等的研究进一步证实，gga-miR-451和gga-miR-199-5p可以促进新城疫病毒(Newcastlediseasevirus,NDV)在鸡胚成纤维细胞细胞中的复制，而gga-miR-19b-3p和gga-miR-29a-3p抑制NDV的复制REF_Ref12203\r\h[9]。越来越多的研究表明，miRNA通过调节宿主生物学途径和调节病毒生命周期在宿主和病原体相互作用中发挥关键作用。因此，研究miRNA在IBRV复制过程中的分子机制尤为重要，对于揭示致病机理、挖掘抗病毒药物靶点及开发新型防控策略具有重要意义。1实验材料和方法1.1实验材料1.1.1细胞和病毒MDBK细胞获取自中国科学院分子细胞科学卓越创新中心细胞资源库；IBRV病毒株购自中国兽医药品监察所。1.1.2主要试剂表1主要试剂试剂生产商TRIzol北京诺博莱德科技有限公司反转录试剂盒翌圣生物科技(上海)股份有限公司qPCR试剂盒天根生化科技（北京）有限公司胎牛血清白鲨生物科技有限公司DMEM高糖培养基白鲨生物科技有限公司PBS磷酸缓冲液白鲨生物科技有限公司青霉素-链霉素白鲨生物科技有限公司DMSO白鲨生物科技有限公司1.1.3主要仪器表2主要仪器仪器厂家医用净化工作台苏州净化设备公司（YJ-875型）细胞培养箱德国Eppendorf（Galaxy170R）PCR仪德国Eppendorf7500FastReal-TimePCRSystemThermoScientific低温高速离心机SIGMA（3K15）TD4台式小型中速离心机德国Eppendorf1.2实验方法1.2.1高通量测序筛选差异表达的miRNA和靶基因为筛选与IBRV复制相关的miRNA，本研究通过利用前期建立的miRNA文库，将IBRV感染MDBK细胞24h后miRNA高通量测序结果，以|log2（Foldchange）|>0.5、P<0.05且Count数>1000为筛选条件，筛选出差异表达的miRNA。进一步结合转录组测序结果，利用MiRanda、TargetScan8.2生物信息学软件预测差异表达miRNA对应的靶基因。1.2.2miRNA靶基因KEGG分析基于差异表达miRNA的靶基因预测结果，开展KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）分析，进行代谢通路与信号转导通路富集研究。1.2.3细胞复苏、细胞传代及细胞接毒1.2.3.1细胞复苏首先需要配置细胞培养液，50毫升DMEM培养基中需加入1%双抗（青霉素-链霉素混合抗生素）以及10%胎牛血清（Fetalbovineserum,FBS）。置于液氮罐中的MDBK细胞冻存管取出需迅速，取出后转移至37℃水浴锅中进行解冻操作。待管中细胞液融化至剩余一粒黄豆大小的冰晶时，加入到2mL细胞培养液，混合液随即被转移至15mL离心管内。置于离心机中，15mL离心管在4℃条件下以1000rpm转速进行5min离心处理。上清液的去除使得细胞沉淀得以保留于管底。加入2mL新鲜培养液后，通过反复吹打可使细胞团块分散为单细胞悬液状态。最终该悬液被接种于T25细胞培养瓶中。然后将其放入37℃、5%CO2的细胞培养箱中过夜培养。1.2.3.2细胞传代使用光学显微镜观察细胞状态，观察显微镜下细胞生长密度和生长状态。细胞汇合度达到90%左右时旧培养液吸弃。1mL磷酸盐缓冲液（Phosphate-BufferedSalin,PBS）沿着细胞瓶侧壁缓慢加入，瓶身经轻轻晃动后，PBS得以充分润洗细胞。润洗后PBS缓存液需立即弃去。0.25%胰酶溶液500μL加入以消化细胞，培养箱内消化过程持续50秒即可。直至细胞离散成单个圆形、细胞间出现间隙、呈沙状移动，并悬浮在培养液中。添加1mL细胞培养液终止消化，反复吹吸细胞使其充分悬浮，随后将细胞悬液吸取到15mL离心管中。将细胞悬液进行离心，倒掉上层液体后，添加2mL细胞培养液，吹散细胞沉淀，使其重悬，将MDBK细胞悬液以每孔3×105细胞数接种至2个35mm细胞培养皿中继续培养。1.2.3.3细胞接毒观察2个35mm细胞培养皿细胞密度大概在80%时，将旧的细胞培养液吸弃掉，然后用PBS溶液润洗一遍，换为无双抗无血清DMEM培养基，其中1个35mm皿中缓慢滴加1.5MOIIBRV病毒液，放入培养箱中孵育2h，配置细胞维持液，50mLDMEM培养基中加入2%FBS，2h后将2个35mm细胞培养皿进行细胞换液，去除DMEM培养基，加入2mL的细胞维持液，放入培养箱培养24h。1.2.4RNA提取在IBRV持续性感染MDBK细胞24h后，样按照标准化操作流程：首先移除原有的培养液，使用磷酸盐缓冲液漂洗两次。之后添加500μL胰蛋白酶溶液，将其置于37℃、5%CO2恒温细胞培养箱中，进行50s左右的消化操作。待消化完成后，加入完全DMEM培养基终止胰蛋白酶溶液的酶解反应，通过轻柔吹打使之形成单细胞悬液。将获得的细胞悬液转移至1.5mL离心管，1000rpm条件下5min的离心处理使细胞沉淀物得以分离，最终去除上清液并收集细胞沉淀物备用。RNA提取具体步骤如下：（1）将存于1.5mL离心管中的细胞沉淀物中，加入1mL的Triozl溶液，15min持续振荡以实现混合。（2）每样品中加入0.2mL氯仿（比例保持1:5，即每1mLTriozl试剂裂解样品对应0.2mL氯仿），随后充分混匀。