生物工程实验指导-课件汇 07-仪器分析实验 -12-药物分析检测实验

仪器分析实验实验一

紫外可见分光光谱法测定蛋白质含量实验二

电位滴定法测定食醋中的醋酸含量实验三

原子吸收光谱法测定水中钾含量实验四

苯甲酸红外光谱测定与谱图分析实验五

气相色谱法测定食用酒中乙醇含量实验六

高效液相色谱法测定槐花中芦丁含量实验七

薄层色谱法测定苏丹红实验八

气相色谱法测定藿香正气水中乙醇的含量实验九

高效液相色谱法测定阿司匹林片剂中乙酰水杨酸含量实验一

紫外可见分光光谱法测定蛋白质含量(1)掌握考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量的原理与方法。(2)熟练掌握紫外可见分光光度计的使用和操作方法。(3)掌握蛋白质工作曲线的绘制及样品中蛋白质含量的测定和计算。2实验原理考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色,最大吸光度在465nm;当它通过疏水作用与蛋白质相结合形成蓝色的蛋白质染料复合物时,在595nm处有最大吸光度。在一定的蛋白质浓度范围内,蛋白质染料复合物在波长为595nm处的吸光度与蛋白质含量成正比。通过测定595nm处吸光度的增加量,可以得知与其结合的蛋白质的量,因此可用于蛋白质含量测定。蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合,在2min左右的时间内达到平衡,反应十分迅速。蛋白质染料复合物具有很高的消光系数,使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高,可测微克级蛋白质含量。1实验目的3实验材料及设备3.1实验材料绿豆芽(黄豆芽)。3.2仪器设备分析天平、紫外可见分光光度计、移液管(2mL,5mL)、研钵、量筒、容量瓶(100mL,500mL)、烧杯、比色皿、试管、试管架。3.3试剂及其配制方法牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250、乙醇、磷酸。①100mg/mL牛血清白蛋白质标准溶液:称取100mg牛血清白蛋白,溶于蒸馏水并定容至100mL容量瓶,即为1mg/mL的标准蛋白质溶液。②考马斯亮蓝G-250试剂:称取0.05g考马斯亮蓝G-250,溶于25mL乙醇(95%)中,加入85%(m/v)的磷酸50mL,最后用蒸馏水定容至500mL容量瓶。4实验步骤(1)标准曲线的绘制取6支10mL试管,按顺序编号。按表7-1中数据配制一系列不同浓度的蛋白质溶液。摇匀后放置10min,在595nm波长下比色测定,记录吸光度。以各管相应标准蛋白质含量(μg)为横坐标,A595为纵坐标,绘制标准曲线。(2)待测样品测定称取1.0g新鲜绿豆芽的下胚轴,放入研钵中研成匀浆,用10mL蒸馏水分三次把研钵冲洗干净,将全部液体转入10mL刻度试管中,用蒸馏水定容至刻度,摇匀备用。※注意事项:①如果测定要求很严格,可以在试剂加入后5~20min内测定吸光度,尽量1h内完成,否则会因蛋白质染料复合物发生凝集沉淀而影响测定结果。②考马斯亮蓝的染色能力很强,如果比色杯没有清洗干净会影响吸光度。测定中,蛋白染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上,测定完以后可用乙醇将蓝色的比色杯清洗干净。试管中加入自制蛋白质样品和蒸馏水共1mL,再加入4mL考马斯亮蓝G-250试剂,摇匀,放置10min后,在595nm波长下比色,记录A595。根据所测A595从标准曲线上查得蛋白质含量。5结果与分析(1)拍摄照片保存实验结果。(2)将实验数据记录在表7-2中。(3)绘制标准曲线,并计算蛋白样品的浓度。6思考题①考马斯亮蓝法测定蛋白质含量有什么优缺点?②考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理是什么?③蛋白质含量的测定还有哪些其他方法,其优缺点是什么?实验二

电位滴定法测定食醋中的醋酸含量1实验目的(1)掌握电位滴定法的原理和基本操作技术。(2)掌握电位滴定曲线的绘制和滴定终点的计算方法。(3)掌握电位滴定法测定食醋中乙酸含量的方法。食醋的主要成分是醋酸。用氢氧化钾标准溶液滴定醋酸,通常可选用酚酞作指示剂,滴定终点时溶液由无色变为微红色。然而,在滴定过程中,由于食醋呈棕色,无法使用合适的指示剂来观察滴定终点,因此滴定终点需用酸度计来测量。在酸碱电位滴定过程中,随着滴定剂的不断加入,被测物与滴定剂发生反应,溶液pH不断变化,在化学计量点附近发生pH突跃。因此,通过测量溶液pH的变化就能确定滴定终点。pH-V

曲线法以滴定剂用量V

为横坐标,以pH为纵坐标,绘制pH-V

曲线;作两条与滴定曲线相切的直线,切线与曲线的交点即为滴定终点。ΔpH/ΔV-V

曲线法以滴定剂用量V为横坐标,以ΔpH/ΔV(pH变化值的一次微商与对应滴定剂体积增量ΔV

的比值)为纵坐标,绘制ΔpH/ΔV-V

曲线,曲线的最高点即为滴定终点。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料食醋。3.2仪器设备PHS-3C型酸度计、铁架台(含滴定管夹)、100mL容量瓶、250mL锥形瓶、5mL滴定管、10mL移液管、玻璃棒。3.3试剂及其配制方法①0.1mol/L草酸(MW=126.07g/mol,H2C2O4·2H2O)标准溶液:称取草酸12.607g于小烧杯中,加入50mL蒸馏水使其溶解后,转入1000mL容量瓶中,加水定容至刻度,摇匀。②0.1mol/L氢氧化钾(MW=56.11g/mol,KOH)标准溶液(浓度待标定):称取氢氧化钾固体5.611g于小烧杯中,加入50mL蒸馏水使其溶解,稍冷后转入1000mL容量瓶中,加水定容至刻度,摇匀。③标准缓冲溶液(购买的袋装品):0.05mol/L邻苯二甲酸氢钾溶液,pH=4(20℃);0.05mol/L磷酸氢二钾和0.05mol/L磷酸二氢钾混合溶液,pH=6.88(20℃)。4实验步骤(1)酸度计的安装与用标准缓冲溶液校准。打开pH计电源开关,调节温度补偿旋钮,预热30min。使用pH为6.86的标准缓冲溶液进行定位较准(调节定位旋钮);再用pH为4的标准缓冲溶液进行斜率校准(调节斜率旋钮)。要求仪器示值与对应温度下缓冲溶液的标准pH偏差不超过±0.05pH单位。(2)0.1mol/L氢氧化钾溶液的标定准确移取2.00mL草酸标准溶液于250mL小烧杯中,加水20mL,用待标定的氢氧化钾溶液进行滴定,每1mL记录一次读数,在滴定终点体积V处及化学计量点附近时(pH变化较快时),每隔0.5mL记录一次读数,记录每个点对应的体积和pH,以此绘制滴定曲线。(3)电位滴定法测定食醋中醋酸含量准确移取5mL食醋于50mL容量瓶中定容。从中移取5mL于烧杯中,加水20mL,用标定的氢氧化钾溶液进行滴定,每1mL记录一次读数,在滴定终点体积V处及化学计量点附近(pH变化较快时),每隔0.5mL记录一次读数,记录每个点对应的体积和pH,以此绘制滴定曲线。※注意事项:①pH复合电极在使用前必须在3mol/L氯化钾溶液中浸泡活化24h。电极膜很薄易碎,使用时需十分小心。②切勿将搅拌磁子连同废液一起倒掉。5结果与分析(1)拍摄照片保存实验结果。(2)将氢氧化钾溶液的标定数据记录在表7-3中。绘制pH-V曲线和ΔpH/ΔV-V曲线,确定滴定终点对应的体积V,计算氢氧化钾标准溶液的浓度。(3)将食醋中醋酸含量测定的数据记录在表7-4中。6思考题①实验中使用的酸度计若不事先进行校正,结果是否会一样?②电位滴定法与酚酞指示剂滴定法相比,有哪些优点?③如果食醋中含有盐酸,滴定曲线将有何变化?5结果与分析绘制pH-V曲线和ΔpH/ΔV-V曲线,确定滴定终点对应的体积V,计算食醋中醋酸含量。实验三

