地瓜脱毒苗的生产流程

第一步：选种催芽，剪取壮苗。在决定进行某个或某几个甘薯品种的脱毒组培后，我们会提前一个半月左右，选取完全符合该品种特性的薯块，在光照培养箱里进行催芽。本步骤最重要的是选取品种特性优秀的薯块，甘薯脱毒组培属于人工干预下的无性繁殖，如果原始材料品种特性就不好的话，那“上梁不正下梁歪”的道理，大家都懂的.在种薯出芽后，我们就会选取其中粗壮的茎芽，进行后续作业！

第二步：剥取茎尖，培养成苗。我们把剪取下来的健壮茎芽，在超净台上使用显微镜，将只含1-2个叶原基的0.1-0.3mm大小的茎尖分生组织剥取出来，放到诱导培养基中进行成苗培养。

剥取茎尖分生组织的大小要“越小越好”。尺寸大小等同于包含叶原基数量的多少，虽然剥取的茎尖分生组织尺寸小了，包含的叶原基少了，后期成苗机率会大大降低。但是，因为我们剥尖的根本目的是要去除病毒，而病毒携带率和剥取的茎尖分生组织大小是呈正比关系，即茎尖分生组织越大，包含的叶原基越多，携带病毒几率越高；茎尖分生组织越小，包含的叶原基越少，携带病毒几率越低，加之后续工作要花费的人力和物力远远大于茎尖分生组织不成苗所带来的损失，所以我们宁愿一个品种剥取几十个“越小越好”的茎尖组织，成苗率只有百分之五十左右，也不愿尺寸“剥大了”，后期淘汰率居高不下。品系(株系)的数量要“越多越好”。剥取的茎尖分生组织诱导长成的组培苗，每株都称为一个独立株系。龙生九子各有不同，他们中间有原种性好的，也有变异较大的；有病毒携带者，也有无病毒、洁净的植株。而我们增加品系的数量，既是为了更好的确保种群遗传基因的完整性，也是为了降低病毒检测层层筛选后“全军覆没”的可能性。

第三步：切段繁育，扩增数量。在剥取的茎尖分生组织诱导成苗后，需要用一种快速的方法，成倍的扩增组培苗的数量，我们会将完整的组培苗植株，两至三个茎节分切为一段，栽种至快繁培养基中，进行培养，然后再将长成的新植株，两至三个茎节为一段……以此类推，一般在首次移栽之前，要进行三至四次切段扩繁。第四步：分子检测，初筛病毒。在切段扩繁的同时，我们会收集各个株系的植物组织样本进行分子检测，即提取样本里的DNA或RNA，采用PCR或RT-PCR的方式，将病毒DNA扩增几百万倍，并采用凝胶电泳成像方式，将扩增出的病毒基因片段展现在大家面前，这种方法，检测灵敏度好，精度高，病毒基本“无所遁形”。但由于步骤较多，成本较高，速度较慢，操作人员专业性要求强。所以，在最新的《脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测技术规程》中，甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)这个危害较为严重的病毒采用分子加血清方式检测，甘薯双生病毒(sweepoviruses)采用分子方式检测，其他四种病毒：甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)，甘薯褪绿斑病毒(SPCFV)，甘薯潜隐病毒(SPLV)，甘薯病毒G(SPVG)则选择用操作更加简便的酶联免疫吸附法(ELISA)来进行检测。在实际操作中，是选择使用分子检测来对甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)、甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)和甘薯双生病毒(sweepoviruses)进行检测。众所周知SPCSV和SPFMV这两个病毒的组合就是大家俗称的甘薯病毒病(SPVD)，我们在NY/T402-2016标准的基础上，增加了甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)的分子检测项目，力求做到更加严格的筛选！

第五步：血清检测，再筛病毒。经过分子检测后，检测结果合格的株系继续在切段扩繁的同时收集植物组织样本，进行酶联免疫吸附法病毒检测，即常说的血清(ELISA)检测，主流的血清检测方法有双抗体夹心法(DAS-ELISA)和硝化纤维素膜法(NCM-ELISA)，一般采用的是以硝化纤维素膜作为载体的NCM-ELISA检测方法。对NY/T402-2016标准里按规需要检测的五种病毒：即前文提到的SPCSV、SPFMV、SPCFV、SPLV、SPVG进行酶联免疫吸附法病毒检测。但因其结果读取环节中，不如分子检测那样，目的片段有条带没条带一目了然，酶联免疫吸附法对实验操作员和指导老师的经验性要求均较强，所以一般只采用血清检测法作为三次病毒检测的中间环节，要经过严格的分子检测后，才进入血清检测环节，后续还要进行嫁接检测作为最终结果的验证。

