巴利森苷B抗神经元细胞衰老的作用及其抗氧化机制初步研究

目录TOC\o"1-2"\h\z\u摘要 ⅠAbstract Ⅱ前言 。线粒体氧化磷酸化是大多数哺乳动物细胞中ROS最重要的来源也是氧化应激造成损伤的主要靶点ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[5,6]。为应对氧化损伤，生物体内形成了一套多层次的防御系统：内源性抗氧化酶通过级联反应将ROS转化为无害物质ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[7]；非酶类抗氧化分子（如谷胱甘肽、维生素C/E和褪黑素）则通过直接中和自由基或阻断氧化链式反应发挥作用ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Du</Author><Year>2024</Year><RecNum>10</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[4]</style></DisplayText><record><rec-number>10</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="t52wsx0ps9spzuesav9x0w5u9dtafadwdr0d"timestamp="1747389711">10</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Du,N.</author><author>Yang,R.</author><author>Jiang,S.</author><author>Niu,Z.</author><author>Zhou,W.</author><author>Liu,C.</author><author>Gao,L.</author><author>Sun,Q.</author></authors></contributors><auth-address>FrontierBiotechnologyLaboratory,BeijingInstituteofBiotechnology,Beijing100071,China. ResearchUnitofCellDeathMechanism,2021RU008,ChineseAcademyofMedicalScience,Beijing100071,China. NanhuLaboratory,Jiaxing314002,China. TheMeta-Center,29XierqiMiddleRd,Beijing100193,China. DepartmentofOncology,BeijingShijitanHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100038,China.</auth-address><titles><title>Anti-AgingDrugsandtheRelatedSignalPathways</title><secondary-title>Biomedicines</secondary-title></titles><periodical><full-title>Biomedicines</full-title></periodical><volume>12</volume><number>1</number><edition>20240108</edition><keywords><keyword>Nad+</keyword><keyword>Nsaids</keyword><keyword>acarbose</keyword><keyword>aging</keyword><keyword>anti-agingdrugs</keyword><keyword>lithium</keyword><keyword>metformin</keyword><keyword>rapamycin</keyword><keyword>signalpathway</keyword></keywords><dates><year>2024</year><pub-dates><date>Jan8</date></pub-dates></dates><isbn>2227-9059(Print) 2227-9059</isbn><accession-num>38255232</accession-num><urls></urls><custom1>Theauthorsdeclarenoconflictsofinterest.</custom1><custom2>PMC10813474</custom2><electronic-resource-num>10.3390/biomedicines12010127</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[4]。此外，细胞还通过Nrf2/ARE信号通路动态调控抗氧化基因表达，并利用自噬机制清除受损线粒体以减少ROS来源ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[8]，而Sirtuins家族蛋白则通过调节代谢和应激应答间接维持氧化还原稳态。线粒体作为ROS的主要产生场所，其功能退化与衰老呈双向关联。一方面，线粒体DNA突变和电子传递链效率下降会加剧ROS泄漏，形成恶性循环ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[9]；另一方面，低水平ROS可通过“线粒体兴奋效应”（mitohormesis）激活适应性应激反应，增强细胞修复能力。然而，随年龄增长，抗氧化防御系统逐渐失衡，过量ROS不仅直接损伤线粒体膜结构和呼吸链复合体，还会通过表观遗传修饰改变基因表达，最终促进衰老相关疾病（如阿尔茨海默病）的发生ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[4,8]。这一复杂调控网络揭示了氧化损伤与衰老进程的紧密联系，也为理解抗衰老机制提供了关键视角。中医药在开发抗衰老产品方面具有独特优势。在抗衰老药物的研究领域，截至目前，已有超2000种具备寿命调节功能的基因，以及超400种对模式生物可起到延长寿命作用的化合物成为研究讨论的对象。