中国人群运动性猝死相关基因快速检测方法研究样本

资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。中国人群运动性猝死相关基因快速检测方法研究摘要目的:建立一种中国人群运动性猝死相关基因多态性速测方法。方法:用Chelex法提取外周静脉血基因组DNA,应用定点突变技术获得运动性猝死相关基因的突变阳性DNA模板,然后经过等位基因特异性PCR法扩增目的基因。优化内参引物、多态引物的Tm值,引物浓度比例,PCR循环数等扩增条件;琼脂糖凝胶电泳进行基因分型。结果:AS-PCR可检测运动性猝死相关基因多态性,PCR产物琼脂糖凝胶分型与DNA测序结果完全一致。结论:本研究建立的AS-PCR方法适用于中国人群运动性猝死相关基因的快速检测。关键词运动性猝死;基因多态性;等位基因特异性PCR中图分类号G804.83近年来,高强度竞技体育运动项目动性猝死案例频发,而且其数量呈逐年上升的态势。当前,临床对运动性猝死的常规检测手段主要有家族史、个人史筛查,体格及心电图检查,若为阳性结果,则进一步查超声心动图、运动负荷试验和24小时动态心电图等[1]。但这些检测方法针对性不强,检出率低,具有较大的局限性。国内外对运动性猝死的研究表明[2],死者的某些基因存在突变,大多表现为SNP或碱基缺失多态性。本研究选取KCNH2、KCNE1、SCN5A、KCNJ11、NUP155、CACNA1C、CACNB2b,7个与运动性猝死显著相关的热点突变基因的多态位点作为靶点,以AS-PCR方法为检测手段,从而建立准确、快速筛查运动性猝死基因多态性的方法。材料与方法1.1主要试剂及仪器Chelex-100购自上海生物工程公司;定点突变试剂盒MutanBESTKit,PMD18—TVector,PCR扩增试剂包括TaKaRaTaq™HotStartDNA热启动Taq酶,dNTPs,Buff以及核酸电泳分析试剂DL1000DNA分子量标准,DNA无毒染料,琼脂糖,均购自日本Takara公司;Bigdye3.1DAN测序试剂盒,购自美国Life公司。主要仪器设备有:美国ABI9700型PCR扩增仪,英国UVR电泳凝胶成像系统,美国ABI3130型DNA测序仪。1.2基因组DNA提取50例猝死个体临床血液样本,采用Chelex基因组DNA提取试剂盒,参照使用说明书操作,提取基因组DNA。取直径3-5mm血斑置于1.5ml离心管中,加入sdH2O1ml,振荡离心,弃上清,重复步骤两次,弃上清,将5%Chelex-100振荡悬浮后快速用剪掉头的枪头吸取200μl加入离心管中,振荡数秒,于56℃水浴保温30min后,振荡数秒,95℃沸水浴10min,轻微振荡数秒。rpm离心5min,上清为提取的DNA,-20℃保存备用。1.3阳性模板制备根据7个靶基因SNP位点设计突变引物,并进行PCR扩增,将引入突变位点的目的片段克隆到pMD18-TVector载体中,测序验证后作为后续PCR的DNA模板。1.4AS-PCR引物设计根据Genbank中的靶基因序列和AS-PCR原理,采用primerpremier5软件设计多态引物及内参引物,针对变异位点设计一对等位基因特异性引物,其3′末端分别与变异位点的碱基互补。为增加扩增特异性和检测分辨率,在3′端第2位引入错配碱基的AS-PCR引物。同时为排除PCR反应系统敏感性所致基因型判断失误,在AS引物上游设计了内参引物PF,下游共用引物PR与其中一种AS引物用作突变检测。内参引物与下游共用引物扩增较大的片段作为PCR的质控参照。AS-PCR引物设计原理示意图如图1.。