原子吸收光谱法测定水中钾含量1实验目的(1)掌握电位滴定法的原理和基本操作技术。(2)掌握电位滴定曲线的绘制和滴定终点的计算方法。(3)掌握电位滴定法测定食醋中乙酸含量的方法。水样中的金属离子被原子化后,会吸收来自同种金属元素空心阴极灯发出的共振线,吸收共振线的量与样品中该元素含量成正比。其关系可表示为

A=KC式中

A———吸光度;K———常数;C———试样浓度。本实验采用标准曲线法测定溶液中钾的含量。在既定条件下,测定一系列不同钾含量标准溶液的

A

值,得到

A-C

的标准曲线。再根据钾未知溶液的吸光度,即可求出未知液中钾的浓度。2实验原理3材料、仪器及试剂3.1材料饮用水、容量瓶(250mL)、移液管(5mL,10mL)、试管(10mL)。3.2仪器原子吸收光谱仪、空气压缩机、乙炔气体钢瓶、电子打火枪、钾空心阴极灯(灵敏吸收线为766.5nm)。3.3试剂5%稀硝酸作为稀释剂、桶装纯净水。①钾标准使用溶液(10mg/L):基准氯化钾(相对分子质量为74.55)在150℃干燥2h,称取0.477g氯化钾,以水溶解并移至250mL容量瓶中,稀释至标线,摇匀。②稀释钾标准溶液(10mg/L):5mL移液管吸取钾标准储备溶液2.5mL于250mL容量瓶中,加水稀释至标线,摇匀备用。4实验步骤(1)仪器操作条件的设置(测定参数)吸收线波长:766.5nm;空心阴极灯电流:5mA;狭缝宽:1mm;燃烧器高度:7mm;乙炔流量:1.6L/min。(2)曲线的绘制用5mL移液管准确移取钾标准溶液0、0.5、1、1.5、2、2.5mL,分别移入10mL试管中,用10mL移液管移取水稀释至刻度,摇匀。此标准系列钾的浓度分别为0、5、10、15、20、25mg/L。试剂添加量见表7-5。在仪器最佳工作条件下,于波长766.5nm处,以试剂空白调零,测定其吸光度。以测定的吸光度为纵坐标,相对应的钾含量(mg/L)为横坐标,绘制出标准曲线。(3)水样测定水样在采集后,应立即以0.45μm滤膜(或中速定量滤纸)过滤。用5mL移液管移取过滤后试样溶液5mL,置于10mL试管中,用水稀释至刻度。在与制作标准曲线相同的条件下,于波长766.5nm处测定水样的吸光度,从标准曲线中查得钾离子的浓度。※注意事项:①钾为溶解度很大的常量元素,而原子吸收光谱法是一种灵敏度很高的分析方法。为了取得精密度好、准确度高的分析结果,对所用玻璃器皿必须认真清洗。②样品及标准溶液不能保存在软质玻璃瓶中,因为这种玻璃中的钾和钠容易被水样和溶剂溶出,从而导致污染。5结果与分析(1)拍摄照片记录实验结果。(2)将原始数据记录在表7-6中。(3)绘制标准曲线,并计算水样中钾含量。6思考题①简述原子吸收光谱法的基本原理。②使用原子吸收光谱法分析为何要用待测元素的空心阴极灯做光源?能否用氢灯或钨灯代替,为什么?③在什么条件下使用标准曲线法,该方法有什么优缺点?实验四

苯甲酸红外光谱测定与谱图分析1实验目的(1)学习利用红外吸收光谱仪进行化合物的定性分析。(2)掌握压片法制备固体样品片的技术。(3)熟悉红外分光光度计的工作原理及使用方法。傅里叶变换红外光谱仪是一种基于光的相干性原理设计的分子吸收光谱测量仪器,属于干涉型光谱仪。其主要由光源、干涉仪(迈克尔逊干涉仪)、吸收池(样品室)、检测器、计算机和记录系统等组成。傅里叶变换红外光谱仪将不同频率的光信号经过干涉作用后调制成干涉图,即时间域光谱图,然后用计算机进行快速傅里叶变换,转换成频率域光谱图,即红外光谱图。当一定频率(一定能量)的红外光照射分子时,如果分子某个基团的振动频率和外界红外辐射频率一致,二者就会产生共振。此时,光的能量通过分子偶极矩的变化传递给分子,这个基团就吸收一定频率的红外光,产生振动跃迁(由原来的基态跃迁到较高的振动能级),从而产生红外吸收光谱。当红外光的振动频率与分子中各基团的振动频率不一致时,该部分红外光不会被吸收。若用连续改变频率的红外光照射某试样,将分子吸收红外光的情况用仪器记录下来,即可得到试样的红外光谱图。由于振动能级的跃2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料苯甲酸粉末、光谱纯KBr粉末。3.2仪器设备傅里叶变换红外光谱仪、压片机、模具、干燥器、玛瑙研钵。4实验步骤(1)压片制样①准备a.保持使用压片机的房间湿度较低。b.将压片机配件放入干燥器备用。c.用玛瑙研钵研磨适量KBr晶体,放入干燥器备用。d.为避免手汗对压片的影响,研磨和压片过程中需戴手套。4实验步骤②压片操作a.取200mg备用KBr粉末于玛瑙研钵中,加入1%干燥的样品,在红外灯下研细混匀。b.使用无水乙醇浸润的无尘棉清洗模具等。c.将样品和KBr混合粉末放到模具中,用抹刀铺平,将装配好的压片模具移至压片机下。d.压片机阀门旋至“LOCK”,加压至60kN,停留适当时间使压片透明,脱模,样品基本透明为合格。e.将样品装入样品架。(2)测试①将样品架放入仪器内,点击测试按钮。②测试结束,保存文件。③取出样品架,卸下样品。(3)整理①清洁模具等制样器具。②如有需测试样品则进入下一样品的制备,如无样品则整理物品、清洁台面后离开。4实验步骤※注意事项:①操作规范,轻举轻放,不要敲击。②研钵材质为玛瑙,易碎需防跌落。③实验全过程要求干燥防水。④将KBr研磨至细度2μm左右。⑤控制KBr与样品的比例。⑥注意保持室内清洁、干燥。⑦避免振动光学台。⑧取、放样品时,样品盖应轻开轻盖。⑨眼睛切勿直视氦-氖激光,以免受到损伤。苯甲酸的标准红外光谱(图7-1)。6思考题①KBr压片法制备红外吸收光谱固体试样的注意事项有哪些?②为什么红外光谱实验室要求温度和相对湿度维持一定的指标?③怎样进行红外吸收光谱的定性分析?5结果与分析(1)对样品纯度、来源、元素分析及其他物理性质、谱学性质等方面进行了解。(2)对特征基团频率、特征宽强峰、倍频(泛频)及合频特征峰进行初步分析。(3)初步确定为某类化合物后,与标准谱图进行核对。实验五