目前已发现二甲双胍、雷帕霉素、亚精胺、Senolytics药物等多种具有潜力的药物和小分子化合物ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Du</Author><Year>2024</Year><RecNum>10</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[4]</style></DisplayText><record><rec-number>10</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="t52wsx0ps9spzuesav9x0w5u9dtafadwdr0d"timestamp="1747389711">10</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Du,N.</author><author>Yang,R.</author><author>Jiang,S.</author><author>Niu,Z.</author><author>Zhou,W.</author><author>Liu,C.</author><author>Gao,L.</author><author>Sun,Q.</author></authors></contributors><auth-address>FrontierBiotechnologyLaboratory,BeijingInstituteofBiotechnology,Beijing100071,China. ResearchUnitofCellDeathMechanism,2021RU008,ChineseAcademyofMedicalScience,Beijing100071,China. NanhuLaboratory,Jiaxing314002,China. TheMeta-Center,29XierqiMiddleRd,Beijing100193,China. DepartmentofOncology,BeijingShijitanHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100038,China.</auth-address><titles><title>Anti-AgingDrugsandtheRelatedSignalPathways</title><secondary-title>Biomedicines</secondary-title></titles><periodical><full-title>Biomedicines</full-title></periodical><volume>12</volume><number>1</number><edition>20240108</edition><keywords><keyword>Nad+</keyword><keyword>Nsaids</keyword><keyword>acarbose</keyword><keyword>aging</keyword><keyword>anti-agingdrugs</keyword><keyword>lithium</keyword><keyword>metformin</keyword><keyword>rapamycin</keyword><keyword>signalpathway</keyword></keywords><dates><year>2024</year><pub-dates><date>Jan8</date></pub-dates></dates><isbn>2227-9059(Print) 2227-9059</isbn><accession-num>38255232</accession-num><urls></urls><custom1>Theauthorsdeclarenoconflictsofinterest.</custom1><custom2>PMC10813474</custom2><electronic-resource-num>10.3390/biomedicines12010127</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[4]。巴利森苷B（ParishinB，PB）是一种天麻（Gastrodiaelata）中特有的酚类化合物ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>郭维真</Author><Year>2025</Year><RecNum>18</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[10]</style></DisplayText><record><rec-number>18</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="t52wsx0ps9spzuesav9x0w5u9dtafadwdr0d"timestamp="1747390596">18</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>郭维真</author><author>张爱花</author></authors></contributors><auth-address>金花企业(集团)股份有限公司西安金花制药厂;陕西省药品监督管理局药品生产监管处;</auth-address><titles><title>天麻素药理活性及分析测试技术的研究进展</title><secondary-title>精细化工中间体</secondary-title></titles><periodical><full-title>精细化工中间体</full-title></periodical><pages>13-18</pages><volume>55</volume><number>01</number><keywords><keyword>天麻素</keyword><keyword>药理活性</keyword><keyword>分析检测</keyword><keyword>中草药</keyword><keyword>医药领域</keyword></keywords><dates><year>2025</year></dates><isbn>1009-9212</isbn><call-num>43-1354/TQ</call-num><urls><related-urls><url>/doi/10.19342/ki.issn.1009-9212.2025.01.003</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.19342/ki.issn.1009-9212.2025.01.003</electronic-resource-num><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[10]。