P-2A-错配碱基PRPFP-2A-错配碱基P-2A-错配碱基PRPFP-2A-错配碱基目的基因基因目的基因基因参考片段参考片段图1.AS-PCR引物设计原理示意1.5AS-PCR反应及条件优化1.5.1AS-PCR反应本实验的反应条件为95℃3min,94℃30s,55～65℃30s,72℃30s;72℃3min,共35个循环。PCR缓冲液(其中,Tris-HClpH8.3100mM;KCl500Mm;MgCl215mM),dNTPs混合物的各组分浓度为2.5mM,热启动Taq酶为5U/μl,内参上游引物的浓度为10uM,多态性引物的浓度为10uM,下游引物的浓度为10uM。1.5.2温度梯度PCR优化退火温度平行进行56管反应,设定温度梯度范围为55～65℃,各管的退火温度分别为:55.0、56.3、57.6、59.1、60.7、62.2、63.8、65.0。反应条件同上,反应产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离,凝胶成像仪观察,选择无非特异条带,特异性条带最亮的管所对应退火温度为后续反应的退火温度。1.5.3引物浓度优化本实验采用半巢式PCR的方法进行扩增,因此存在PCR竞争的情况。将内参引物与目的基因引物的比例进行引物浓度优化。反应产物经用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离,凝胶成像仪观察,选择内参条带与目的条带亮度比例适中,便于判读的引物比例为后续反应的引物浓度。1.5.4DNA测序验证AS-PCR扩增产物为了进一步验证采用一系列AS-PCR扩增条件优化后的产物多态性的准确性,经过PCR产物琼脂糖凝胶回收试剂盒将扩增产物回收。由去离子甲酰胺与分子量内标组成上样混合物,将10μl上样混合物与1μl扩增产物或等位基因分析标准物混合,避免产生气泡,95℃变性5min,冰浴后电泳,用ABI3130遗传分析仪检测分析。2、结果2.1阳性模板的制备本研究根据7个基因SNP位点,应用定点突变技术在野生型的基础上得到相应的DNA阳性模板,各个基因的SNP多态性如表1所示。2.2AS-PCR反应条件优化运用AS-PCR方法同时检测这7个SNP多态位点。为了实现运动性猝死基因检测的高效性,特异性,要求各个PCR扩增反应的Tm值基本一致,而由于半巢式PCR方法扩增目的基因,存在PCR引物竞争,选择最优的退火温度和引物浓度的电泳,如图2所示。检测的7个基因中,KCNE1基因的参考片段大小为894bp,目的条带大小为754bp;KCNH2基因的参考片段大小为760bp,目的条带大小为579bp;KCNJ11基因的参考片段大小为795bp,目的条带大小为624bp;SCN5A基因的参考片段大小为764bp,目的条带大小为698bp;CACNA1C基因的参考片段大小为851bp,目的条带大小为203bp;CACNB2B基因的参考片段大小为914bp,目的条带大小为750bp;NUP155基因的参考片段大小为610bp,目的条带大小为321bp。图2AS-PCR反应条件优化讨论本研究检测的50个猝死样本中,发现KCNE1基因的两种突变型各1例,KCNH2基因突变1例。临床研究结果显示,中国汉族人群中广泛存在KCNE1、KCNH2、KCNJ11单核苷酸多态性改变,从而导致室性心动过速的猝死。因此,钾离子通道相关基因导致的猝死属于高危基因突变型;未发现钠离子通道相关基因SCN5A,钙离子通道相关基因CACNA1C、CACNB2B的突变,这两类基因突变导致的运动性猝死在人群中分别约占1-5‰和0.1-0.3‰,属于低度危险突变型;发现NUP155基因的突变1例,据文献报道,编码核孔复合物组分的基因NUP155基因是中国汉族人群中发现的与运动性猝死显著相关的特有基因。50例猝死样本中,检出4例与本研究靶基因相关的阳性突变。可能的原因是,在猝死的样本中,除了有心源性猝死外