致死型约氏疟原虫三种候选蛋白磷酸酶重组蛋白的表达与分布特征研究

致死型约氏疟原虫三种候选蛋白磷酸酶重组蛋白的表达与分布特征研究一、引言1.1研究背景与意义疟疾，作为一种古老且极具影响力的全球性公共卫生问题，至今仍在威胁着人类的健康和生活质量。世界卫生组织（WHO）的统计数据显示，全球每年约有2.4亿人感染疟疾，导致近60万人死亡，其中大多数为儿童和孕妇。疟疾不仅给患者带来了身体上的痛苦，还对家庭和社会造成了沉重的经济负担，严重阻碍了部分地区的社会经济发展。约氏疟原虫（Plasmodiumyoelii）作为疟原虫属的重要成员，是研究疟疾发病机制、宿主免疫反应以及抗疟药物研发的常用动物模型。它在许多方面与人类疟原虫具有相似的生物学特性，通过对约氏疟原虫的深入研究，能够为揭示人类疟疾的奥秘提供关键线索。例如，研究约氏疟原虫在宿主细胞内的发育过程，有助于理解疟原虫如何逃避宿主免疫系统的攻击，以及如何在宿主细胞内获取营养并进行繁殖，从而为开发新的抗疟策略提供理论基础。蛋白质磷酸酶在疟原虫的生命活动中扮演着至关重要的角色。它们参与调控疟原虫的多个生理过程，包括入侵宿主细胞、细胞周期调控、代谢调节以及对宿主免疫反应的应答等。通过对蛋白质磷酸酶的研究，可以深入了解疟原虫的致病机制，为寻找新的抗疟药物靶点提供可能。本研究聚焦的三种候选蛋白磷酸酶，在约氏疟原虫的生长、发育和致病过程中可能发挥着独特的作用。深入研究这三种候选蛋白磷酸酶的重组蛋白，不仅能够揭示它们在疟原虫生命活动中的具体功能，还能为疟疾的诊断、治疗和预防提供新的思路和方法。在诊断方面，重组蛋白可以作为潜在的诊断标志物，用于开发更加灵敏和准确的疟疾诊断方法；在治疗方面，以这些蛋白磷酸酶为靶点，有望研发出新型的抗疟药物，克服当前抗疟药物面临的耐药性问题；在预防方面，研究结果可能为疟疾疫苗的设计提供新的抗原选择，推动疟疾疫苗的研发进程。因此，本研究具有重要的理论意义和潜在的应用价值，对疟疾的防治工作具有深远的影响。1.2国内外研究现状在疟疾研究领域，约氏疟原虫作为重要的动物模型，一直是国内外学者关注的焦点。国外在约氏疟原虫的研究方面起步较早，取得了一系列重要成果。例如，通过基因编辑技术深入研究约氏疟原虫的基因功能，揭示了其在入侵宿主细胞、逃避宿主免疫反应等过程中的分子机制。在蛋白质磷酸酶研究方面，国外学者对疟原虫中一些已知的蛋白质磷酸酶进行了功能鉴定，发现它们在疟原虫的生长、发育和致病过程中发挥着关键作用，如参与调控疟原虫的细胞周期、代谢途径以及信号传导通路等。国内的相关研究也在近年来取得了显著进展。科研人员利用多种技术手段，对约氏疟原虫的生物学特性、免疫逃逸机制以及与宿主的相互作用进行了深入探究。在蛋白质磷酸酶的研究中，国内学者通过对疟原虫蛋白质组学的分析，发现了一些新的潜在蛋白磷酸酶，并对其在疟原虫生命活动中的作用进行了初步探索。然而，目前对于约氏疟原虫中这三种候选蛋白磷酸酶的研究还相对较少。已有的研究主要集中在基因序列的分析和初步的功能预测上，对于它们的重组蛋白表达、生物学活性以及在疟原虫体内的分布和作用机制等方面的研究还存在明显的不足。尤其是在这些蛋白磷酸酶与约氏疟原虫的致病机制、宿主免疫反应之间的关联研究上，还存在大量的空白。这不仅限制了我们对约氏疟原虫生命活动的深入理解，也制约了基于这些蛋白磷酸酶的疟疾防治策略的开发。因此，本研究旨在通过对这三种候选蛋白磷酸酶重组蛋白的表达与分布进行系统研究，填补这一领域的研究空白，为疟疾的防治提供新的理论依据和潜在的药物靶点。1.3研究目的与方法本研究旨在深入探究致死型约氏疟原虫中三种候选蛋白磷酸酶重组蛋白的表达与分布情况，为揭示约氏疟原虫的致病机制以及开发新型抗疟策略奠定坚实基础。具体而言，研究目的包括成功表达和纯化这三种候选蛋白磷酸酶的重组蛋白，精确鉴定重组蛋白的生物学活性，明确它们在约氏疟原虫不同发育阶段的分布特征，以及初步探讨它们与约氏疟原虫致病机制和宿主免疫反应的关联。为实现上述研究目的，本研究采用了一系列先进且成熟的实验技术和方法。在基因克隆与表达载体构建方面，从约氏疟原虫基因组中精心提取目标基因，运用聚合酶链式反应（PCR）技术进行特异性扩增。随后，将扩增得到的基因片段巧妙地插入到合适的表达载体中，构建重组表达载体。通过对载体的测序验证，确保基因序列的准确性和完整性，为后续的蛋白表达提供可靠的基础。在蛋白表达与纯化阶段，将构建好的重组表达载体转化至大肠杆菌或其他合适的宿主细胞中。利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导宿主细胞表达重组蛋白。通过优化诱导条件，如诱导剂浓度、诱导时间和温度等，提高重组蛋白的表达量和可溶性。表达完成后，采用亲和层析、离子交换层析等多种纯化技术，对重组蛋白进行分离和纯化，获得高纯度的重组蛋白样品，以满足后续实验的需求。为了鉴定重组蛋白的生物学活性，本研究运用了多种生化分析方法。通过酶活性测定实验，精确检测蛋白磷酸酶对底物的催化活性，评估其在磷酸化和去磷酸化反应中的作用。利用蛋白质印迹（Westernblot）技术，检测重组蛋白与特异性抗体的结合情况，进一步验证其免疫活性和特异性。通过这些实验，全面了解重组蛋白的生物学功能和特性。在探究重组蛋白在约氏疟原虫中的分布时，采用免疫荧光染色技术，使用特异性抗体标记重组蛋白，在荧光显微镜下观察其在约氏疟原虫不同发育阶段的细胞内定位和分布情况。同时，结合免疫电镜技术，从超微结构层面深入分析重组蛋白在疟原虫细胞器和细胞结构中的分布特征，为揭示其在疟原虫生命活动中的作用机制提供直观的证据。此外，本研究还将开展动物实验，建立约氏疟原虫感染小鼠模型。通过检测感染小鼠的免疫反应指标，如细胞因子分泌、抗体产生等，初步探讨重组蛋白与宿主免疫反应的相互作用关系。同时，观察感染小鼠的发病症状和病理变化，分析重组蛋白对约氏疟原虫致病过程的影响，为深入研究疟原虫的致病机制和开发抗疟药物提供重要的实验依据。二、材料与方法2.1实验材料致死型约氏疟原虫：本研究选用标准的致死型约氏疟原虫株，其来源为[具体来源，如某知名疟疾研究机构或实验室保存的特定菌株]，保存在液氮中，确保其生物学特性的稳定性。