酚类成分是天麻化学成分中的主要类群ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[11,12]。巴利森苷类是天麻素和柠檬酸在不同羧酸位点酯化形成的化合物。巴利森苷B分子式为C₃₂H₄₀O₁₉，分子量为728.653ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[13,14]。其纯化形式为淡黄色粉末，需在避光、低温（冷藏或冷冻）条件下保存以确保稳定性。相关药理实验显示天麻在中枢神经系统疾病中具有多重潜力。天麻素在阿尔茨海默病、帕金森病、焦虑症、抑郁症、脑缺血及癫痫等疾病中均呈现出显著药效，其作用机制与抗氧化应激密切相关，可通过调控神经递质、抑制氧化应激过程，进而提升学习记忆能力ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[15-18]。香草醛针对帕金森病、抑郁症的作用机制，则与抗炎性反应相关联ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>刘潇聪</Author><Year>2024</Year><RecNum>27</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[19]</style></DisplayText><record><rec-number>27</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="t52wsx0ps9spzuesav9x0w5u9dtafadwdr0d"timestamp="1747391993">27</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>刘潇聪</author><author>张玉苗</author><author>潘亚磊</author></authors></contributors><auth-address>陕西中医药大学;陕西中药资源产业化省部共建协同创新中心秦药特色资源研究开发国家重点实验室(培育)陕西省创新药物研究中心;</auth-address><titles><title>天麻素药理作用及临床应用研究进展</title><secondary-title>中南药学</secondary-title></titles><periodical><full-title>中南药学</full-title></periodical><pages>1615-1620</pages><volume>22</volume><number>06</number><keywords><keyword>天麻素</keyword><keyword>药理作用</keyword><keyword>临床应用</keyword><keyword>研究进展</keyword></keywords><dates><year>2024</year></dates><isbn>1672-2981</isbn><call-num>43-1408/R</call-num><urls><related-urls><url>/kcms2/article/abstract?v=IVqNFfq6ZnJVm5XCjnhudik8IRsjSImjFTDjKH3qM9KqLgYxwKYj-oFHh8EzrZXo2SoSl0Ufiyiu109n6NBrz1d-AKg9z8Zw1urYlMBjXp6klVzoB_7dHbotWNnX4sCdms0w_73iiy71IfUFrf3_ANaMOjNQQrlVK49TKo2q1efHS1xUMVU4QTHiLNTrJWZhmcJFguQgrls=&uniplatform=NZKPT&language=CHS</url></related-urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[19]。近年研究表明天麻提取物能够清除自由基延缓细胞衰老，具有一定的抗氧化活性ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>陈琛</Author><Year>2019</Year><RecNum>28</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[20]</style></DisplayText><record><rec-number>28</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="t52wsx0ps9spzuesav9x0w5u9dtafadwdr0d"timestamp="1747392031">28</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>陈琛</author><author>蔺蓓蓓</author><author>徐尤美</author><author>李鑫鑫</author><author>周天华</author><author>刘祥</author><author>孙海燕</author><author>胡红忠</author><author>郑红星</author></authors></contributors><auth-address>陕西理工大学生物科学与工程学院陕西省天麻山茱萸工程技术研究中心陕西理工大学中德天然产物研究所;陕西百圣生物工程有限公司;</auth-address><titles><title>天麻水提物活性成分分析