（3）冷冻离心机内放置样品，参数设定为4℃、12000rpm离心10min。分层现象出现后，上层水相转移至新1.5mL离心管。（4）添加等体积比例的异丙醇，颠倒混匀操作完成，-80℃冰箱内冷冻沉淀时间不少于4h。（5）样品经-80℃低温保存后转移至室温环境进行解冻，待其完全溶解后立即置于预冷离心机中执行低温分离操作（4℃、12000rpm、10min），离心完成后将上清液移除并保留管底固态RNA。（6）添加1mL无水乙醇进行洗涤，参数设定为4℃、12000rpm离心5min，该步骤重复两次，均弃去上清保留沉淀物。（7）无水乙醇去除后，再次将沉淀冷冻离心，条件为4℃、12000rpm离心5min，，目的彻底弃去多余液体。（8）将离心管放置于超净工作台内，在冰盒上进行低温干燥处理，直至沉淀呈现干燥状态。。（9）将20μLDEPC水添加进入干燥后RNA沉淀物中，轻柔吹打，使RNA充分溶解性得以实现。OD值测定完毕后立即转移至-80℃冰箱，可长期保存性存放。1.2.5反转录将所提取RNA进行反转录操作，使用表3反转录引物，依照表4进行体系配制。混匀充分后短暂离心，置入PCR仪中需执行。表5所示程序为反转录过程所设定。反转录产物保存于-20℃冰柜。表3反转录引物名称序列（5'-3'）bta-miR-152RT-primerGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGGTTCAAGbta-miR-31RT-primerGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCGATACGbta-miR-6119-5pRT-primerGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAGTTTAGmiR-101-yRT-primerGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTGAAGTCAmiR-130-xRT-primerGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCATCACGmiR-15-yRT-primerGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCTCGTCGmiR-222-xRT-primerGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCTAGATGmiR-331-xRT-primerGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTAGGGACmiR-4454-zRT-primerGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCACGGCmiR-9-zRT-primerGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTGAAAGCCbta-let-7bRT-primerGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTGGTGTGbta-miR-183RT-primerGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGTCACTTAbta-miR-320aRT-primerGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGCGGGAGlet-7-xRT-primerGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTATTGGTGmiR-27-zRT-primerGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCGCCTTGmiR-320-yRT-primerGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAAGCGGGU6RAACGCTTCACGAATTTGCGTmiRNA-RCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT表4反转录体系成分体积（μL）RNA（1μg/μL）以2000ng计算10×HifairIIISuperBuffer2HifairIIIRTEnzymeMix1miRNARTPrimer（10pmol/μL）1U6ReversePrimer（10pmol/μL）1RNase-freeddH2O补足20表5反转录程序温度时间25℃5min55℃15min85℃5min1.2.6qPCR验证miRNA测序结果以所提取的总RNA为模板，使用表6qPCR引物，按表7配制qPCR扩增体系，混匀后用微型离心机短暂离心除去管壁上的液体，然后将其放入qPCR仪中，以表8设置反应程序。用2-△△ct分析法计算最终结果。