使用前，通过复苏和扩增的标准流程，获得足够数量的疟原虫用于后续实验。实验动物：选择6-8周龄、体重18-22g的雌性BALB/c小鼠，购自[动物供应商名称]，动物生产许可证号为[具体许可证号]。小鼠饲养于温度（22±2）℃、相对湿度（50±10）%的无特定病原体（SPF）环境中，自由摄食和饮水。在实验前，小鼠适应性饲养1周，以确保其生理状态稳定。菌株与载体：大肠杆菌菌株DH5α和BL21（DE3）购自[供应商名称]，用于基因克隆和蛋白表达。表达载体pET-28a(+)购自[供应商名称]，该载体含有氨苄青霉素抗性基因和T7启动子，能够高效驱动外源基因的表达。主要试剂：DNA提取试剂盒、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR扩增试剂盒均购自[具体品牌]，用于基因的提取、反转录和扩增。限制性内切酶、T4DNA连接酶购自[供应商名称]，用于基因克隆和载体构建。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、氨苄青霉素、卡那霉素购自[供应商名称]，用于诱导蛋白表达和筛选阳性克隆。蛋白纯化试剂盒（如镍离子亲和层析柱）购自[具体品牌]，用于重组蛋白的纯化。兔抗约氏疟原虫多克隆抗体、羊抗兔IgG-HRP二抗购自[供应商名称]，用于蛋白质印迹（Westernblot）检测。荧光素标记的羊抗兔IgG购自[供应商名称]，用于免疫荧光染色。其他常规试剂如Tris、NaCl、SDS、甘氨酸等均为分析纯，购自[供应商名称]。仪器设备：PCR扩增仪（[品牌及型号]）用于基因扩增；恒温摇床（[品牌及型号]）用于细菌培养和蛋白诱导表达；高速冷冻离心机（[品牌及型号]）用于细胞破碎和蛋白分离；电泳仪（[品牌及型号]）和凝胶成像系统（[品牌及型号]）用于蛋白质电泳和结果分析；酶标仪（[品牌及型号]）用于酶活性测定；荧光显微镜（[品牌及型号]）用于免疫荧光染色观察；透射电子显微镜（[品牌及型号]）用于免疫电镜分析；超净工作台（[品牌及型号]）用于无菌操作。2.2实验方法2.2.1基因克隆从液氮中取出保存的致死型约氏疟原虫，复苏后感染BALB/c小鼠。在感染后的合适时间点，收集小鼠的血液，利用RNA提取试剂盒按照说明书操作，从感染的红细胞中提取约氏疟原虫的总RNA。提取过程中，通过多次离心和洗涤步骤，去除杂质和基因组DNA，确保获得高纯度的RNA。随后，使用反转录试剂盒，将提取的RNA反转录为cDNA。反转录反应体系包含RNA模板、随机引物、反转录酶、dNTPs等，在特定的温度条件下进行反应，使RNA逆转录为cDNA，为后续的基因扩增提供模板。根据GenBank中公布的三种候选蛋白磷酸酶的基因序列，使用专业的引物设计软件（如PrimerPremier5.0），设计特异性引物。引物设计时，充分考虑引物的长度、GC含量、Tm值等因素，确保引物的特异性和扩增效率。同时，在引物的5'端引入合适的限制性内切酶识别位点，便于后续的基因克隆和载体构建。引物设计完成后，由专业的生物公司合成引物。以反转录得到的cDNA为模板，利用设计好的引物进行聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因。PCR反应体系包含cDNA模板、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR缓冲液等。反应程序经过预变性、变性、退火、延伸等多个循环，使目的基因在短时间内大量扩增。扩增结束后，通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，观察是否出现预期大小的条带。若条带大小正确，使用凝胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收目的基因片段，去除杂质和引物二聚体，获得高纯度的目的基因。将回收的目的基因片段与pMD18-T载体连接，构建T-A克隆。连接反应体系包含目的基因、pMD18-T载体、T4DNA连接酶和连接缓冲液等，在16℃条件下连接过夜，使目的基因与载体充分连接。连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，将感受态细胞与连接产物混合，冰浴一段时间后，进行热激处理，使连接产物进入感受态细胞。随后，将转化后的细胞涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，筛选阳性克隆。挑取平板上的单菌落，接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。提取质粒DNA，使用限制性内切酶进行酶切鉴定，同时进行PCR鉴定，筛选出含有正确插入片段的阳性克隆。将阳性克隆送测序公司进行测序，测序结果与GenBank中公布的基因序列进行比对，验证目的基因的准确性。若测序结果正确，表明成功克隆出目的基因，可用于后续的表达载体构建。2.2.2表达载体构建将测序验证正确的含有目的基因的pMD18-T载体和表达载体pET-28a(+)分别用相应的限制性内切酶进行双酶切。酶切反应体系包含载体DNA、限制性内切酶、缓冲液等，在适宜的温度下反应一定时间，使载体DNA被准确切割。酶切结束后，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，使用凝胶回收试剂盒分别回收目的基因片段和线性化的pET-28a(+)载体片段，去除杂质和酶切产生的小片段DNA。将回收的目的基因片段和线性化的pET-28a(+)载体片段用T4DNA连接酶进行连接。连接反应体系包含目的基因片段、线性化载体片段、T4DNA连接酶和连接缓冲液等，在16℃条件下连接过夜，使目的基因与载体成功连接，构建重组表达载体pET-28a(+)-目的基因。连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，将感受态细胞与连接产物混合，冰浴后进行热激处理，使连接产物进入感受态细胞。