DB34-T 4487-2023 水禽坦布苏病毒和星状病毒双重PCR检测技术规程

ICS65.020.2034DB34/T4487—2023水禽坦布苏病毒和星状病毒双重PCR检测技术规程TechnicalregulationfordoublePCRdetectionmethodofwaterfowlTembusuvirusandAstrovirus2023-07-31发布2023-08-31实施安徽省市场监督管理局发布IDB34/T4487—2023本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由安徽农业大学提出。本文件由安徽省农业农村厅归口。本文件起草单位：安徽农业大学、安徽省动物疫病预防与控制中心、滁州市动物疫病预防与控制中心、定远县畜牧兽医局、合肥华盟生物技术有限公司、安徽省皖西白鹅原种场有限公司。本文件主要起草人：王桂军、朱良强、许青华、李文来、郑举、范亚楠、何长生、解新迪、张云凯、段倩倩、伍唯、张新。DB34/T4487—20231水禽坦布苏病毒和星状病毒双重PCR检测技术规程本文件规定了水禽坦布苏病毒和星状病毒双重PCR检测方法的主要仪器设备、试剂、引物与标准品、操作步骤、结果判定、生物安全管理及废弃物处理。本文件适用于水禽坦布苏病毒和星状病毒核酸检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY/T1948兽医实验室生物安全要求通则SN/T4835实验室生物废弃物管理要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1坦布苏病毒Tembusuvirus坦布苏病毒(Tembusuvirus,DTMUV)属于黄病毒科(Flauiviridae)、黄病毒属(Flaoivirus)。坦苏病毒病(Tembusuvirusdisease):是由坦布苏病毒引起的鸭的一种传染病，感染该病的种鸭通常会引起严重的产蛋率下隆、共济失调，卵巢出血、发炎的现象。星状病毒Astrovirus星状病毒(Astroviruses,AstV)是一种圆形、无囊膜、单股正链RNA病毒，其直径为25～35nm。因在电子显微镜下，病毒表面有5～6个突起，结构呈星形，故称之为星状病毒。星状病毒病，一种由星状病毒引起以内脏和关节痛风为主要症状的传染性疾病，可引起雏鹅腹泻性肠炎、肾炎及尿酸盐沉积等症状，是引发雏鹅痛风的重要原因之一。4主要仪器设备4.2台式低温高速离心机：最大离心力17000g以上。4.3电泳仪：电压10-300V,电流4-400mA,功率最大75W。4.4凝胶成像系统：紫外透射面积20×20-21×26cm,波长302nm。2DB34/T4487—20234.5冰箱：-20℃;-80℃。4.6微波炉。4.7分析天平：精确度0.001g。4.8水浴锅。4.9微量移液器：2.5µL、10µL、20µL、200µL、1000µL。4.10超净工作台。5试剂5.1RNA抽提试剂：Trizol或其他商品化RNA提取试剂。5.2氯仿、异丙醇、无水乙醇：为分析纯。5.3ReactionBuffer(5×)，dNTPMix，反转录酶，TaqDNA聚合酶，RNaseInhibitor(20U/µL)、RandomHexamerprimer。5.41×TAE电泳缓冲液：配制方法见附录A。5.50.1MpH7.4PBS：配制方法见附录A。5.6DNA分子标准5.71％琼脂糖凝胶：配制方法见附录A。5.8灭菌超纯水：符合GB/T6682的规定，121℃、20min，高压蒸汽灭菌。5.9ddH2O：双重蒸馏水。6引物与标准品6.1扩增星状病毒（GAsTV）的引物，扩增DNA片段大小为300bp。——上游引物：5'-AGAAGGTGCGGAAGAGTGGTATGA-3'——下游引物：5'-GCGAAGAGTGCGTAAGAGGTTGT-3'6.2扩增坦布苏病毒（DTMUV）的引物，扩增DNA片段大小为404bp。