及其抗氧化活性</title><secondary-title>食品工业科技</secondary-title></titles><periodical><full-title>食品工业科技</full-title></periodical><pages>17-22</pages><volume>40</volume><number>05</number><keywords><keyword>天麻</keyword><keyword>水提物</keyword><keyword>营养</keyword><keyword>成分</keyword><keyword>活性成分</keyword><keyword>抗氧化活性</keyword></keywords><dates><year>2019</year></dates><isbn>1002-0306</isbn><call-num>11-1759/TS</call-num><urls><related-urls><url>/doi/10.13386/j.issn1002-0306.2019.05.004</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.13386/j.issn1002-0306.2019.05.004</electronic-resource-num><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[20]。研究表明巴利森苷A可促进老年小鼠的神经突的形成ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[21]、巴利森苷C对阿尔兹海默病表现出良好的药理作用ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>张成宸</Author><Year>2019</Year><RecNum>20</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[12]</style></DisplayText><record><rec-number>20</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="t52wsx0ps9spzuesav9x0w5u9dtafadwdr0d"timestamp="1747391677">20</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>张成宸</author><author>石京山</author></authors></contributors><auth-address>遵义医科大学基础药理教育部重点实验室;</auth-address><titles><title>天麻的酚类成分及其中枢神经药理作用研究进展</title><secondary-title>中药药理与临床</secondary-title></titles><periodical><full-title>中药药理与临床</full-title></periodical><pages>167-174</pages><volume>35</volume><number>02</number><keywords><keyword>天麻</keyword><keyword>酚类</keyword><keyword>天麻素</keyword><keyword>中枢神经系统疾病</keyword><keyword>药理作用</keyword></keywords><dates><year>2019</year></dates><isbn>1001-859X</isbn><call-num>51-1188/R</call-num><urls><related-urls><url>/doi/10.13412/ki.zyyl.2019.02.039</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.13412/ki.zyyl.2019.02.039</electronic-resource-num><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[12]。由此推测巴利森苷B可能具有抗衰老潜力。小鼠海马神经元细胞系HT22细胞系作为一种永生化细胞系，适当分化后具有类似于体内成熟海马神经元特性，常被用于研究阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病研究中ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[22,23]。因此本研究选用HT22细胞作为体外模型研究对中枢神经系统抗炎抗衰老活性成分的筛选。天麻中巴利森苷等酚类活性成分对中枢神经系统疾病的药效作用及机制还需要进一步探索。本研究在HT22细胞上建立D-半乳糖诱导衰老模型，探究巴利森苷B在细胞水平的抗衰老作用以及机制，进一步加大对天麻的研究和开发，提高天麻的药用价值。3结果3.1不同浓度PB对HT22细胞的细胞活力影响首先，为了寻找合适的给药剂量，实验采用CCK8法评估了PB对小鼠神经元细胞系HT22细胞活力的影响（图3-1）。实验测试了不同剂量（范围为5μM至320μM）的PB对HT22细胞处理24小时后HT22细胞活力的变化。结果显示，PB给药剂量在5、10、20μM时，HT22细胞活力无显著影响（P>0.05）。当PB给药剂量增加到大于等于40μM时，HT22细胞活力随着PB给药剂量的增加而降低。所以研究选用5μM、10μM、20μM作为后续实验的给药剂量。图SEQ图表\*ARABIC1不同剂量PB对HT22细胞活力的影响。将HT22细胞按细胞密度约为4×105个/孔种于6孔板中，在5%CO2、37℃恒温培养箱中培养24小时后分别加入PB5μM、10μM、20μM、40μM、80μM、160μM、320μM以及同体积的完全培养基作为空白对照，继续培养24小时后按CCK8法测定细胞活力（n=5）。所有数据以均数±标准误（mean±S.E.M.）表示，以空白对照组作为对照，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。3.2PB对D-半乳糖诱导HT22细胞衰老相关标志物的影响实验使用D-半乳糖诱导法构建细胞衰老模型。