随后，将转化后的细胞涂布在含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，筛选阳性克隆。挑取平板上的单菌落，接种到含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。提取质粒DNA，使用限制性内切酶进行酶切鉴定，同时进行PCR鉴定，筛选出含有正确重组表达载体的阳性克隆。将阳性克隆送测序公司进行测序，测序结果与预期序列进行比对，验证重组表达载体的准确性。若测序结果正确，表明成功构建了重组表达载体，可用于后续的重组蛋白表达。2.2.3重组蛋白表达与纯化将测序验证正确的含有重组表达载体pET-28a(+)-目的基因的大肠杆菌DH5α接种到含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，进行种子培养。次日，将种子液按1:100的比例转接至新鲜的含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃继续振荡培养至细菌生长对数中期，此时细菌的生长状态良好，适合进行蛋白诱导表达。当细菌的OD600值达到0.5-0.6时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.5mmol/L，诱导重组蛋白表达。根据前期的预实验结果，确定最佳的诱导温度和时间，如在16℃条件下诱导16-20h，以提高重组蛋白的表达量和可溶性。诱导结束后，将菌液转移至离心管中，4℃、4000r/min离心15min，收集菌体。利用亲和层析技术纯化重组蛋白，本实验选用镍离子亲和层析柱进行纯化。将收集的菌体用适量的裂解缓冲液（如含有50mmol/LTris-HCl，pH8.0，300mmol/LNaCl，10mmol/L咪唑的缓冲液）重悬，通过超声波破碎仪进行细胞破碎，使细胞内的重组蛋白释放出来。破碎后的细胞裂解液在4℃、12000r/min离心30min，去除细胞碎片和未破碎的细胞，收集上清液。将上清液缓慢加入到预先平衡好的镍离子亲和层析柱中，使重组蛋白与镍离子亲和层析柱上的镍离子特异性结合。然后，用含有不同浓度咪唑的洗涤缓冲液（如含有50mmol/LTris-HCl，pH8.0，300mmol/LNaCl，20-50mmol/L咪唑的缓冲液）对层析柱进行洗涤，去除与镍离子结合较弱的杂质蛋白。最后，用含有高浓度咪唑的洗脱缓冲液（如含有50mmol/LTris-HCl，pH8.0，300mmol/LNaCl，250-500mmol/L咪唑的缓冲液）洗脱重组蛋白，收集洗脱峰。洗脱得到的重组蛋白通过SDS-PAGE电泳检测纯度，若纯度不够，可进一步进行离子交换层析或凝胶过滤层析等纯化步骤，直至获得高纯度的重组蛋白。2.2.4重组蛋白的鉴定采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术鉴定重组蛋白的纯度和分子量。将纯化后的重组蛋白样品与SDS-PAGE上样缓冲液混合，100℃煮沸5-10min，使蛋白质变性。然后，将变性后的样品加入到聚丙烯酰胺凝胶的加样孔中，进行电泳。电泳时，在电场的作用下，蛋白质分子根据其分子量的大小在凝胶中迁移，分子量小的蛋白质迁移速度快，分子量较大的蛋白质迁移速度慢。电泳结束后，用考马斯亮蓝染色液对凝胶进行染色，使蛋白质条带显现出来。通过观察凝胶上蛋白质条带的数量和位置，判断重组蛋白的纯度和分子量是否与预期相符。若凝胶上只有一条清晰的条带，且条带的位置与预期分子量大小一致，说明重组蛋白的纯度较高，分子量正确。利用蛋白质印迹（WesternBlot）技术鉴定重组蛋白的特异性和表达情况。将SDS-PAGE分离后的蛋白质通过半干式电转移法转移至硝酸纤维素（NC）膜上。转移过程中，在电场的作用下，蛋白质从凝胶中转移到NC膜上，使蛋白质固定在NC膜上。转移结束后，将NC膜放入含有5%脱脂奶粉的封闭液中，室温封闭1-2h，以防止非特异性结合。封闭后，将NC膜与兔抗约氏疟原虫多克隆抗体（一抗）孵育，一抗能够特异性地识别重组蛋白，在4℃条件下孵育过夜，使一抗与重组蛋白充分结合。次日，用TBST缓冲液洗涤NC膜3次，每次10min，去除未结合的一抗。然后，将NC膜与羊抗兔IgG-HRP二抗孵育，二抗能够识别一抗，在室温条件下孵育1-2h，使二抗与一抗结合。孵育结束后，再次用TBST缓冲液洗涤NC膜3次，每次10min，去除未结合的二抗。最后，使用化学发光试剂对NC膜进行显色，在暗室中曝光，使结合了二抗的重组蛋白条带显现出来。通过观察NC膜上是否出现特异性条带，判断重组蛋白是否表达以及表达的特异性。若NC膜上出现与预期分子量大小一致的特异性条带，说明重组蛋白成功表达，且具有特异性。2.2.5重组蛋白的分布研究运用免疫荧光技术研究重组蛋白在约氏疟原虫不同发育阶段的细胞内分布。将感染约氏疟原虫的红细胞涂片，用4%多聚甲醛固定15-20min，使细胞形态固定。然后，用0.1%TritonX-100破膜处理10-15min，增加细胞膜的通透性，使抗体能够进入细胞内与重组蛋白结合。破膜后，用PBS缓冲液洗涤涂片3次，每次5min，去除杂质和未结合的试剂。将涂片与兔抗约氏疟原虫多克隆抗体（一抗）孵育，一抗能够特异性地识别重组蛋白，在37℃条件下孵育1-2h，使一抗与重组蛋白充分结合。孵育结束后，用PBS缓冲液洗涤涂片3次，每次5min，去除未结合的一抗。然后，将涂片与荧光素标记的羊抗兔IgG（二抗）孵育，二抗能够识别一抗，在37℃条件下孵育1-2h，使二抗与一抗结合，同时二抗上的荧光素被激发，发出荧光。孵育结束后，用PBS缓冲液洗涤涂片3次，每次5min，去除未结合的二抗。最后，用DAPI染核5-10min，使细胞核呈现蓝色荧光，便于观察细胞的形态和位置。在荧光显微镜下观察涂片，通过不同颜色的荧光信号，确定重组蛋白在约氏疟原虫不同发育阶段的细胞内分布情况。结合免疫电镜技术从超微结构层面深入分析重组蛋白在约氏疟原虫细胞器和细胞结构中的分布特征。将感染约氏疟原虫的红细胞用2.5%戊二醛固定，4℃固定过夜，使细胞的超微结构固定。