——上游引物：5'-CTGATGGCTTTGGTCCTGTTC-3'——下游引物：5'-ACACCTATTCTCACCACATCTAAC-3'6.3阴性对照品：灭菌超纯水。6.4阳性对照品：坦布苏病毒cDNA和星状病毒cDNA。7操作步骤7.1样品的采集与处理7.1.1样品采集应按照NY/T541的规定执行，无菌采集感染或病死禽类各种组织与器官（肝脏、脾脏、肾脏）。7.1.2样品处理取待检组织样品适量（1g)，按1:5倍（W/W)加入无菌0.1MpH7.4PBS，于灭菌并烘干的研钵或组织匀浆器中充分研磨，反复冻融3次后，4℃8000rpm/min离心20min，取上清1mL转至无菌的1.5mL离心管中，编号备用。DB34/T4487—202337.2.1用Trizol或其他商品化RNA提取试剂提取待测样品。7.2.2200μL样品和1mLTrizol加入EP管中，4℃裂解10～20min,轻轻颠倒混匀。7.2.3加入200μL氯仿，上下颠倒混匀，静置5min；12000rpm4℃离心15min，吸取上清于新7.2.4加入750μL异丙醇，混匀静置10min；12000rpm4℃离心10min，吸弃上清，留下沉淀。7.2.5加入无水乙醇1mL，轻轻颠倒，洗涤管壁；12000rpm4℃离心10min小心吸弃上清。7.2.6打开EP管管盖，室温干燥2～3min，干燥后加入适量ddH2O，-80℃保存备用。7.3反转录（cDNA合成）7.3.1在PCR反应管中分别加入11μLRNA模板，4.0μLReactionBuffer(5×)，2.0μLdNTPMix，1.0μL反转录酶，1.0μLRNaseInhibitor(20U/μL)、1.0μLRandomHexamerprimer。7.3.2于PCR扩增仪，反应条件为25℃10min，42℃1h，反应后，转录产物置-20℃保存备用。7.4.1PCR反应体系总体积为20μL，2×TaqPlusMasterMixII(DyePlus)10μL，DTMUV和GAsTV上游引物各0.5μL，DTMUV和GAsTV下游引物各0.5uL，反转录产物2μL添加ddH2O至20μL。7.4.2PCR反应条件预变性95℃3min，变性95℃15s，退火52℃20s，延伸72℃15s，循环30次，延伸72℃5min。每次PCR均应设阳性对照和阴性对照。7.5.1制备1.0％琼脂糖凝胶板。7.5.2取5μLPCR产物，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中。7.5.3加入分子量标准。7.5.4盖好电泳仪，插好电极，将电压调至90V左右，电泳30～40min。7.5.5用紫外凝胶成像仪观察，用分子量标准比较，判断PCR片段大小。8结果判定8.1在阳性对照出现300bp，404bp大小的扩增条带、阴性对照无目的条带出现的情况下判定结果（见附录B）。8.2结果同时出现大小约300bp和404bp扩增片段时，判定坦布苏病毒和星状病毒为阳性。8.3结果出现大小约300bp扩增片段时，判定为星状病毒阳性。8.4结果出现大小约404bp扩增片段时，判定为坦布苏病毒阳性。8.5未出现大小约300bp或404bp扩增片段或片段大小与目的片段大小不符，判定为阴性。9生物安全管理及废弃物处理生物安全管理和废弃物处理应按照GB19489、NY/T1948和SN/T4835的规定执行。DB34/T4487—20234试剂配制A.11×TAE电泳缓冲液A.1.1配制50×TAE缓冲液50×TAE缓冲液TrisNa2EDTA.2H20冰乙酸28.55mL灭菌超纯水定容至500mLA.1.2配制1×TAE缓冲液于10mL50×TAE缓冲液，加入490mL灭菌超纯水，混匀后即可。A.21％琼脂糖凝胶琼脂糖（电泳级）0.4g在微波炉加热至完全融化沸腾后，加入核酸染料2μL，混匀后铺板。A.30.1MPBS（pH7.4）的配制氯化钠8.0gNa2HPO4.12H202.9gKCL0.2gKH2PO4