气相色谱法测定食用酒中乙醇含量1实验目的(1)了解气相色谱仪的基本结构。(2)学习和掌握使用氢火焰离子化检测器的基本操作。(3)掌握以内标法进行色谱定量分析的方法及特点。(4)学习气相色谱法测定乙醇含量的分析方法。气相色谱法是一种高效、快速且灵敏的分离分析技术。当液体样品由进样口注入后立即被汽化,并被载气带入色谱柱。经过多次分配,各个组分得以分离,逐一流出色谱柱进入检测器。随时间变化而产生的电信号经由记录仪得到气相色谱图。通过对气相色谱图进行数学分析,即可对样品进行定性定量分析。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料白酒样品(市售)。3.2仪器设备气相色谱仪、色谱柱、检测器、气化室、容量瓶、微量注射器、移液管。3.3试剂无水乙醇、丙酮、正丁醇。4实验步骤(1)实验样品的准备①内标样的配制称取10g正丁醇、10g无水乙醇,用蒸馏水溶解至100mL(此标样中乙醇与正丁醇的质量分数均为50%)。由于乙醇的密度为0.802g/mL,而正丁醇的密度为0.795g/mL,两者的密度相近,因此,可用移液管量取10mL乙醇和10mL正丁醇来配制内标液。②内标样测样的配制a.无水乙醇6g+10g正丁醇,定容至100mL,此溶液乙醇质量分数为37.5%。正丁醇为62.5%。b.无水乙醇8g+10g正丁醇,定容至100mL。此溶液乙醇质量分数为44.44%,正丁醇为58.8%。c.无水乙醇7g+10g正丁醇,定容至100mL,此溶液乙醇质量分数为41.18%,正丁醇为55.6%。d.无水乙醇9g+10g正丁醇,定容至100mL,此溶液乙醇质量分数为47.37%,正丁醇为52.7%。e.无水乙醇11g+10g正丁醇,定容至100mL,此溶液乙醇质量分数为52.38%,正丁醇为47.6%。(以上溶液用于工作曲线的绘制)f.测试液:白酒20mL+10mL正丁醇,定容至100mL。4实验步骤(2)色谱条件的设定①接通电源,开启气相色谱仪。②开启气路阀门,调节N2和H2压力至0.3~0.4MPa。打开气体压缩机,进行气路流量调节。各气路流量分别为载气(N2):1.5~2mL/min,H2:60~70mL/min,空气:250~300mL/min。③温度控制系统的调节,调整气化室温度为150℃。检测器的温度为200℃,柱温箱温度调至40℃。待仪器温度稳定后,点燃检测器氢火焰,完成仪器的准备工作,即可进行样品分析。(3)样品分析①校正因子测量:准确称取10g正丁醇和10g无水乙醇,用蒸馏水定容至100mL。作为标准液。②内标样色谱分析:进样量为0.2μL。测定乙醇和正丁醇的校正因子。③绘制校正曲线:以乙醇质量浓度(g/mL)为横坐标、相对校正因子(乙醇/正丁醇)为纵坐标作图。④对白酒样进行分析。⑤色谱峰定性方法:在1mL左右的内标样中加入3~4滴无水乙醇。进行色谱测定,观察哪个峰的乙醇含量增大,则该峰为乙醇峰。6思考题色谱仪的开启顺序和关机顺序是什么?如果顺序错误会产生什么后果?5结果与分析将实验结果记录在表7-7中。实验六

高效液相色谱法测定槐花中芦丁含量1实验目的(1)了解高效液相色谱法分离有机化合物的基本原理及操作条件。(2)掌握高效液相色谱仪的基本结构及作用。(3)了解HPLC法测定槐花中芦丁含量的方法。高效液相色谱分离基于试样中各组分在色谱柱的流动相(淋洗液)和固定相之间分配系数的差异。当试样随着流动相进入色谱柱后,组分在两相之间进行反复多次(102~106)的分配(吸附-脱附-溶解)。由于固定相对不同组分的吸附能力(保留作用)存在差异,各组分在色谱柱中的迁移速度不同,经过一定柱长后逐步分离,依次离开色谱柱进入检测器。检测器将产生的信号放大后,在记录系统中描绘出各组分的色谱峰。芦丁是豆科植物槐树花的主要有效成分之一,具有维生素P样活性,可保护和恢复毛细血管弹性,调节其渗透性。在医药领域,芦丁可作为高血压、脑出血的辅助治疗药物;在化妆品工业中可用作防晒剂原料;同时也是合成乙基芦丁的原料。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料槐花。3.2仪器设备日本岛津高效液相色谱仪、电子天平、恒温干燥箱、超声提取器。3.3试剂甲醇(色谱级)、冰醋酸、芦丁、乙醇、双蒸水。4实验步骤(1)色谱条件设置固定相:ODS色谱柱;流动相:甲醇-1%冰醋酸溶液(40∶60);流速:1.0mL/min;进样量:10μL;柱温:30℃;检测波长:257nm。(2)芦丁标准品的制备精密称取芦丁标准品10mg,置于50mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,制成每1mL含芦丁0.2mg的对照品储备液。(3)供试品溶液的制备精密称取干燥的槐花粉末(过40目筛)约100mg,置于50mL量瓶中,加入甲醇至刻度,浸泡1h,超声波处理(功率250W,频率25kHz)40min,放冷至室温,用甲醇补足减失的量至刻度,摇匀,滤过。精密量取滤液2mL,置于10mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,即得供试品溶液。(4)标准曲线的绘制取适量对照品储备液,配制成浓度依次为10、20、40、60、80、100μg/mL芦丁溶液。按前述色谱条件,精密吸取10μL各浓度溶液注入高效液相色谱仪,记录峰面积。以芦丁浓度为横坐标,对应峰面积为纵坐标,进行线性回归分析,绘制标准曲线。(5)样品测定吸取供试品溶液10μL,按上述色谱条件,采用工作曲线法测定,计算芦丁的含量。6思考题高效液相色谱仪主要由几部分组成?流动相用什么输送?液相色谱的检测器类型有哪些?哪些是通用型检测器?哪些是选择型检测器?5结果与分析(1)标准曲线及线性范围。按上述色谱条件分析,以对照品浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),进行线性回归,得出标准曲线。(2)分析测得的芦丁色谱图,计算槐花中的芦丁含量。实验七

薄层色谱法测定苏丹红1实验目的(1)掌握薄层色谱法的基本原理。(2)熟悉薄层色谱法的基本操作。(3)样品中苏丹红的测定。薄层色谱法(薄层层析法)的分离原理基于吸附色谱或分配色谱。其操作是将吸附剂(固定相)均匀地铺在玻璃板上制成薄层,把要分离的试样点加在薄层上,然后用合适的溶剂展开。通过化合物自身颜色或显色剂显色后,在板上出现一系列斑点,从而达到分离、鉴定和定量测定的目的。通常用比移值(Rf