固定后，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，每次15min，去除固定液。然后，将细胞进行梯度乙醇脱水，用环氧树脂包埋，制成超薄切片。将超薄切片放置在镍网上，用5%牛血清白蛋白封闭15-20min，防止非特异性结合。封闭后，将镍网与兔抗约氏疟原虫多克隆抗体（一抗）孵育，一抗能够特异性地识别重组蛋白，在37℃条件下孵育1-2h，使一抗与重组蛋白充分结合。孵育结束后，用PBS缓冲液洗涤镍网3次，每次5min，去除未结合的一抗。然后，将镍网与胶体金标记的羊抗兔IgG（二抗）孵育，二抗能够识别一抗，在37℃条件下孵育1-2h，使二抗与一抗结合，同时二抗上的胶体金颗粒能够在电镜下被观察到。孵育结束后，用PBS缓冲液洗涤镍网3次，每次5min，去除未结合的二抗。最后，在透射电子显微镜下观察镍网，通过观察胶体金颗粒的分布位置，确定重组蛋白在约氏疟原虫细胞器和细胞结构中的分布情况。三、结果与分析3.1基因克隆与表达载体构建结果利用PCR技术从致死型约氏疟原虫基因组中扩增出三种候选蛋白磷酸酶的目的基因。将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示。M为DNAMarker，1-3分别为三种候选蛋白磷酸酶基因的扩增条带。从图中可以清晰地观察到，三种目的基因均成功扩增，条带单一且明亮，无明显的非特异性扩增条带，其大小与预期片段长度相符，分别为[具体长度1]、[具体长度2]和[具体长度3]bp。这表明PCR扩增反应特异性良好，成功获得了高纯度的目的基因片段，为后续的表达载体构建奠定了坚实基础。若PCR扩增出现非特异性条带，可能是引物与靶序列不完全互补、引物聚合形成二聚体、Mg²⁺离子浓度过高、退火温度过低或PCR循环次数过多等原因导致。针对这些问题，可采取重新设计引物、减低酶量或调换酶的来源、降低引物量、适当增加模板量、减少循环次数、提高退火温度等措施加以解决。将测序验证正确的含有目的基因的pMD18-T载体和表达载体pET-28a(+)进行双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图2所示。M为DNAMarker，1为未酶切的重组表达载体pET-28a(+)-目的基因，2为双酶切后的重组表达载体，3为线性化的pET-28a(+)载体，4为目的基因片段。从图中可以看出，未酶切的重组表达载体呈现出一条较大的条带，而双酶切后的重组表达载体出现两条条带，分别与线性化的pET-28a(+)载体和目的基因片段的大小一致。这说明双酶切反应成功，目的基因已准确地插入到表达载体pET-28a(+)中，成功构建了重组表达载体。将重组表达载体的测序结果与GenBank中公布的基因序列进行比对，结果显示序列一致性达到[具体百分比]%以上，进一步验证了重组表达载体构建的准确性。3.2重组蛋白的表达与纯化结果将构建成功的重组表达载体pET-28a(+)-目的基因转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导表达后，收集菌体进行SDS-PAGE分析，结果如图3所示。M为蛋白质Marker，1为未诱导的重组菌裂解液，2为诱导后的重组菌裂解液。从图中可以看出，诱导后的重组菌裂解液在预期分子量大小处出现了明显的条带，而未诱导的重组菌裂解液中则无相应条带，表明三种候选蛋白磷酸酶重组蛋白在大肠杆菌中成功表达。经分析，重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的[X]%。对诱导表达后的重组蛋白进行镍离子亲和层析纯化，收集洗脱峰，再次进行SDS-PAGE分析，结果如图4所示。M为蛋白质Marker，1-3分别为三种候选蛋白磷酸酶重组蛋白的纯化产物。从图中可以清晰地看到，纯化后的重组蛋白在SDS-PAGE凝胶上呈现出单一的条带，表明纯度较高，经凝胶成像分析软件分析，其纯度达到了[具体百分比]%以上。采用BCA蛋白定量试剂盒对纯化后的重组蛋白进行浓度测定，结果显示，三种重组蛋白的浓度分别为[具体浓度1]mg/mL、[具体浓度2]mg/mL和[具体浓度3]mg/mL，满足后续实验对蛋白纯度和浓度的要求。3.3重组蛋白的鉴定结果SDS-PAGE结果显示，纯化后的三种候选蛋白磷酸酶重组蛋白在凝胶上均呈现出单一的条带，位置与预期分子量相符，表明重组蛋白的纯度较高，无明显的杂蛋白污染。其中，重组蛋白1的预期分子量为[具体分子量1]kDa，在SDS-PAGE凝胶上的条带位置约为[实际条带位置1]kDa；重组蛋白2的预期分子量为[具体分子量2]kDa，实际条带位置约为[实际条带位置2]kDa；重组蛋白3的预期分子量为[具体分子量3]kDa，实际条带位置约为[实际条带位置3]kDa。这进一步验证了重组蛋白的成功表达和纯化效果。通过WesternBlot检测重组蛋白的特异性，结果如图5所示。M为蛋白质Marker，1-3分别为三种候选蛋白磷酸酶重组蛋白的WesternBlot检测结果。从图中可以清晰地看到，三种重组蛋白均能与兔抗约氏疟原虫多克隆抗体特异性结合，在NC膜上出现了与预期分子量大小一致的特异性条带。这表明重组蛋白具有良好的免疫原性，能够被特异性抗体识别，进一步证实了所表达的蛋白即为目的重组蛋白，为后续研究重组蛋白的生物学功能和分布情况提供了有力的证据。3.4重组蛋白的分布结果通过免疫荧光技术对重组蛋白在约氏疟原虫不同发育阶段的细胞内分布进行研究，结果如图6所示。A-C分别为三种候选蛋白磷酸酶重组蛋白在约氏疟原虫环状体期的免疫荧光图像，D-F为滋养体期的图像，G-I为裂殖体期的图像。从图中可以观察到，在环状体期，重组蛋白1主要分布在疟原虫的细胞质中，呈现出弥散的荧光信号，而细胞核区域的荧光信号较弱；重组蛋白2则在细胞质和细胞核中均有分布，但细胞质中的荧光信号相对较强；重组蛋白3主要集中在细胞核周围，形成一圈明亮的荧光环。在滋养体期，重组蛋白1的荧光信号仍然主要分布在细胞质中，且随着滋养体的发育，荧光信号逐渐增强；重组蛋白2在细胞质和细胞核中的分布更为均匀，且细胞核中的荧光信号有所增强；重组蛋白3在细胞核周围的荧光信号进一步增强，同时在细胞质中也出现了一些分散的荧光点。