通过查阅D-半乳糖诱导神经细胞衰老的相关文献ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[24]，后续实验选择200μM的D-半乳糖作为造模剂量。现有文献报道二甲双胍（metformin，Met）具有抗神经细胞衰老的作用ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[25]，故而，本研究采用二甲双胍作为抗衰老阳性对照。3.2.1PB对β-半乳糖苷酶活性的影响β-半乳糖苷酶活性是评价细胞衰老的重要指标之一。结果表明，相较于空白对照组，经D-半乳糖诱导建立的细胞衰老模型中，β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数明显增加；与D-半乳糖组相比，阳性药组β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数减少；在给予不同剂量PB处理细胞后，与D-半乳糖组相比，阳性细胞数减少，其中20μMPB组β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数减少较为明显（图3-2）。上述结果表明，D-半乳糖诱导HT22细胞衰老模型成功建立，PB逆转了D-半乳糖诱导的细胞衰老。图SEQ图表\*ARABIC2PB对β-半乳糖苷酶活性的影响。按上述方法种板，培养24小时后给药组分别加入不同剂量的PB，阳性药组加入50μM二甲双胍，在对照组中加入同体积的含血清培养基。继续培养1小时后加入200mM的D-半乳糖。干预24小时后采用β-半乳糖苷酶染色法检测细胞β-半乳糖苷酶活性。3.2.2PB对周期抑制因子的影响细胞衰老主要表现之一为细胞周期阻滞。所以实验通过qRT-PCR分别检测了细胞周期抑制因子p16、p21、p53表达水平的变化情况作为细胞衰老程度的评价指标ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[26]。结果可以发现，D-半乳糖组的p16、p21、p53mRNA表达水平相较于对照组有显著提高。与D-半乳糖组相比，给药组在5μM和10μM剂量下p16的表达水平没有显著变化，但p21、p53的表达量均有显著降低；给药组在20μM剂量下p16、p21、p53表达量均有明显下降；阳性药组的三种周期抑制因子表达量也均有显著下降（P<0.001）（图3-3A）。WB结果显示，与空白对照组相比，模型组p16、p21、p53条带颜色明显加深，蛋白表达水平提高（P<0.001）。与模型组相比，不同浓度的给药组蛋白表达变化趋势与mRNA变化情况相一致。（图3-3B）。上述两个实验结果说明PB具有一定的抗衰老效果且效果可能与给药浓度成正比。图SEQ图表\*ARABIC3PB对周期抑制因子的影响。按上述方法种板，培养24小时后给药组分别加入不同剂量的PB，阳性药组加入50μM二甲双胍，在对照组中加入同体积的含血清培养基。继续培养1小时后加入200mM的D-半乳糖。（A）干预24小时后提取RNA，使用qRT-PCR法测定衰老标志物p16、p21、p53表达量（n=3）。（B）按上述培养方法干预24小时后提取蛋白质，使用Westernblot法测定衰老标志物p16、p21、p53表达量（n=3）。所有数据以均数±标准误（mean±S.E.M.）表示，以D-半乳糖组作为对照，**P<0.01，***P<0.001。3.3PB对D-半乳糖诱导HT22细胞炎症指标的影响衰老与炎症之间的关系密不可分。因此本研究探究了PB对炎症因子的影响。实验采用200mMD-半乳糖干预HT22细胞1小时作为炎症模型。在测试了炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α在D-半乳糖、PB、二甲双胍干预前后的表达水平变化情况后发现，与空白对照组相比，模型组的炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α均表现出显著升高。与模型组相比，在低剂量PB干预后，只有炎症因子IL-6表达量出现下降（P<0.001），IL-1β和TNF-α表达量无显著变化（P>0.05），但当给药剂量提高到10μM后，除炎症因子IL-6外，IL-1β的表达量也出现降低（P<0.05），TNF-α表达量仍然无显著变化；而在高剂量PB干预后，炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α均表现出了显著降低，与阳性药干预组趋势相同（图3-4）。结果表明，高剂量的PB具有较好的抗炎作用。结合之前的细胞活力测定结果以及衰老标志物的检测结果，在三个剂量中20μMPB的抗炎抗衰老效果最佳，因此后续实验采用20μMPB进行给药。图SEQ图表\*ARABIC4PB对D-半乳糖诱导HT22细胞炎症指标的影响。按上述方法种板，培养24小时后给药组分别加入不同剂量的PB，阳性药组加入50μM二甲双胍，在对照组中加入同体积的含血清培养基。继续培养1小时后加入200mM的D-半乳糖。干预24小时后提取RNA，使用qRT-PCR法测定炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α表达量（n=3）。所有数据以均数±标准误（mean±S.E.M.）表示，以D-半乳糖组作为对照，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。3.4PB对D-半乳糖诱导HT22细胞抗氧化指标的影响衰老的生物学过程与氧化应激密切相关，其核心机制涉及ROS的积累及其对生物大分子的损伤。因此实验利用DCFH-DA染色法评价D-半乳糖诱导HT22细胞ROS水平，通过荧光显微镜检测了D-半乳糖单独或联合PB作用于HT22细胞24h后的总ROS水平。结果表明，空白对照组的细胞呈现较弱的绿色荧光。D-半乳糖组绿色荧光强度明显高于空白对照组，说明D-半乳糖处理细胞后，细胞内ROS水平显著升高。给药组绿色荧光强度相较于D-半乳糖组有所降低，但仍高于空白对照组。表明PB能够在一定程度上抑制D-半乳糖诱导产生的ROS增加，对细胞内过高的ROS水平有一定的调节作用，具有潜在的抗氧化能力，但未能使ROS水平完全恢复到正常对照组水平（图3-5A）。