)表示溶质(样品)移动和展开剂(流动相)移动的关系。物质间的

Rf

值相差越大,分离效果越理想。良好的分离,比移值应在0.15~0.75,否则应该调换展开剂重新展开。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料辣椒粉:取1.0g样品于试管中,加入3~5mL正己烷,振摇提取2min,静置3min。3.2仪器设备层析缸、高效硅胶G板、毛细管、研钵、铅笔、格尺、容量瓶(100mL)、试管、试管架。3.3试剂及其配制方法正己烷、乙醚、氯仿、苏丹红、甲酸。①苏丹红标准溶液:准确称取苏丹红0.005g,用少量乙醚溶解后,转移至50mL容量瓶中,用正己烷定容至刻度线,摇匀。此溶液浓度为100μg/mL。②展开剂的配制:石油醚-无水乙醚-甲酸(体积比80∶20∶10)4实验步骤(1)薄层板的活化将薄层板置于110℃烘箱中活化30min,取出稍冷后置于干燥器中干燥密封保存,备用。(2)点样在层析板下端1.5cm处,用铅笔轻划水平横线作为起始线,并将点样位置标记为原点。用微量毛细管吸取苏丹红溶液,点样于起始线原点处。每两个样点之间的距离应不小于1cm。若颜色过浅,可重复点样,但需待前次样点自然晾干或用冷风吹干后进行,确保斑点直径控制在1~2mm。(3)展开用石油醚-无水乙醚-甲酸(体积比为80∶20∶10)作为展开剂。待样点干燥后,小心放入已加入展开剂的250mL层析缸中进行展开。点样一端应浸入展开剂0.5cm。观察展开剂前沿上升至距离板上端1cm处时,取出薄层板,立即用铅笔标记溶剂前沿位置。晾干后找出各斑点中心,用尺量出各斑点中心到原点的距离和溶剂前沿到原点的距离,计算各样品的比移值Rf,并定性确定混合物中各物质名称。将实验结果记录在表7-8中。4实验步骤※注意事项:①点样时,点要细,直径不要大于2mm,间隔0.5cm以上,浓度不可过大,以免出现拖尾、混杂现象。②展开用的层析缸要洗净烘干,放入薄层板之前,要先加展开剂,盖上表面皿,使层析缸内形成一定的蒸气压。5结果与分析(1)用图片记录实验结果。(2)将数据记录在表7-9中。(3)分析样品成分。计算各样品的比移值Rf

并定性确定混合物中各物质名称。6思考题①什么是

Rf,为什么可以利用

Rf来鉴定化合物?②在混合物薄层色谱法实验中,如何判定各组分在薄层板上的位置?③展开剂的高度若超过了点样线,对薄层色谱有何影响?实验八

气相色谱法测定藿香正气水中乙醇的含量1实验目的(1)掌握用气相色谱法测定中药制剂中乙醇含量的方法。(2)熟悉气相色谱定量分析操作方法。藿香正气水为酊剂,由苍术、陈皮、广藿香等十味药组成,制备过程中以乙醇为溶剂。由于制剂中乙醇含量直接影响有效成分的溶出量、杂质的类型与数量,以及制剂的稳定性等关键质量属性,因此《中华人民共和国药典》明确规定需对该类制剂进行乙醇含量测定。乙醇具有挥发性,《中华人民共和国药典》采用气相色谱法测定各种制剂在20℃时乙醇(C2H5OH)的含量(%,mL/mL)。由于中药制剂中并非所有组分都能全部出峰,因此采用内标法定量。色谱条件如下:填充柱或毛细管柱,以直径为0.18~0.25mm的二乙烯苯-乙基乙烯苯型高分子多孔小球作为载体,柱温为120℃~150℃,流动相为氮气,检测器为氢火焰离子化检测器。2实验原理3实验材料及设备3.1样品藿香正气水(市售)。3.2仪器设备气相色谱仪、微量注射器。3.3试剂无水乙醇、正丙醇。4实验步骤(1)标准溶液的制备精密量取恒温至20℃的无水乙醇和正丙醇各5mL,加水稀释至100mL,混匀,即得。(2)供试品溶液的制备精密量取恒温至20℃的藿香正气水10mL和正丙醇5mL,加水稀释至100mL,混匀,即得。(3)测定法①校正因子的测定:取标准溶液2μL,连续注样3次,记录对照品无水乙醇和内标物质正丙醇的峰面积,可计算校正因子为式中

As———内标物质正丙醇的峰面积;AR———对照品无水乙醇的峰面积;Cs———内标物质正丙醇的浓度;CR———对照品无水乙醇的浓度。取3次计算的平均值作为结果。②供试品溶液的测定:取供试品溶液2μL,连续注样3次,记录供试品中待测组分乙醇和内标物质正丙醇的峰面积,并计算含量式中

Ax供试品溶液峰面积;Cx———供试品的浓度。取3次计算的平均值作为结果。藿香正气水乙醇含量应为40%~50%。6思考题①内标物应符合哪些条件?②实验过程中可能引入误差的因素有哪些?5结果与分析(1)计算校正因子。(2)计算样品中的乙醇含量。实验九

高效液相色谱法测定阿司匹林片剂中乙酰水杨酸含量1实验目的(1)了解高效液相色谱法分离有机化合物的基本原理及操作条件。(2)掌握高效液相色谱仪的基本结构及作用。(3)了解高效液相色谱法测定阿司匹林药片中水杨酸的方法。高效液相色谱法是20世纪70年代迅速发展起来的一项高效、快速的分离分析技术。液相色谱法是指流动相为液体的色谱技术。在经典液体柱色谱法的基础上,引入了气相色谱法的理论基础,在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器,实现了分析速度快,分离效率高和操作自动化。这种柱色谱技术被称为高效液相色谱法。它可以用于液固吸附,液液分配,离子交换和空间排阻色谱(凝胶渗透色谱)分析,应用非常广泛。阿司匹林(乙酰水杨酸)是一种常用的解热抗炎药,广泛用于防治心脑血管疾病。市售阿司匹林泡腾片的主要成分是乙酰水杨酸,辅料包括玉米淀粉、碳酸钙、胶体二氧化硅、糖精钠、香精等。由于乙酰水杨酸很容易降解为水杨酸,药物中水杨酸含量测定常作为阿司匹林药物质量检测的指标。采用液相色谱法可有效分离乙酰水杨酸和水杨酸,二者的含量可以用外标法进行定量测定。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料阿司匹林泡腾片(市售成品药)。3.2仪器设备高效液相色谱仪、自动进样器、过滤装置、固定相:C18键合多孔硅胶小球。3.3试剂双蒸水、甲醇(色谱级)、冰醋酸。4实验步骤(1)仪器的准备工作①泵a.确保流动相的充足,一般应在所预计的消耗量之上增加150mL,以保证仪器正常运行。b.流动相要新鲜,一般情况下一次制得的纯水应在连续的24h内用完,未用完的应弃掉。②

溶剂管道仪器开机前,更换流动相后,管路中会有一些气体,而这些气体会对柱、泵及检测器产生不同程度的影响。因此,要求开机时每次都要对管路进行脱气。③自动进样器当连续使用中需要更换样品类型或流动相黏度较大时,应每次进样完成后进行洗针。④柱温箱柱温箱应在打开电源且柱连接好后,及时设置为方法要求的温度。⑤检测器为减少能量浪费,检测器应在样品准备好,且仪器系统按要求的流动相及流速平衡至少30min后再打开。完成自检20min以后方可开始样品的分析。4实验步骤(2)阿司匹林溶液的配制取阿司匹林泡腾片10片,精密称定,充分研细。精密称取细粉适量(约相当于阿司匹林50mg),置于10mL量瓶中,加入含0.6%冰醋酸的甲醇水溶液,强烈振摇使其溶解,并用含0.6%冰醋酸的甲醇水溶液稀释至刻度,摇匀。用有机相滤膜(孔径:0.45μm)滤过,将适量的滤液放入样品瓶中待测。(3)色谱条件的选择固定相:C18键合多孔硅胶小球。流动相:甲醇/水/冰醋酸=70/30/0.6。流量:0.5mL/min。紫外检测波长:280nm。温度:30℃。(4)样品的测定自动进样器会精密量取样品滤液1μL,注射到管路系统中,同时开始计时,并记录色谱图。色谱工作站会保存并处理所得的色谱数据。(5)实验结束按操作流程关闭仪器,整理打扫实验台。6思考题①高效液相色谱的基本组成有哪几部分?②色谱定性、定量分析的方法有哪些?5结果与分析根据色谱图的数据,分析样品峰的归属并计算相应的百分含量。细胞工程实验实验一