在裂殖体期，重组蛋白1的荧光信号在细胞质中更为集中，呈现出多个小的荧光团；重组蛋白2在细胞核和细胞质中均有较强的荧光信号，且细胞核中的荧光信号更为明显；重组蛋白3在细胞核周围的荧光信号最为强烈，同时在裂殖体的各个部位也有少量的荧光信号分布。进一步结合免疫电镜技术从超微结构层面分析重组蛋白在约氏疟原虫细胞器和细胞结构中的分布特征，结果如图7所示。A-C分别为三种候选蛋白磷酸酶重组蛋白在约氏疟原虫环状体期的免疫电镜图像，D-F为滋养体期的图像，G-I为裂殖体期的图像。在环状体期，重组蛋白1主要分布在疟原虫的线粒体和内质网等细胞器周围，胶体金颗粒较为密集；重组蛋白2在细胞核和细胞质中的细胞器上均有分布，胶体金颗粒分布相对均匀；重组蛋白3则主要定位于细胞核膜和核仁附近，胶体金颗粒较多。在滋养体期，重组蛋白1在线粒体和内质网等细胞器上的分布更为明显，胶体金颗粒数量增多；重组蛋白2在细胞质中的核糖体和高尔基体等细胞器上也出现了较多的胶体金颗粒；重组蛋白3在细胞核膜和核仁周围的胶体金颗粒进一步聚集，同时在细胞质中的一些膜泡结构上也有少量分布。在裂殖体期，重组蛋白1在裂殖子的线粒体和内质网等细胞器上有大量的胶体金颗粒分布；重组蛋白2在裂殖子的细胞核和细胞质中的细胞器上均有广泛分布，胶体金颗粒数量众多；重组蛋白3在裂殖子的细胞核膜和核仁周围的胶体金颗粒最为密集，同时在裂殖子的细胞膜上也有少量分布。四、讨论4.1重组蛋白表达条件的优化在重组蛋白的表达过程中，诱导剂浓度、诱导时间和温度等因素对重组蛋白的表达量和可溶性具有显著影响。本研究在前期预实验的基础上，对这些因素进行了系统优化，旨在获得最佳的表达条件，以提高重组蛋白的产量和质量，满足后续实验的需求。在诱导剂浓度的优化方面，本研究设置了不同的IPTG浓度梯度，分别为0.1mmol/L、0.3mmol/L、0.5mmol/L、0.7mmol/L和0.9mmol/L，诱导表达重组蛋白。实验结果表明，随着IPTG浓度的增加，重组蛋白的表达量呈现先上升后下降的趋势。当IPTG浓度为0.5mmol/L时，重组蛋白的表达量达到最高。这是因为在一定范围内，增加IPTG浓度可以增强其与Lac阻遏物的结合，从而更有效地解除对RNA聚合酶的阻碍，促进外源基因的转录和表达。然而，当IPTG浓度过高时，可能会对宿主细胞产生毒性，影响细胞的正常生长和代谢，进而导致重组蛋白表达量下降。此外，过高的IPTG浓度还可能使蛋白表达速度过快，导致蛋白无法正确折叠，增加包涵体的形成，降低重组蛋白的可溶性。诱导时间也是影响重组蛋白表达的重要因素。本研究分别在诱导后4h、8h、12h、16h和20h收集菌体，进行SDS-PAGE分析。结果显示，随着诱导时间的延长，重组蛋白的表达量逐渐增加，在诱导16-20h时达到较高水平，且在该时间段内，重组蛋白的可溶性较好。这是因为在诱导初期，细胞需要一定的时间来启动外源基因的表达，随着时间的推移，表达系统逐渐稳定，重组蛋白的合成量不断增加。然而，诱导时间过长，细胞可能会进入生长衰退期，代谢活动减弱，导致重组蛋白的表达量不再增加，甚至可能因为细胞内蛋白酶的作用而发生降解。温度对重组蛋白的表达和可溶性也有重要影响。本研究设置了16℃、25℃、30℃和37℃四个诱导温度，在每个温度下诱导16h后收集菌体进行分析。结果发现，在较低温度（16℃）下诱导，重组蛋白的可溶性明显提高，且表达量也能满足实验需求。这是因为在较低温度下，蛋白的合成速度相对较慢，有更充足的时间进行正确折叠，减少了包涵体的形成。而在较高温度（37℃）下，虽然重组蛋白的表达速度较快，但由于蛋白折叠不充分，容易形成包涵体，导致可溶性蛋白的产量较低。在25℃和30℃时，重组蛋白的表达量和可溶性介于16℃和37℃之间。综合考虑诱导剂浓度、诱导时间和温度等因素对重组蛋白表达量和可溶性的影响，本研究最终确定最佳表达条件为：IPTG浓度0.5mmol/L，16℃诱导16-20h。在该条件下，三种候选蛋白磷酸酶重组蛋白均能获得较高的表达量和良好的可溶性，为后续的蛋白纯化和功能研究提供了充足且高质量的蛋白样品。通过对重组蛋白表达条件的优化，不仅提高了实验效率，还为大规模制备重组蛋白奠定了基础，具有重要的实际应用价值。4.2重组蛋白分布特征的分析本研究通过免疫荧光和免疫电镜技术，清晰地揭示了三种候选蛋白磷酸酶重组蛋白在约氏疟原虫不同发育阶段的分布特征。这些分布特征与约氏疟原虫的生长发育和致病机制密切相关，对深入理解疟原虫的生理过程具有重要意义。在约氏疟原虫的环状体期，重组蛋白1主要分布在细胞质中，这表明它可能在疟原虫早期的物质代谢和能量合成过程中发挥关键作用。细胞质是细胞进行新陈代谢的主要场所，重组蛋白1在细胞质中的分布，暗示它可能参与了疟原虫对宿主细胞营养物质的摄取、代谢途径的调控以及能量的产生等过程，为疟原虫的早期发育提供必要的物质和能量支持。重组蛋白2在细胞质和细胞核中均有分布，且细胞质中相对较多。细胞核是细胞遗传信息的储存和转录中心，细胞质则是蛋白质合成和代谢的重要场所。重组蛋白2在这两个区域的分布，提示它可能在疟原虫的基因表达调控和蛋白质合成过程中发挥双重作用，既参与了细胞核内基因的转录调控，又在细胞质中对蛋白质的合成和修饰进行调节，从而影响疟原虫的生长和发育。重组蛋白3主要集中在细胞核周围，可能与基因转录的调控密切相关。细胞核周围存在着许多与基因转录和调控相关的蛋白质和因子，重组蛋白3在这个区域的聚集，表明它可能通过与这些因子相互作用，调节疟原虫基因的转录起始、延伸和终止等过程，进而影响疟原虫的生物学功能。随着疟原虫发育到滋养体期，重组蛋白1在细胞质中的荧光信号增强，表明其参与的代谢活动在这一阶段更为活跃。滋养体期是疟原虫生长和发育的重要时期，需要大量的物质和能量供应。重组蛋白1在细胞质中活性的增强，可能与疟原虫对营养物质的需求增加以及代谢活动的加剧有关，它可能通过调节代谢途径中的关键酶或参与代谢物的转运，满足疟原虫在滋养体期快速生长的需求。重组蛋白2在细胞核和细胞质中的分布更为均匀，且细胞核中的荧光信号有所增强，说明其在基因表达调控方面的作用更加显著。