表6qPCR引物名称序列（5'-3'）bta-miR-152F-primerTCAGTGCATGACAGAACTTGGGAGCGbta-miR-31F-primerAGGCAAGATGCTGGCATAbta-miR-6119-5pF-primerAGAGGTAAAAAATTGATTTGACTCCGAGCTGCTCGGGCmiR-101-yF-primerTACAGTACTGTGATAACTGAAGTGCACGGTCCGGmiR-130-xF-primerACTCTTTCCCTGTTGCACTACTGGCGmiR-15-yF-primerCGAATCATTATTTGCTGCTGmiR-222-xF-primerCTCAGTAGCCAGTGTAGA续表6qPCR引物名称序列（5'-3'）miR-331-xF-primerTCTAGGTATGGTCCCAGGmiR-4454-zF-primerATCCGAGTCACGGCACCAmiR-9-zF-primerATAAAGCTAGATAACCGAAAGbta-let-7bF-primerTGAGGTAGTAGGTTGTGTGGTTGCGCCbta-miR-183F-primerTATGGCACTGGTAGAATTCACTGGCCGbta-miR-320aF-primerAAAAGCTGGGTTGAGAGGGCGAGlet-7-xF-primerTGAGGTAGTAGGTTGTGTGGTTATGCGGCmiR-27-zF-primerTTCACAGTGGCTAAGTTCCGCGmiR-320-yF-primerAAAAGCTGGGTTGAGAGGGCGAATU6FCTCGCTTCGGCAGCACAU6RAACGCTTCACGAATTTGCGTmiRNA-RCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT表7qPCR扩增体系成分体积（μL）cDNA2miRNAReverseprimer（10pmol/μL）0.6miRNAForwardprimer（10pmol/μL）0.62×RealStarGreenFastMixturewithROXII7.5RNase-freeH2O4.3表8qPCR反应程序温度时间循环数95℃2min195℃15s4060℃30s95℃15s160℃15s195℃15s11.2.7统计分析qPCR验证miRNA的结果至少三次独立生物学重复，结果使用GraphPadPrism8.0进行统计分析，实验结果与高通量测序结果进行比对。2结果2.1高通量测序筛选差异表达的miRNA及预测靶基因本研究基于前期构建的miRNA文库数据资源，采用高通量测序技术手段，对IBRV病毒感染MDBK细胞系24h内的miRNA表达谱动态变化特征进行系统探究，以|log2(Foldchange)|>0.5、P<0.05且Count数>1000为筛选条件，筛选出16个差异表达miRNA，（如图1所示），对16个miRNA预测出对应的靶基因有13414个。图116个差异表达miRNA的热图2.2KEGG富集分析筛选出IBRV复制相关的miRNA及其靶基因对16个miRNA的13414个潜在靶基因开展KEGG通路富集分析。结果显示，这些靶基因在疱疹病毒感染通路呈现显著聚集态势，其中涉及病毒感染进程的靶基因共计127个。（如图3所示）。进一步用Cytoscape软件作出16个miRNA与IBRV复制相关靶基因互作网络图，见图4。在靶基因的对应关系分析中，19个靶基因被bta-let-7b所靶向，类似的数目也见于bta-miR-152的调控中。11个靶基因与bta-miR-183存在相互作用关系，而32个靶基因则受到bta-miR-31的调控作用。38个靶基因与bta-miR-320a呈现关联性，12个靶基因则被bta-miR-6119-5p所识别。let-7-x同样表现出对19个靶基因的调控能力，miR-101-y亦展示出同等规模的靶向特征。6个靶基因受控于miR-130-x，7个靶基因则与miR-15-y具有结合特性。miR-222-x的作用范围涉及11个靶基因，23个靶基因则与miR-27-z产生互作效应。38个靶基因再次出现在miR-320-y的调控网络中，8个靶基因被证实与miR-331-x存在关联性。4个靶基因显示出与miR-4454-z的特异性结合，最后11个靶基因被发现受到miR-9-z的调控作用。图3KEGG分析结果 图4miRNA-mRNA网络互作图2.3qPCR验证miRNA测序结果针对16种miRNA与高通量测序数据的一致性验证需求，展开qPCR检测实验，检测IBRV感染MDBK细胞24h后16个miRNA的表达量变化，比较miRNA的表达差异方法采用2-△△ct法。结果显示，8个差异表达的miRNA与高通量测序miRNA的表达趋势一致，分别为miR-9-z、bta-let-7b、bta-miR-183、bta-miR-320a、let-7-x、miR-27-z、miR-320-y、miR-4454-z（见图5所示）。图5qPCR验证高通量测序结果3讨论自miRNA被发现以来，许多研究表明miRNA在病毒性感染过程之中，发挥着不可忽视的调控性作用REF_Ref1536\r\h[16]。当病毒感染宿主细胞后，病毒会通过相关的分子机制诱导宿主细胞中与病毒复制相关的miRNA表达谱发生显著变化，这些miRNA参与调控病毒复制所需的各种相关分子的表达，对于宿主病毒感染信号通路非常重要，可显著提升宿主细胞对抗病毒入侵的防御性能力REF_Ref1810\r\h[17]。关于miRNA与病毒感染之间的调控机制研究大部分集中在miRNA、靶基因以及病毒复制三者之间的互作关系REF_Ref1536\r\h[16]。例如，司俊卓的研究通过对3个对照样本以及3个感染样本进行高通量测序，筛选出差异表达基因后，根据GO分析与KEGG信号通路富集分析，构建了相互作用网络，即ceRNA调控网络，为验证高通量测序结果的准确性，进一步利用qPCR技术对DEmiRNAs进行了验证，发现其表达趋势与测序分析结果基本保持一致REF_Ref13963\r\h[18]。本研究充分借鉴了前人研究miRNA的思路方法，首先通过筛选IBRV感染前后的差异表达miRNA，得到了16个差异表达miRNA及其靶基因。经KEGG富集分析发现127个靶基因与病毒感染通路相关，并通过qPCR验证了测序结果的可靠性。对高通量测序结果进行qPCR验证是基因组学领域研究的重要步骤之一，但结果与qPCR检测结果之间存在差异性这一现象，多个研究实例均可予以证实。如张方等人研究的绵羊不同部位脂肪组织miRNA对于调控脂肪代谢的影响中，他们利用qPCR技术验证随机选择的8个miRNA，其中有7个与高通量测序结果一致，而miR-23a在验证时的高表达和测序时的低表达存在着明显的不同REF_Ref14518\r\h[19]。郭雪萍等研究miRNA在IBRV诱导MDBK细胞线粒体损伤作用中，利用qPCR技术验证所筛选的11个miRNA，其中8个与高通量测序结果一致，3个与测序结果相反。这表明高通量测序结果是具有参考性的中间环节，但不能够作为实验的最终结果，想要确认还需要进一步验证REF_Ref12285\r\h[10]。本研究借鉴了前人的研究思路，利用生物信息学技术筛选出与IBRV复制相关的差异表达miRNA及靶基因，通过qPCR技术验证了16和差异表达的miRNA，其中有8个与高通量测序结果一致，但是对于这8个miRNA的具体功能有待实验室方法学层面的验证性工作进一步开展。先前已有研究证实，疱疹病毒感染宿主细胞可以引起miRNA表达谱的变化。例如，赵士杰对猪繁殖和呼吸障碍综合症病毒（PorcineReproductiveandRespiratorySyndromevirus,PRRSV）感染的MARC-145细胞中宿主miRNAs进行高通量测序，部分宿主miRNA表达量发生了变化，试验选取miR-376b-3p，用PRRSV感染MARC-145细胞，用qPCR对不同时间段miR-376b-3p的表达量进行检测，结果表明PRRSV感染能上调miR-376b-3p的表达，且在24h上调最明显REF_Ref14045\r\h[20]。本研究中的miRNA表达谱在感染了IBRV后也呈现显著变化，bta-let-7b、bta-miR-320a、let-7-x、miR-320-y都呈现显著上升。本研究对于参与IBRV复制过程的miRNA及其靶向基因的预测工作进行了分析。这些预测数据为IBRV复制机制的后续探讨供了重要的基础性支撑，有助于miRNA调控机制的探索。4结论本研究利用生物信息学，选出与IBRV复制相关的16个差异表达的miRNA及其对应的127个靶基因，并构建了miRNA与mRNA相互作用网络，然后通过qPCR验证了其中有8个差异表达的miRNA与高通量测序miRNA的表达趋势。参考文献：肖敏,梁斌,徐峥嵘,等.甘肃省部分地区牛传染性鼻气管炎的流行病学调查与分析[J].今日畜牧兽医,2023,39(06):8-9.CuthbertsonJC,WoodDA.Infectiousbovinerhinotracheitisinnorth-eastScotland[J].VetRec.1979Feb17;104(7):148-9.RimayantiR,KhairullahAR,LestariTD,etal.Infectiousbovinerhinotracheitis:Unveilingthehiddenthreattolivestockproductivityandglobaltrade[J].OpenVetJ.2024Oct;14(10):2525-2538.imayantiR,KhairullahAR,LestariTD,etal.Infectiousbovinerhinotracheitis:Unveilingthehiddenthreattolivestockproductivityandglobaltrade[J].OpenVetJ.2024Oct;14(10):2525-2538.RaizmanEA,PogranichniyR,NegronM,etal.Seroprevalenceofinfectiousbovinerhinotracheitisandbovineviraldiarrheavirustype1andtype2innon-vaccinatedcattleherdsinthePacificRegionof