培养材料灭菌和接种实验二

愈伤组织的诱导与增殖实验三

愈伤组织的分化实验四

植物细胞悬浮培养与同步化实验五

细胞原代培养实验六

细胞传代培养实验七

细胞的冻存和复苏实验八

骨髓干细胞的提取及培养实验九

细胞的分裂指实验十

细胞周期的测定实验一

培养材料灭菌和接种1实验目的培养材料的灭菌与接种是组织培养过程中的一个重要环节。通过本实验,了解无菌培养对实验材料消毒、接种的要求,初步掌握培养材料灭菌,接种的操作技术。2实验原理无菌操作是在无菌室或超净台中进行,防止微生物进入人体或污染供试菌的操作技术。它是各种生物实验和生产实践中一项重要的基本操作。无论植物组织培养,还是动物细胞培养,都需要无菌技术的支撑。本实验涉及无菌操作台的操作规范,防止微生物感染破坏培养目标的连续培养,是一切细胞培养的基础。3实验材料及设备3.1实验材料胡萝卜块根、绿豆种子。3.2仪器设备超净工作台、镊子、解剖刀、酒精灯、脱脂棉、烧杯(50mL)、广口瓶(200mL)、一次性培养皿。3.3试剂0.1%升汞、酒精、次氯酸钠、无菌水、培养基母液。4实验步骤(1)准备好培养基,无菌水,培养皿及接种工具。(2)将培养基、无菌水、接种工具置于接种台上,打开超净台紫外灯开关,同时打开接种室内的紫外灯,用紫外灯照射至少25min。然后,关室内紫外灯,打开送风开关,关闭台内的紫外灯,通风10min后,再开日光灯进行无菌操作。(3)接种前用肥皂洗手,特别是将手指洗净,然后用蘸有75%酒精的棉球把手消毒一次。(4)将绿豆种子在流水下冲洗干净。(5)将绿豆种子放于200mL广口瓶中,用75%的酒精溶液浸泡30s,然后用无菌水冲洗。接下来用0.1%升汞溶液(加入吐温2滴)浸泡样品,分别设置3mm、5mm、10min三个梯度处理时间,其间不断摇动溶液,然后用无菌水洗涤5遍,待用。(6)解除三角瓶上捆扎的线绳。必要时,可以用蘸有75%酒精的棉球擦洗三角瓶表面。将三角瓶整齐排列在接种台左侧,用75%酒精擦洗接种台表面。(7)接种用的镊子使用前插入95%乙醇溶液中,使用时在酒精灯上烧片刻,冷却后待用。(8)在酒精灯火焰旁揭去封口膜,将瓶口倾斜接近水平方向,用火焰灼烧瓶口。灼烧时应不断转动瓶口(靠手腕的动作,使试管口沾染的少量菌得以烧死),左手持瓶,使其靠近火焰,右手将烧过的镊子触动培养基部分,使其冷却。夹取绿豆种子,将其放在培养基上,用镊子轻轻按一下,使其部分浸入培养基。每瓶可放4~6个外植体。(9)转动瓶口灼烧后,将封口膜从酒精灯火焰上过一下,盖上封口膜,扎好绳子,标上接种日期、材料名称、姓名等。(10)将接种材料移到培养室培养。4实验步骤※注意事项:①从室外取得材料,要用自来水冲洗数分钟,对表面不光滑或长有绒毛等结构、不容易洗净的材料,冲洗时间要长,必要时可用毛刷刷洗。②外植体消毒剂的选择要综合考虑消毒效果、不同材料对灭菌剂的耐受力、灭菌剂的去除等因素,最好选用两种消毒剂交替浸泡。初次实验时,灭菌时间要设置一定的时间梯度,以确定最佳的灭菌时间。常用的消毒剂见表8-1。4实验步骤③在工作台接种时,应尽量避免明显扰乱气流的动作(如说、笑、打喷嚏),以免影响气流,造成污染。另外,操作过程中要不时用75%的酒精擦拭双手。④接种前培养基出现大量污染现象,若菌类只存在于培养基表面,且主要是真菌污染时,可能由培养瓶密封不严或存放环境不洁净、微生物种群密度过高所致。若污染菌存在于培养基内部,则可能是使用了污染的贮藏母液。此外,培养瓶不洁净或灭菌不彻底也是导致接种前污染的重要原因。避免此现象发生的方法包括:保持操作环境洁净,杜绝使用污染的母液,严格执行高压蒸汽灭菌程序,确保达到规定的灭菌时间和温度。⑤接种后,若培养基出现大面积污染且菌落分布不匀,此种情况主要是接种过程中发生的污染所致。可能的原因包括:接种室不洁净、菌类孢子过多、镊子带菌、操作人员手未彻底消毒、操作人员呼吸,以及超净工作台出现故障等。避免此现象发生的方法是:保持无菌接种室洁净,并定期用甲醛等熏蒸灭菌;在接种前,无菌室用紫外灯灭菌时间不低于20~30min;用75%酒精喷雾进行杀菌和降尘,超净台开启15~20min后方可使用;镊子等接种工具必须经过严格彻底灭菌处理,且每次使用后都要重新灭菌一次;在操作过程中,应经常使用75%酒精等消毒剂擦洗手部、腕部等可能接触到的区域。⑥接种后若外植体周围发生菌类污染,可能由外植体表面灭菌不彻底所致。解决方法如下:将外植体用饱和洗涤剂浸泡10~15min,然后用自来水冲洗0.5~2h。之后,选择适宜的灭菌剂进行消毒。一般而言,使用0.1%~0.2%的升汞灭菌效果较好。对于一些凹凸不平或有茸毛的外植体,可以在灭菌剂中加入“吐温80”等湿润剂,以增加其渗透性,从而提高杀菌效果。5思考题①外植体用消毒剂消毒后,为什么要用无菌水漂洗?有时候会在消毒溶液中加入1~2滴表面活性物质,例如吐温80或吐温20,为什么?②在接种过程中,通过哪些措施来防止细菌对接种工具、接种材料的污染?③对外植体表面消毒时为什么常用“两次消毒法”?实验二