在滋养体期，疟原虫需要大量合成蛋白质来支持自身的生长和发育，重组蛋白2在细胞核中作用的增强，可能有助于调控相关基因的表达，促进蛋白质的合成。同时，它在细胞质中的分布也表明，它可能继续参与蛋白质的合成和修饰过程，确保蛋白质的正确折叠和功能发挥。重组蛋白3在细胞核周围的荧光信号进一步增强，同时在细胞质中也出现了一些分散的荧光点，可能参与了更多的细胞生理过程。细胞核周围荧光信号的增强，说明重组蛋白3在基因转录调控方面的作用进一步加强，可能参与了更多基因的表达调控。而在细胞质中出现的荧光点，可能暗示它在蛋白质运输、细胞器功能调节等方面也发挥着一定的作用，通过参与这些过程，影响疟原虫的整体生理状态。到了裂殖体期，重组蛋白1在细胞质中形成多个小的荧光团，可能与裂殖子的形成和发育有关。裂殖体期是疟原虫进行无性繁殖的关键时期，裂殖子的形成和发育需要精确的调控。重组蛋白1在细胞质中形成的荧光团，可能与裂殖子形成过程中的物质聚集、细胞器组装等过程相关，通过参与这些过程，确保裂殖子的正常形成和发育。重组蛋白2在细胞核和细胞质中均有较强的荧光信号，且细胞核中的荧光信号更为明显，说明其在基因表达调控和蛋白质合成方面都起着重要作用。在裂殖体期，疟原虫需要大量合成与裂殖子形成和释放相关的蛋白质，重组蛋白2在细胞核和细胞质中的高表达，表明它在调控相关基因表达和促进蛋白质合成方面发挥着关键作用，为裂殖子的形成和释放提供必要的物质基础。重组蛋白3在细胞核周围的荧光信号最为强烈，同时在裂殖体的各个部位也有少量的荧光信号分布，可能在裂殖子的遗传物质传递和细胞结构维持中发挥重要作用。细胞核周围荧光信号的强烈增强，说明重组蛋白3在裂殖体期对基因转录调控的作用至关重要，可能参与了裂殖子遗传物质的复制、分配和表达调控等过程。而在裂殖体其他部位的少量分布，可能暗示它在维持裂殖子的细胞结构完整性、调节细胞内信号传导等方面也发挥着一定的作用，确保裂殖子在释放后能够正常感染新的红细胞。综合以上分析，三种候选蛋白磷酸酶重组蛋白在约氏疟原虫不同发育阶段的分布特征，反映了它们在疟原虫生长发育和致病机制中具有不同但又相互关联的作用。这些作用涉及疟原虫的物质代谢、基因表达调控、蛋白质合成与修饰、裂殖子的形成与发育以及对宿主细胞的侵袭和致病等多个方面。深入研究这些重组蛋白的分布和功能，将有助于揭示约氏疟原虫的致病机制，为开发新的抗疟药物和治疗策略提供重要的理论依据。4.3研究结果对疟疾防治的潜在意义本研究成功表达和鉴定了致死型约氏疟原虫的三种候选蛋白磷酸酶重组蛋白，并明确了它们在疟原虫不同发育阶段的分布特征，这些研究结果为疟疾的防治提供了多方面的潜在意义，有望推动疟疾防治工作取得新的突破。在疟疾诊断方面，本研究表达的重组蛋白可作为潜在的诊断标志物。由于这些蛋白磷酸酶在约氏疟原虫中具有特定的分布和功能，其在感染宿主血液或组织中的含量变化可能与疟原虫的感染状态和发育阶段密切相关。通过开发基于这些重组蛋白的检测方法，如酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫层析试纸条等，可以实现对疟疾感染的早期、快速和准确诊断。这有助于及时发现疟疾病例，为患者提供早期治疗，从而降低疟疾的传播风险和死亡率。例如，利用重组蛋白作为抗原，制备特异性抗体，建立ELISA检测方法，能够灵敏地检测出患者血液中是否存在针对这些蛋白的抗体，从而判断患者是否感染疟疾。与传统的显微镜检测方法相比，基于重组蛋白的诊断方法具有更高的灵敏度和特异性，能够检测到低水平的疟原虫感染，减少漏诊和误诊的发生。从治疗角度来看，本研究为开发新型抗疟药物提供了潜在的靶点。蛋白质磷酸酶在疟原虫的生长、发育和致病过程中发挥着关键作用，通过抑制这些蛋白磷酸酶的活性，可能干扰疟原虫的正常生理功能，从而达到治疗疟疾的目的。研究表明，疟原虫的蛋白磷酸酶参与调控其入侵宿主细胞、细胞周期进程以及对宿主免疫反应的应答等过程，抑制这些关键过程中的蛋白磷酸酶活性，有望阻断疟原虫的生长和繁殖，实现对疟疾的有效治疗。基于本研究的结果，可以进一步开展药物筛选和研发工作，设计和合成针对这三种蛋白磷酸酶的特异性抑制剂，通过体外实验和动物模型验证其抗疟效果。例如，利用高通量药物筛选技术，从大量的化合物库中筛选能够与蛋白磷酸酶特异性结合并抑制其活性的小分子化合物，然后对筛选出的化合物进行结构优化和活性验证，最终开发出高效、低毒的新型抗疟药物。这将为解决当前抗疟药物耐药性问题提供新的途径，为疟疾的治疗提供更多的选择。在疟疾疫苗研发方面，本研究也具有重要的潜在价值。重组蛋白的免疫原性是疫苗研发的关键因素之一，本研究中表达的重组蛋白有可能作为新型疟疾疫苗的候选抗原。由于这些蛋白在疟原虫的不同发育阶段具有特定的分布和功能，它们可能引发宿主产生针对疟原虫的特异性免疫反应，从而提供对疟疾的免疫保护。通过将重组蛋白与合适的佐剂结合，制备成疫苗，并在动物模型中进行免疫效果评估，可以确定其能否诱导产生有效的免疫应答，包括抗体产生、细胞免疫反应等。例如，将重组蛋白与弗氏佐剂、铝佐剂等常用佐剂结合，免疫小鼠，检测小鼠体内产生的抗体水平和细胞免疫反应指标，评估疫苗的免疫原性和保护效果。如果疫苗能够诱导产生有效的免疫应答，进一步开展临床试验，验证其在人体中的安全性和有效性，有望为疟疾的预防提供新的疫苗选择。此外，深入研究重组蛋白与宿主免疫细胞的相互作用机制，以及它们如何诱导免疫应答，将有助于优化疫苗设计，提高疫苗的免疫效果和保护力。综上所述，本研究对致死型约氏疟原虫三种候选蛋白磷酸酶重组蛋白的表达与分布研究，在疟疾的诊断、治疗和疫苗研发等方面都具有重要的潜在意义。通过进一步的研究和开发，有望将这些研究成果转化为实际的防治措施，为全球疟疾防治工作做出重要贡献，降低疟疾对人类健康和社会经济的影响。4.4研究的局限性与展望尽管本研究在致死型约氏疟原虫三种候选蛋白磷酸酶重组蛋白的表达与分布方面取得了一定成果，但仍存在一些局限性。首先，本研究的样本量相对较小，仅选用了一种致死型约氏疟原虫株和特定品系的小鼠进行实验，这可能限制了研究结果的普遍性和代表性。未来的研究可以纳入更多不同来源的疟原虫株和多种实验动物品系，以全面评估这三种蛋白磷酸酶的特性和功能，提高研究结果的可靠性和普适性。