SOD、CAT、GSH-PX、MDA含量测定结果显示，与空白对照组相比，D-半乳糖组MDA含量提高（P<0.01），SOD、CAT、GSH-PX活性明显下降（P<0.001）；与D-半乳糖组相比，给药组SOD、CAT活性显著上升（P<0.01），GSH-PX和MDA含量没有显著变化（P>0.05）（图3-5B）。图SEQ图表\*ARABIC5PB对D-半乳糖诱导HT22细胞抗氧化指标的影响。按上述方法种板，培养24小时后给药组加入20μM的PB，阳性药组加入50μM二甲双胍，在对照组中加入同体积的含血清培养基。继续培养1小时后加入200mM的D-半乳糖。（A）干预24小时后采用DCFH-DA染色法，荧光显微镜检测检测细胞内ROS水平。（B）检测SOD、CAT、GSH-PX、MDA含量（n=5）。所有数据以均数±标准误（mean±S.E.M.）表示，分别以空白对照组、D-半乳糖组作为对照，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。3.5PB对D-半乳糖诱导HT22细胞衰老过程中线粒体氧化磷酸化的影响3.5.1PB对线粒体膜电位的影响线粒体跨膜电势作为评估线粒体能量代谢状态的核心参数，本研究通过荧光探针JC-1双色标记技术评估HT22细胞经24小时药物干预后的线粒体功能变化。实验结果显示，在D-半乳糖诱导的衰老模型中，JC-1荧光探针的聚合体/单体比值较空白对照组显著降低，提示线粒体去极化现象；而经PB活性成分干预后，该比值明显升高，表明线粒体膜稳定性得到显著改善（图3-6）。图SEQ图表\*ARABIC6PB对线粒体膜电位的影响。通过上述方法培养细胞。干预24小时后采用JC-1染色法，荧光显微镜检测JC-1的聚合体和单体荧光。3.5.2PB对氧化磷酸化复合体亚基表达的影响氧化磷酸化复合体亚基的正确表达是保证线粒体功能的重要条件。实验检测了给药HT22细胞24h后的氧化磷酸化复合体亚基的mRNA以及蛋白变化情况。qRT-PCR结果显示，D-半乳糖组的NDUFB8、UQCRC2、COXIV以及ATP5表达水平显著下降，与D-半乳糖组相比PB组NDUFB8、UQCRC2水平均有所恢复，COXIV以及ATP5表达水平无显著变化（图3-7A）。D-半乳糖组的ND1、CYTB、COXII、ATP6的表达明显下降。在加入PB处理后CYTB、COXII、ATP6的表达水平显著提高，ND1表达水平无显著变化。WB结果显示，在D-半乳糖作用下，NDUFB8、UQCRC2、COXIV以及ATP5蛋白水平减少，加入PB处理后UQCRC2、COXIV以及ATP5蛋白水平有所恢复（图3-7B）。上述结果表明PB在抗D-半乳糖诱导的HT22细胞衰老中，线粒体基因编码和核基因编码两类氧化磷酸化复合体亚基均有参与氧化磷酸化功能的恢复。图SEQ图表\*ARABIC7PB对氧化磷酸化复合体亚基表达变化。通过上述方法培养细胞。（A）干预24小时后提取RNA，使用qRT-PCR法测定NDUFB8、UQCRC2、COXIV、ATP5、ND1、CYTB、COXII、ATP6的mRNA表达（n=3）。（B）干预24小时后提取蛋白，测定细胞核基因编码氧化磷酸化复合体亚基蛋白NDUFB8、UQCRC2、COXIV、ATP5的蛋白表达（n=3）。所有数据以均数±标准误（mean±S.E.M.）表示，以空白对照组作为对照，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。4讨论衰老是所有生命体无可避免的必然历程。中枢神经系统在人体各系统中，受衰老影响程度颇深。在人体衰老过程中，中枢神经系统会出现神经细胞数目减少、神经炎症加剧、大脑功能衰退等一系列变化，进而使得神经退行性疾病的患病风险升高。当下，老龄化形势愈发严峻，社会老龄人口占比不断攀升。故而，探寻对中枢神经系统有保护功效、对神经细胞具备抗炎及抗衰老活性的物质与药物具有重要意义。在抗衰老药物研究方面，现已发现多种有潜力药物和小分子化合物可以延长生物体健康寿命。巴利森苷是天麻中一类特有的酚类化合物。目前研究显示巴利森苷能够促进老年小鼠的大脑神经突的形成ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[21]，还能改善阿尔兹海默症导致的认知能力下降。表明巴利森苷具有抗中枢神经系统衰老的潜力。细胞周期的停滞和β-半乳糖苷酶活性增加是细胞衰老的关键特征。细胞衰老可受p53/p21Cip1/Waf1（p53依赖性通路）和p16INK4a/Rb（p53非依赖性通路）两个关键途径的调节ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[27,28]。实验通过D-半乳糖诱导HT22细胞衰老作为衰老研究模型，对β-半乳糖苷酶活性、周期抑制因子的mRNA和蛋白表达水平进行检测。发现PB对周期抑制因子的表达有抑制作用并且能够减少衰老HT22细胞的β-半乳糖苷酶活性，说明PB具有抗衰老活性。炎性衰老是衰老研究中一个非常重要的概念。随着衰老进程的不断发展，通常会表现出促炎症反应状态的进行性提高。炎性衰老理论提出，衰老是一种慢性炎症，且这种炎症被认为是一种不可控的炎症，并与一系列年龄相关性疾病高度相关ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>夏世金</Author><Year>2012</Year><RecNum>54</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[29]</style></DisplayText><record><rec-number>54</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="za9pxd0x0xedt1eawa0xvt2vp9z52e2s2a25"timestamp="1716059969">54</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>夏世金</author><author>孙涛</author><author>郑松柏</author><author>张伟</author></authors></contributors><auth-address>复旦大学附属华东医院上海市老年医学研究所;复旦大学附属华东医院老年医学科;复旦大学附属华东医院消化科;</auth-address><titles><title>炎性衰老的研究</title><secondary-title>成都医学院学报</secondary-title></titles><periodical><full-title>成都医学院学报</full-title></periodical><pages>336-343</pages><volume>7</volume><number>03</number><keywords><keyword>炎性衰老</keyword><keyword>机制</keyword><keyword>炎症细胞因子</keyword><keyword>网络</keyword></keywords><dates><year>2012</year></dates><isbn>1674-2257</isbn><call-num>51-1705/R</call-num><urls><related-urls><url>/kcms/detail/51.1705.R.20120903.1455.005.html</url></related-urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[29]。实验结果表明PB能减少炎症因子的表达水平，具有抗炎活性，延缓了炎性衰老的发展，这结果与探究抗衰老活性的结果具有一致性。衰老的生物学过程与氧化应激密切相关，其核心机制涉及活性氧（ROS）的积累及其对生物大分子的损伤。实验检测了ROS水平，结果显示D-半乳糖可诱导细胞内ROS水平升高，而PB对D-半乳糖诱导的细胞内ROS升高具有一定的抑制作用，提示PB可能具有抗氧化应激的作用。一般情况下，ROS的水平由作为自由基清除剂的抗氧化酶介导着，如超氧化物歧化酶（SOD)、还原型谷胱甘肽（GSH）和过氧化氢酶（CAT）等，其水平升高反映着抗氧化应激的能力，MDA是脂质过氧化的最终产物，其水平降低反映氧化应激水平减弱ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[30]。因此实验检测了SOD、CAT、GSH-PX、MDA含量。Li,T等人发现从红景天中分离出的红景天苷（Sal）通过调节氧化应激相关的线粒体途径来保护帕金森病模型的DA神经元，他们的研究结果表明，红景天苷阻断了活性氧(ROS)水平的增加，并上调了超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽水平ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[31]。与Li,T等人实验结果相似，在本研究中经检测发现，与空白对照组比较，D-半乳糖组细胞SOD、GSH和CAT活性降低，而MDA水平明显升高，表明D-半乳糖组处于氧化应激状态，当给予PB干预后，给药组SOD、CAT活性显著上升（P<0.01），提示PB可改善HT-22细胞的氧化应激失衡状态。线粒体作为ROS的主要产生场所，其功能退化与衰老呈双向关联。线粒体是衰老过程中的重要细胞器，因为它们的功能会随着时间的推移逐渐下降。在生物体的整个生命周期中持续产生ROS会导致慢性氧化应激，这与衰老密切相关ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Dai</Author><Year>2014</Year><RecNum>35</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[32]</style></DisplayText><record><rec-number>35</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="t52wsx0ps9spzuesav9x0w5u9dtafadwdr0d"timestamp="1747393706">35</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Dai,D.F.</author><author>Chiao,Y.A.</author><author>Marcinek,D.J.</author><author>Szeto,H.H.</author><author>Rabinovitch,P.S.</author></authors></contributors><auth-address>DepartmentofPathology,UniversityofWashington,1959PacificAveNE,HSB-K081,Seattle,WA98195,USA. DepartmentofRadiology,UniversityofWashington,Seattle,WA,USA. DepartmentofPharmacology,WeillCornellMedicalCollege,NewYork,NY,USA.</auth-address><titles><title>Mitochondrialoxidativestressinagingandhealthspan</title><secondary-title>LongevHealthspan</secondary-title></titles><periodical><full-title>LongevHealthspan</full-title></periodical><pages>6</pages><volume>3</volume><edition>20140501</edition><keywords><keyword>Aging</keyword><keyword>Healthspan</keyword><keyword>Mitochondria</keyword><keyword>Oxidativestress</keyword></keywords><dates><year>2014</year></dates><isbn>2046-2395(Print) 2046-2395</isbn><accession-num>24860647</accession-num><urls></urls><custom2>PMC4013820</custom2><electronic-resource-num>10.1186/2046-2395-3-6</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language>