愈伤组织的诱导与

增殖1实验目的学习诱导植物外植体形成愈伤组织的方法。植物生长调节剂是诱导愈伤组织形成的重要因素。对有些植物材料而言,生长素和细胞分裂素对维持愈伤组织的快速生长是必要的,特别是两者结合使用时,能更有效地刺激愈伤组织的形成。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料胡萝卜。3.2仪器设备超净工作台、镊子、解剖刀、酒精灯、棉球、烧杯(50mL)、广口瓶(200mL)、一次性培养皿。3.3试剂0.1%升汞、75%酒精、次氯酸钠、无菌水、培养基母液、2,4-D、水解酪蛋白、氯化汞。4实验步骤(1)配制培养基①诱导胡萝卜愈伤组织的培养基:MS+2,4-D1.5mg/L+CH500mg/L+3%蔗糖+0.7%琼脂,pH为5.8。②愈伤组织增殖培养基:MS+2,4-D0.5mg/L+CH500mg/L+3%蔗糖+0.7%琼脂,pH为5.8。(2)胡萝卜营养根的消毒。①将胡萝卜块根在自来水下冲洗干净,用小刀切去外围组织。然后将胡萝卜切段,每段厚约0.5cm。②将胡萝卜段用无菌水漂洗干净。③将胡萝卜段在75%的酒精溶液中浸泡30s。④将胡萝卜段在0.1%氯化汞溶液中分别浸泡2min、5min、10min、12min。在浸泡过程中,使用镊子轻轻搅拌,以确保消毒充分。⑤浸泡后的胡萝卜段用无菌水冲洗3~5次,洗去残留的氯化汞后切片。(3)三角瓶的准备解开三角瓶上捆扎的线绳。如有必要,可以用蘸有75%酒精的棉球擦拭三角瓶表面。将三角瓶按培养基处理的要求整齐排列在接种台左侧,然后用75%酒精擦洗接种台表面。4实验步骤(4)胡萝卜营养根切片胡萝卜营养根由外向内依次分为皮层、形成层和中轴三部分。在切片消毒之前,首先除去皮层的最外层,以减少胡萝卜营养根的带菌量。形成层的分生能力最强,是产生愈伤组织的主要部分,因此在切片时应使每一个切片上都有形成层。消毒以后的所有操作过程,都应在超净工作台上进行。操作所用的镊子、解剖刀和剪刀使用前应插入95%乙醇溶液中,使用时在酒精灯火焰上灼烧片刻,冷却后再进行操作。(5)接种操作过程轻轻打开封口膜,将三角瓶口在火焰上方灼烧2~3s以进行灭菌,同时将长镊子也放在火焰上方灼烧消毒。将烧过的镊子轻轻触动培养基部分,使其冷却,避免高温烧死被接种的外植体。然后,将培养皿打开一小缝,用镊子取出切好的胡萝卜切片,放置在培养基表面,并用镊子轻轻向下按一下,使切片部分嵌入培养基。在酒精灯火焰上转动三角瓶一圈,再次对瓶口进行灼热灭菌。然后用封口膜封口,并在牛皮纸上记录培养材料、接种日期、姓名等信息。※注意事项:植物生长调节剂是诱导愈伤组织形成极为重要的因素。研究具体问题时,要设置一定的浓度梯度,以寻找最佳浓度。5结果与分析①在接种1周后,观察接种的外植体产生愈伤组织的颜色和质地,计算愈伤组织诱导率。②分析影响愈伤组织诱导和分化的主要原因。实验三

愈伤组织的分化1实验目的了解愈伤组织再分化原理,学习诱导愈伤组织分化的方法。愈伤组织在离体培养过程中,组织和细胞的潜在发育能力可以在某种程度上得到表达,伴随着反复的细胞分裂,又开始新的分化。将脱分化的细胞团或组织重新分化,而产生新的具有特定结构和功能的组织或器官的一种现象,称为再分化。在一定的培养条件下,愈伤组织通过分化可以形成苗或根的分生组织,甚至是胚状体,继而发育成完整的植株。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料胡萝卜。3.2仪器设备超净工作台、镊子、酒精灯、棉球、烧杯(50mL)、广口瓶(200mL)、一次性培养皿。3.3试剂培养基母液、6-BA、NAA、IBA、蔗糖、琼脂。4实验步骤(1)诱导胡萝卜愈伤组织形成(参见实验二)。(2)配制生芽和生根培养基。①分化培养基(生芽):MS+6-BA1mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖3%+琼脂0.7%,pH为5.8。②生根培养基:1/2大量元素+MS其他成分+IBA1mg/L+蔗糖3%+琼脂0.7%,pH为5.8。(3)具体操作:按照无菌操作,小心挑取愈伤组织3~5个,放置到分化培养基中。注意标明接种日期和外植体名称。(4)放置培养室培养,10d后统计愈伤组织分化情况。①统计愈伤组织分化率和生根率。5思考题②愈伤组织发生不定芽和不定根的能力与哪些因素有关?实验四

植物细胞悬浮培养与同步化1实验目的学习和掌握植物细胞悬浮培养的常规方法及同步化方法。植物离体细胞作为生物反应器,具有生产周期短、提取简单、易规模化、不受外界环境干扰、产量高,以及化学稳定性和化学特性好等特点。因此,利用植物离体细胞培养进行有用次生代谢物质的生产一直受到研究者的重视,且已有成功先例。同时,研究发现,在离体培养条件下,细胞系的种类、培养条件、培养基的组成及植物生长调节剂等,均会对次生代谢物质的合成产生重要影响。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料胡萝卜。3.2仪器设备超净工作台、震荡摇床、接种工具、手动吸管泵、尼龙网、移液管、吸耳球、漏斗、离心管(20mL)、离心机。3.3试剂培养基母液、2,4-D、蔗糖、琼脂。4实验步骤(1)诱导愈伤组织形成(参见实验二)。(2)制备液体培养基:MS+2,4-D1mg/L+蔗糖3%.(3)在超净工作台上,从形成愈伤组织的培养瓶中,挑选质地松弛、生长旺盛的愈伤组织,放入盛有30mL液体培养基的三角瓶中,用镊子轻轻捏碎愈伤组织。每瓶接入约2g愈伤组织,置于震荡摇床固定,在黑暗条件下或弱散射光下,以100r/min的转速震荡培养。(4)将胡萝卜悬浮细胞培养物摇匀后倒在或滴入孔径较大的尼龙网或不锈钢网漏斗中(孔径47μm,81μm或更大)。(5)如果网眼被细胞团堵塞,可用吸管反复吸、吹。(6)再用无菌培养基冲洗残留在网上的细胞团。(7)重复步骤4~6。(8)将细胞悬浮液先通过较大孔径的尼龙网过滤,再通过较细孔径(31μm或26μm)的尼龙网过滤,并用吸管反复吸吹,以确保细胞分散均匀。(9)经过分级过滤的细胞,经离心(50g,5min)后收集,然后加入液体培养基进行培养,或进一步同步化处理。5思考题①研究细胞悬浮培养的意义是什么?挑选愈伤组织进行悬浮培养需注意什么问题?②建立细胞悬浮系的步骤包括哪些?一个良好的悬浮细胞培养体系应该具有什么样的特征?实验五

细胞原代培养1实验目的学习动物细胞培养中最常用的消化法进行细胞原代培养的实验过程,为细胞纯化、冷冻保存、生长曲线的测定和细胞活性检查等实验奠定基础,并进一步学习无菌操作技术。将活体的一小片组织放在盛有培养液的玻璃或塑料培养器皿中,待组织块黏着后,沿底面平面移动生长的过程称为组织培养。从组织块中生长出来的仍然是细胞。细胞在生长的同时也发生移动,致使组织培养难以长时间维持其原有结构,最终结果就成了细胞培养。将动物机体的各种组织从机体中取出,经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理,分散成单细胞,置于合适的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖,这一过程称为原代培养。利用胰蛋白酶消化分解细胞间的连接,将组织解离成单细胞悬液后进行贴壁培养,从而得到大量的组织细胞。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料胎鼠或新生鼠。3.2仪器设备CO2