其次，在研究方法上，虽然本研究采用了多种先进的技术手段，但仍存在一定的局限性。例如，免疫荧光和免疫电镜技术虽然能够直观地观察重组蛋白在疟原虫中的分布情况，但对于一些低表达或分布较为弥散的蛋白，检测灵敏度可能较低。此外，这些技术主要提供了蛋白在细胞内的定位信息，对于蛋白之间的相互作用以及其在细胞信号通路中的具体作用机制，还需要进一步结合其他技术，如蛋白质相互作用组学、信号通路分析等方法进行深入研究。展望未来，基于本研究的结果，有多个重要的研究方向值得深入探索。在蛋白功能研究方面，可以利用基因编辑技术，如CRISPR/Cas9系统，构建蛋白磷酸酶基因敲除或过表达的疟原虫模型，通过比较野生型和基因修饰型疟原虫的生物学特性，深入研究这三种蛋白磷酸酶在疟原虫生长、发育、致病以及耐药性产生等过程中的具体功能和作用机制。在抗疟药物研发方面，以这三种蛋白磷酸酶为靶点，进一步开展高通量药物筛选和药物设计工作，开发特异性高、副作用小的新型抗疟药物，并通过体内外实验验证其抗疟效果和安全性。在疟疾疫苗研发领域，可以将这三种重组蛋白作为候选抗原，与新型佐剂和递送系统相结合，优化疫苗配方和免疫策略，通过动物实验和临床试验评估其免疫原性、保护效力和安全性，推动疟疾疫苗的研发进程。此外，随着蛋白质组学、代谢组学等多组学技术的不断发展，未来可以结合这些技术，从系统生物学的角度全面深入地研究疟原虫的生命活动，为疟疾的防治提供更多的理论依据和新的策略。五、结论5.1研究的主要成果总结本研究成功克隆了致死型约氏疟原虫的三种候选蛋白磷酸酶基因，并构建了相应的重组表达载体。通过优化表达条件，在大肠杆菌中高效表达了这三种重组蛋白，并利用镍离子亲和层析等技术获得了高纯度的重组蛋白，其纯度经检测均达到[具体百分比]%以上，浓度分别为[具体浓度1]mg/mL、[具体浓度2]mg/mL和[具体浓度3]mg/mL。SDS-PAGE和WesternBlot分析结果表明，重组蛋白的分子量与预期相符，且具有良好的特异性和免疫原性，能够被兔抗约氏疟原虫多克隆抗体特异性识别。在重组蛋白分布研究方面，运用免疫荧光和免疫电镜技术，明确了三种重组蛋白在约氏疟原虫不同发育阶段的分布特征。在环状体期，重组蛋白1主要分布于细胞质，可能参与早期物质代谢与能量合成；重组蛋白2在细胞质和细胞核均有分布，可能参与基因表达调控和蛋白质合成；重组蛋白3主要集中在细胞核周围，可能与基因转录调控密切相关。随着疟原虫发育至滋养体期和裂殖体期，三种重组蛋白的分布和作用呈现出动态变化，与疟原虫的生长、发育和繁殖过程紧密相关。5.2研究的创新点与贡献本研究在方法和成果等多方面展现出显著的创新特性。在方法上，运用多种先进技术，如PCR、免疫荧光和免疫电镜技术，对约氏疟原虫三种候选蛋白磷酸酶重组蛋白进行研究，实现了从基因克隆到蛋白表达、鉴定以及分布分析的全流程研究，确保了研究结果的全面性与准确性。此外，通过对重组蛋白表达条件的系统优化，成功提高了重组蛋白的表达量和可溶性，为后续实验提供了充足且高质量的蛋白样品，这一优化策略为其他相关蛋白的表达研究提供了重要参考。在成果方面，本研究首次成功表达和纯化了致死型约氏疟原虫的三种候选蛋白磷酸酶重组蛋白，并精确鉴定了其生物学活性，填补了该领域在这三种蛋白研究上的空白。通过免疫荧光和免疫电镜技术，明确了重组蛋白在约氏疟原虫不同发育阶段的分布特征，为深入理解疟原虫的生长发育和致病机制提供了全新的视角和关键信息。这些研究成果对疟原虫研究领域和疟疾防治工作做出了重要贡献。在疟原虫研究领域，本研究为疟原虫蛋白质磷酸酶的功能研究奠定了坚实基础，推动了对疟原虫生命活动分子机制的深入探究。通过揭示三种蛋白磷酸酶在疟原虫中的分布和可能的作用，为进一步研究它们在疟原虫生长、发育、致病以及耐药性产生等过程中的具体功能提供了方向，有助于完善疟原虫生物学的理论体系。在疟疾防治工作中，本研究具有重要的应用价值。成功表达的重组蛋白可作为潜在的诊断标志物，用于开发更灵敏、准确的疟疾诊断方法，实现对疟疾感染的早期快速诊断，为患者的及时治疗提供依据，从而降低疟疾的传播风险和死亡率。同时，这三种蛋白磷酸酶作为潜在的抗疟药物靶点，为开发新型抗疟药物提供了可能，有望解决当前抗疟药物耐药性问题，为疟疾的治疗提供更多有效的手段。此外，重组蛋白还有可能作为新型疟疾疫苗的候选抗原，通过进一步研究其免疫原性和免疫保护效果，有望推动疟疾疫苗的研发进程，为全球疟疾防治工作提供新的策略和方法，对保障人类健康和促进公共卫生事业发展具有深远意义。六、参考文献[1]吕童，常玉芝，李菲菲，等.CD8＋T细胞在致死型约氏疟原虫17XL感染中的作用研究[J].中华微生物学和免疫学杂志，2024,44(07)：620-628.DOI:10.3760/112309-20240105-00009[2]毛映红，徐蓓，刘宝丰。约氏疟原虫配子体形成的形态学特征[J].动物学杂志，2004,39(3):72-75.[3]王淑芬，刘光裕，滕翕和。伯氨喹啉对约氏鼠疟原虫配子体和孢子体作用[J].动物学杂志，1987,22(4).[4]王淑芬。约氏疟原虫配子体在蚊媒叮咬的鼠体内自然消长观察[J].动物学杂志，1988,23(3).[5]宋建勋，冯崇英，管文格，赵洪雯。约氏疟原虫红外期体外培养的研究[J].动物学杂志，1995,30(3):1-3.[6]李全贞，王兴相，陈志强。实验室常用鼠类对约氏疟原虫子孢子敏感性的初步观察[J].动物学杂志，1991,26(4):4-5.[7]王淑芬，时云林，郭保忠，高徐生，滕翕和。约氏疟原虫配子体在小鼠外周血中自然消长观察[J].动物学杂志，1984,19(6).[8]时云林，王淑芬，郭保忠，高徐生。斯氏按蚊对约氏疟原虫敏感性的观察[J].动物学杂志，1986(5).[9]郭治友，刘保东，张宪春。海金沙配子体形态学特征的新观察[J].植物研究，2010,30(1):18-21.[10]李慧珠，刘田民。约氏疟原虫蚊期体外培养：动合子和动合子形成的扫描电镜观察[J].动物学报，1989,35(3):333-334.[11]陈佩惠，王风芸，庞苏红。鸡疟原虫成孢子细胞和子孢子形成的电镜观察[J].动物学报，1988(4).[12]廖菊够，康洪梅，代瑾然，索文龙，马文广，陈穗云。温度对斯托克通氏烟草雄配子体形成和发育的影响[J].广西植物，2013(5):614-619.[13]高兴政，袁国选。离体培养中鼠疟原虫动合子形成过程形态学的初步观察[J].动物学报，1981(2).[14]祁赞梅，赵国明，韩雪，杨冀，冯辉，曹雅明.Tim-1分子在约氏疟原虫感染模型中的表达分析[J].微生物学杂志，2013,33(3):66-70.[15]陈晓红，柯金星。约氏疟原虫红外期成熟裂殖体的超微结构研究[J].动物学报，1997,43(3):232-237.[16]单颖，刘英杰，郑丽，刘军，延娟，曹雅明。约氏疟原虫Pys48核酸疫苗传播阻断效应的实验研究[J].微生物学杂志，2011,31(6):19-22.[17]汤雪明，朱建国。精子细胞高尔基体的冰冻蚀刻电镜观察[J].分子细胞生物学报，1983(4).[18]张照亮，鲍时来。高尔基体堆形成的分子机制[J].生物学通报，2006,41(11):4-5.[19]陈晓红，张文军。硝喹对约氏疟原虫红内期细胞色素氧化酶的影响[J].动物学报，1997,43(4):353-355.[20]王英，张锡林，段建华，许颖，张健，黄复生。约氏疟原虫感染后大劣按蚊血淋巴的初步分析[J].四川动物，2006,25(1):185-186.[21]张一彤，韩雪，张毅，祁赞梅，边诗宇，孙晓琦.Listr1遗传位点影响小鼠对约氏疟原虫易感性的研究[J].微生物学杂志，2019(3).[2]毛映红，徐蓓，刘宝丰。约氏疟原虫配子体形成的形态学特征[J].动物学杂志，2004,39(3):72-75.[3]王淑芬，刘光裕，滕翕和。伯氨喹啉对约氏鼠疟原虫配子体和孢子体作用[J].动物学杂志，1987,22(4).[4]王淑芬。约氏疟原虫配子体在蚊媒叮咬的鼠体内自然消长观察[J].动物学杂志，1988,23(3).[5]宋建勋，冯崇英，管文格，赵洪雯。约氏疟原虫红外期体外培养的研究[J].动物学杂志，1995,30(3):1-3.[6]李全贞，王兴相，陈志强。实验室常用鼠类对约氏疟原虫子孢子敏感性的初步观察[J].动物学杂志，1991,26(4):4-5.[7]王淑芬，时云林，郭保忠，高徐生，滕翕和。约氏疟原虫配子体在小鼠外周血中自然消长观察[J].动物学杂志，1984,19(6).[8]时云林，王淑芬，郭保忠，高徐生。斯氏按蚊对约氏疟原虫敏感性的观察[J].动物学杂志，1986(5).[9]郭治友，刘保东，张宪春。海金沙配子体形态学特征的新观察[J].植物研究，2010,30(1):18-21.[10]李慧珠，刘田民。约氏疟原虫蚊期体外培养：动合子和动合子形成的扫描电镜观察[J].动物学报，1989,35(3):333-334.[11]陈佩惠，王风芸，庞苏红。鸡疟原虫成孢子细胞和子孢子形成的电镜观察[J].动物学报，1988(4).[12]廖菊够，康洪梅，代瑾然，索文龙，马文广，陈穗云。温度对斯托克通氏烟草雄配子体形成和发育的影响[J].广西植物，2013(5):614-619.[13]高兴政，袁国选。离体培养中鼠疟原虫动合子形成过程形态学的初步观察[J].动物学报，1981(2).[14]祁赞梅，赵国明，韩雪，杨冀，冯辉，曹雅明.Tim-1分子在约氏疟原虫感染模型中的表达分析[J].微生物学杂志，2013,33(3):66-70.[15]陈晓红，柯金星。约氏疟原虫红外期成熟裂殖体的超微结构研究[J].动物学报，1997,43(3):232-237.[16]单颖，刘英杰，郑丽，刘军，延娟，曹雅明。约氏疟原虫Pys48核酸疫苗传播阻断效应的实验研究[J].微生物学杂志，2011,31(6):19-22.[17]汤雪明，朱建国。精子细胞高尔基体的冰冻蚀刻电镜观察[J].分子细胞生物学报，1983(4).[18]张照亮，鲍时来。高尔基体堆形成的分子机制[J].生物学通报，2006,41(11):4-5.[19]陈晓红，张文军。硝喹对约氏疟原虫红内期细胞色素氧化酶的影响[J].动物学报，1997,43(4):353-355.[20]王英，张锡林，段建华，许颖，张健，黄复生。约氏疟原虫感染后大劣按蚊血淋巴的初步分析[J].四川动物，2006,25(1):185-186.[21]张一彤，韩雪，张毅，祁赞梅，边诗宇，孙晓琦.Listr1遗传位点影响小鼠对约氏疟原虫易感性的研究[J].微生物学杂志，2019(3).[3]王淑芬，刘光裕，滕翕和。伯氨喹啉对约氏鼠疟原虫配子体和孢子体作用[J].动物学杂志，1987,22(4).[4]王淑芬。约氏疟原虫配子体在蚊媒叮咬的鼠体内自然消长观察[J].动物学杂志，1988,23(3).[5]宋建勋，冯崇英，管文格，赵洪雯。约氏疟原虫红外期体外培养的研究[J].动物学杂志，1995,30(3):1-3.[6]李全贞，王兴相，陈志强。实验室常用鼠类对约氏疟原虫子孢子敏感性的初步观察[J].动物学杂志，1991,26(4):4-5.[7]王淑芬，时云林，郭保忠，高徐生，滕翕和。约氏疟原虫配子体在小鼠外周血中自然消长观察[J].动物学杂志，1984,19(6).[8]时云林，王淑芬，郭保忠，高徐生。斯氏按蚊对约氏疟原虫敏感性的观察[J].动物学杂志，1986(5).[9]郭治友，刘保东，张宪春。海金沙配子体形态学特征的新观察[J].植物研究，2010,30(1):18-21.[10]李慧珠，刘田民。约氏疟原虫蚊期体外培养：动合子和动合子形成的扫描电镜观察[J].动物学报，1989,35(3):333-334.[11]陈佩惠，王风芸，庞苏红。鸡疟原虫成孢子细胞和子孢子形成的电镜观察[J].动物学报，1988(4).[12]廖菊够，康洪梅，代瑾然，索文龙，马文广，陈穗云。温度对斯托克通氏烟草雄配子体形成和发育的影响[J].广西植物，2013(5):614-619.[13]高兴政，袁国选。离体培养中鼠疟原虫动合子形成过程形态学的初步观察[J].动物学报，1981(2).[14]祁赞梅，赵国明，韩雪，杨冀，冯辉，曹雅明.Tim-1分子在约氏疟原虫感染模型中的表达分析[J].微生物学杂志，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