培养箱(调整至37℃),一次性培养瓶(75mL3)、一次性培养板、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、棉球、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱(37℃)。3.3试剂1640培养基(含20%小牛血清)、0.25%胰酶、胎牛血清、Hank’s液、碘酒、酒精。①D-Hank’s液配方:KH2PO40.06g,NaCl8g,NaHCO30.35g,KCl0.4g,葡萄糖1g,Na2HPO4·H2O0.06g,加水定容至1000mL。②Hank’s液配方:CaCl20.14g,KCl0.4g,KH2PO40.06g,MgCl2·6H2O0.1g,MgSO4·7H2O0.1g,NaCl8g,NaHCO30.35g,葡萄糖1g,Na2HPO4·7H2O0.09g,加水定容至1000mL。(注:Hank’s液可以高压灭菌,置于4℃保存)4实验步骤4.1胰酶消化法(1)将妊娠10~14d的母鼠或新生小鼠拉颈椎致死,置于75%酒精中浸泡2~3s(时间不能过长,以免酒精从口和肛门浸入体内)。再用碘酒消毒腹部。在超净台内解剖取胎鼠(或将新生小鼠直接置于超净台内)。解剖取肝脏,置于平皿中。(2)用Hank’s液洗涤肝脏三次,并剔除脂肪,结缔组织,血液等杂物。(3)用手术剪将肝脏剪成小块(1mm2),再用Hank’s液清洗三次,转移至培养板中。(4)根据组织块的量加入5~6倍体积的0.25%胰酶液(称取所需胰蛋白酶,加入无菌的D-Hank’s溶液中,用1mol/L的NaOH溶液调节pH至7.2~7.4。过滤除菌,分装后置于-20℃冻存备用)。将组织块置于37℃环境中消化20~40min,每隔5min振荡一次,或用吸管吹打一次,以促进细胞分离。(5)加入3~5mL含5%胎牛血清(FBS)的Hank’s液,以终止胰酶的消化作用(或加入胰酶抑制剂)。(6)静置5~10min,使未分散的组织块下沉,将上清液(细胞悬液)转移至离心管中。(7)以1000r/min,离心10min,弃上清液。(8)加入5mLHank’s液,冲散细胞,再离心一次,弃上清液。(9)加入1~2mL培养液(视细胞量而定),用血球计数板计数细胞。4实验步骤4.1胰酶消化法(10)将细胞浓度调整至约5×105个/mL,转移至75mL3细胞培养瓶中,在37℃下培养。上

述消化分离方法是最基本的方法。在此基础上,可以根据需要进一步分离不同类型的细胞。不同实验室的细胞分离方法可能不同,所采用的消化酶也不相同(如胶原酶,透明质酸酶等)。4.2组织块直接培养法按4.1中操作步骤(1)~(3)操作后,将组织块转移到培养瓶中,使其贴附于瓶底。翻转培养瓶,使瓶底朝上,将培养液加至瓶中,但不要让培养液接触组织块。在37℃下静置3~5h,轻轻翻转培养瓶,使组织浸入培养液中(避免组织漂起),继续在37℃下培养。※注意事项:①自取材开始,保持所有组织和细胞处于无菌条件。细胞计数可以在有菌环境中进行。②在超净台中,组织、细胞、培养液等不能暴露过久,以免溶液蒸发。③凡在超净台外操作的步骤,各器皿需用盖子或橡皮塞,以防止细菌落入。④根据组织类型选择适当的消化液,并控制消化时间,尽量减少细胞损伤。5思考题比较组织培养法和消化培养法获得原代培养物的效果和优缺点。实验六

细胞传代培养1实验目的以原代培养的胎鼠细胞为材料,学习动物细胞培养中最常用的消化法进行细胞传代培养的实验过程,为细胞纯化、冷冻保存、生长曲线的测定和细胞活性检查等实验奠定基础。细胞在培养瓶中长成致密单层后,已基本饱和。为了使细胞能继续生长并扩大数量,必须进行传代(再培养),否则细胞将因密度抑制和接触抑制而停止生长。传代培养不仅是一种保存细胞的方法,也是利用培养细胞进行各种实验的必要步骤。悬浮型细胞传代培养可以直接分瓶,而贴壁细胞需要经过消化后才能分瓶。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料胎鼠或新生鼠。3.2仪器设备超净工作台、CO2

培养箱、倒置显微镜、卡氏培养瓶、废液缸、酒精灯、吸管、滤膜。3.3试剂Hank’s液、D-Hank’s液、胰酶溶液、1640培养基。1实验目的以原代培养的胎鼠细胞为材料,学习动物细胞培养中最常用的消化法进行细胞传代培养的实验过程,为细胞纯化、冷冻保存、生长曲线的测定和细胞活性检查等实验奠定基础。细胞在培养瓶中长成致密单层后,已基本饱和。为了使细胞能继续生长并扩大数量,必须进行传代(再培养),否则细胞将因密度抑制和接触抑制而停止生长。传代培养不仅是一种保存细胞的方法,也是利用培养细胞进行各种实验的必要步骤。悬浮型细胞传代培养可以直接分瓶,而贴壁细胞需要经过消化后才能分瓶。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料胎鼠或新生鼠。3.2仪器设备超净工作台、CO2

培养箱、倒置显微镜、卡氏培养瓶、废液缸、酒精灯、吸管、滤膜。3.3试剂Hank’s液、D-Hank’s液、胰酶溶液、1640培养基。4实验步骤(1)将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去,用2mLHank’s液清洗一次。(2)加入0.5~1mL0.25%胰酶溶液,确保瓶底的细胞完全浸入溶液中。(3)瓶口塞好橡皮塞,放在倒置显微镜下观察细胞。随着时间推移,原贴壁的细胞会逐渐趋于圆形。在细胞还未漂起时,弃去胰酶溶液(约需3min),加入10mLHank’s液以终止消化。观察消化也可以用肉眼,当瓶底发白并出现细针孔状空隙时,消化终止。一般室温下消化时间为1~3min。注意加Hank’s液冲洗细胞时,动作要轻,以免将已松动的细胞冲掉。(4)加入5mL培养液,用吸管吸取培养液将贴壁的细胞吹打成均匀的悬液,吹打时勿用力过猛,以免损伤细胞。(5)将悬浮液分成等份,接种到另外三个培养瓶中,每个培养瓶中加入培养液3mL,塞好橡皮塞,置于37℃培养箱中继续培养。每三天更换一次培养液,观察细胞的贴壁生长情况。5思考题什么是细胞株?什么是细胞系?两者相同吗?实验七

细胞的冻存和复苏1实验目的了解细胞冻存的常用方法和复苏方法,为后续的综合实验奠定基础。在不加任何保护剂的情况下直接冻存细胞时,细胞内外的水分都会形成冰晶,这会导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白质变性、甚至引起细胞死亡。如果向培养液中加入保护剂,可以使冰点降低。在缓慢冻结条件下,保护剂能帮助细胞内的水分在冻结前透出细胞,减少冰晶的形成。将细胞贮存在-130℃以下的低温环境中,可以进一步减少冰晶的形成。细胞复苏时,速度要尽可能快,以便迅速通过细胞最易受损的温度区间(-5~0℃)。如果复苏得当,细胞仍能正常生长,活力受损不大。目前,常用的保护剂为二甲基亚砜(DMSO)和甘油,它们对细胞无毒性,分子量小,溶解度大,易穿透细胞。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料胎鼠或新生鼠。3.2仪器设备液氮罐、冻存管(塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶)、离心管(10mL)、离心机、水浴锅、血球记数板。3.3试剂2.5%胰酶、1640培养基、甘油、DMSO。4实验步骤(1)冻存①按照常规的实验方法消化细胞,将细胞悬液收集至离心管中。②以1000r/min转速离心10min,弃上清液。用Hank’s液清洗1~2次。③使用配制好的Hank’s液+20%胎牛血清+10%甘油或DMSO的细胞冻存液。将沉淀用冻存液稀释,计数,调整细胞浓度至5×106个/mL左右。④将细胞悬液分装至冻存管中,每管1mL。⑤将冻存管口封严。如果使用安瓿瓶,则进行火焰封口,封口一定要严,否则复苏时易出现爆裂。⑥在冻存管上贴上标签,写明细胞种类和冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。⑦按下列步骤降温:室温→4℃(20min)→冰箱冷冻室(30min)→低温冰箱(-30℃,1h)→气态氮(30min)→液氮。(2)复苏①准备一个茶缸或1000mL的烧坏,内装2/3的37℃温水。②从液氮中迅速取出冻存管,立即置于温水中,并不断搅动,使冻存管中的冻存物在1min内融化。4实验步骤③用酒精棉球消毒冻存管表面,打开冻存管,将细胞悬液吸到离心管中,并立即加入5倍以上的Hank’s液。④以1000r/min转速离心10min,弃去上清液。⑤将沉淀加10mL培养液,吹打均匀,再离心10min,弃上清液。⑥加入适量培养基,调整细胞浓度至5×105个/mL。将细胞转移至培养瓶中,37℃、5%二氧化碳、饱和湿度下培养。第二天观察细胞生长情况。※注意事项:冷冻操作和添加液氮时要注意戴保护眼镜和手套,避免液氮伤人。切勿用手直接接触液氮,以免冻伤。液氮要定期检查,当液氮挥发1/2时要及时补充,绝对不能挥发干净。一般30L液氮能用30~45d。留在液氮罐外的细绳要做好标记,并沿着罐口顺序摆放。5思考题在冷冻过程中为什么要用慢速冷冻的方法,而不采用将细胞放入液氮中的超速冷冻方法?复苏时则相反,为什么?实验八

骨髓干细胞的提取及

培养1实验目的了解骨髓干细胞的常用提取方法和培养方法,熟练掌握梯度密度离心技术,为后续的综合实验奠定基础。骨髓间充质干细胞是骨髓中除造血细胞以外的中胚层来源的细胞,其细胞特性稳定,即使在连续传代培养和冻存后仍保持多向分化潜能。本实验采用梯度密度离心法。通过在离心管内形成连续或不连续的密度梯度,将细胞混悬液或匀浆置于介质顶部,利用重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。常用的密度梯度离心介质包括氯化铯,蔗糖和多聚蔗糖等。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料胎鼠或新生鼠。3.2仪器设备6孔培养板、天平、振荡器、高速离心机、微量移液器(量程:0.5~10μL、20~200μL和100~1000μL)。移液枪(1mL、200μL、20μL、10μL、2μL),吸头(1mL、200μL、20μL)、匀浆管(5mL)、吸头盒(1mL、20μL)、离心管(10mL)、棕色广口试剂瓶(60mL)、青霉素小瓶(分装无水乙醇,高压的DEPC水,-20℃保存)、量筒(50mL、250mL、500mL)、容量瓶(250mL、500mL、1000mL)、试管架(适用于5mL、1.5mL、20μL试管)。3.3试剂淋巴细胞分离液、75%乙醇、α-MEM培养基、胎牛血清。4实验步骤4.1骨髓干细胞提取(1)采用脱颈法处死小白鼠,放在75%的乙醇中浸泡2~3min。(2)在无菌室内间,用灭过菌的剪刀剪下小鼠的四肢,剔除多余的肌肉组织。然后将剔好的骨头浸泡于75%乙醇中2~3min,之后用生理盐水冲洗掉残留酒精和血水。剪去股骨两端,用注射器吸取已加入肝素的生理盐水,反复冲洗小鼠骨髓腔,直至骨头呈白色。最后收集细胞悬液。(3)反复吹打细胞悬液,使其分散均匀。向10mL离心管中加入6mL淋巴细胞分离液,沿着管壁缓缓轻柔地注入3mL细胞悬液。在1800r/min,4℃条件下离心15min。(4)小心取出离心管,用1mL移液枪吸取中间白色絮状的悬浮层,转移至新的10mL离心管中。在1300r/min,4℃条件下离心10min。(5)弃掉上清液后,加入6mL胎牛血清和α-MEM培养基(按1∶9混合)。用吸管轻柔吹打细胞沉淀,使其均匀悬浮于体系中,充分混匀。(6)吸取一滴细胞悬液,在镜下用血球计数板进行细胞计数。4实验步骤4.2骨髓干细胞培养(1)使用含10%胎牛血清的混合培养基,将细胞浓度调整为5×105个/mL。然后将细胞接种于6孔培养板上,放置于37℃、5%CO2、饱和湿度95%的恒温培养箱中培养。(2)培养过夜后,观察细胞生长状况。轻轻吸出上清液,弃掉尚未贴壁的细胞,并加入新配的混合培养液,继续培养。(3)每隔3d左右更换一次培养液(可根据培养液的颜色来确定),并观察细胞生长形态。(4)待小鼠的骨髓间充质干细胞生长至成纤维细胞形态,同时呈旋涡状或放射状生长,细胞之间并不紧靠连成片,且细胞生长接近瓶底的80%时,弃掉上清液,用生理盐水冲洗2~3次,加入0.25%胰蛋白酶没过细胞层,在37℃条件下消化3~5min(根据细胞形态而定)。(5)待细胞呈圆形、不再黏连时,加入1~2滴胎牛血清终止反应。再加入新配制的混合培养基重新悬浮细胞,反复吹打混匀,接种到新的培养板。然后将培养板置于5%CO2、37℃、饱和湿度95%的恒温培养箱中继续培养。(6)培养过夜后换液,弃去未贴壁的细胞,以后每隔2d换培养液,直至细胞贴壁增殖成片,面积为瓶底80%时,重复以上操作,再次传代培养。5思考题除了梯度密度离心法以外,设计另一种干细胞提取方法。实验九

细胞的分裂指1实验目的学习和掌握细胞分裂指数的测定方法。体外培养细胞生长和分裂繁殖的能力可以通过分裂指数来表示。分裂指数与生长曲线有一定的联系。例如,随着分裂指数的不断提高,细胞进入指数生长期。分裂指数是指细胞群体中分裂细胞所占的百分比,是测定细胞周期的一个重要指标,也是不同实验研究选择细胞的重要依据。分裂指数测定可以用盖玻片培养法,也可以直接在小平皿中进行。此外,细胞分裂指数也是衡量洋葱根尖细胞分裂状况的指标之一。2实验原理3实验材料及设备3.1实验材料胎鼠或新生鼠。3.2仪器设备CO2培养箱、超净工作台、卡氏培养瓶、废液缸、酒精灯、吸管、普通显微镜、细胞培养皿、盖玻片。3.3试剂磷酸盐缓冲液、甲醇、冰醋酸、Hank’s液、D-Hank’s液、胰蛋白酶、NaOH、1640培养基、吉姆萨染液。①磷酸盐缓冲液的配制:KCl0.2g、KH2PO40.2g、NaCl8g,Na2HPO4·7H2O1.56g加水定容至1000mL。②吉姆萨染液配制:准确称取吉姆萨粉末0.5g,加几滴甘油研磨,再加入甘油(使加入的甘油总量为33mL)。在56℃下保温90~120min。加入33mL甲醇,置于棕色瓶中保存,此为吉姆萨原液。使用时按要求用磷酸盐缓冲液稀释,一般稀释10倍。4实验步骤(1)消化细胞,将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。(2)在CO2

培养箱中培养48h,使细胞长在盖玻片上。(3)取出盖玻片,按下列顺序操作:用磷酸盐缓冲液漂洗3min→将盖玻片放入甲醇-冰醋酸(体积比为3∶1)固定液中固定30min