第六步：移栽出瓶，育成壮苗.将经过分子、血清病毒检测，结果均为合格的株系从瓶里移出到组培苗驯化室(步入式人工气候室)中去，经过一段时间的繁育，繁育成健壮的植株。第七步：嫁接检测，终筛病毒。将组培苗育成健壮的驯化苗后，采用指示植物嫁接法进行最后一次病毒检测。采用以防虫条件下盆栽的巴西牵牛为砧木，以待检测样品的茎蔓为接穗的方式，进行嫁接检测，根据巴西牵牛是否表现花叶、叶片扭曲、明脉、黄化以及植株矮化等症状，判断检测样品是否带毒。前述分子、血清检测均只能面对特定的病毒种类，乃至特定病毒种类中的某个或某几个病毒族群，但能够感染甘薯的病毒不仅仅只有前文中提到的那几种，这个方法的优点在于：几乎所有能够感染甘薯的病毒均能感染巴西牵牛并使其表现出病毒病症状。也就是说，采用指示植物嫁接法检测甘薯病毒病的种类更加全面，检测范围远远大于前述的分子、血清检测方法，但因其检测灵敏度不如分子、血清检测，且受环境影响因素较多，结果的读取工作对经验性要求很强，所以常选择该方法作为三次病毒检测中的最后一道关卡。通过最后这一关，检测结果合格的株系，才能把它标记为茎尖脱毒苗，到此为止，在实验室中进行的培育环节圆满结束，之后将把合格株系的驯化苗送入下一个环节，进行原种性测试。

第八步：小批栽种，测原种性。将这些“过三关斩N毒”的甘薯株系，每个株系取数十株驯化苗，同期栽入有隔离条件的设施中，进行原种性测试。

甘薯属无性繁殖作物，甘薯田间繁殖很易感染病毒，造成产量和品质大幅度下降。据报道脱毒三代与未脱毒的产量差异不显著。而且脱毒薯在田间应用年限越长，单株薯重越轻。通过组培快繁不但提高繁殖系数，而且避免了病毒的感染，保持品种种性。培养基(1)芽诱导培养基：MS+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖4%(2)继代增殖培养基：MS+BA4mg/L+NAA0.01mg/L+蔗糖4%(3)生根培养基：MS+蔗糖40%材料方法于4-6月份采集岳薯1号、梅营1号、紫薯80无毒甘薯苗茎尖，用自来水冲洗0.5-1.0h。置于超净工作台上用无菌滤纸吸干水分后，用75%酒精浸30s，再用0.1%升汞消毒4min，最后用无菌水冲洗4-5次。剥取0.5mm左右的茎尖生长点，接种于芽诱导培养基(1)上，芽萌发后剪下转接于继代增殖培养基(2)或(3)上继代扩繁。剪取0.5-1.0cm带一叶一节茎段接于培养基(3)中培养生根。培养基中均加琼脂0.65%，培养温度（25±1）℃，光照10-12h/d，强度2000-2500lx。试管苗生根培养21d后移栽于基质中。生长分化1、芽的诱导茎尖在芽诱导培养基上培养7d转绿，14d形成愈伤组织并产生芽。28-35d芽高度达1.0-1.5cm。2、增殖培养剪取诱导产生的芽接于培养基(2)上，接后10d茎基部即产生愈伤组织并开始萌发丛芽，35d产生丛芽3-5个，最大高度达5.4cm。在此培养基增殖培养35d可增殖5-6倍;茎段在培养基(3)上3d即生根，腋芽也开始生长。三周株高平均达5.8cm，具6-8片展开叶，21d继代一次。在此培养基上增殖培养21d繁殖系数可达3-4倍。3、生根培养剪取0.5-1.0cm带一叶一节茎段接于培养基(3)上，14d生根3-4条，根生长速度较快，根最长达3.6cm，梅营1号根系在前7d里生长稍慢，以后加快。4、移栽将培养21d的试管苗在自然光下闭瓶炼苗1d，再开瓶炼苗1-3d，然后洗去培养基，栽植于腐殖土与珍珠岩比例4：1的基质中。覆盖薄膜，5d后适当通风，保持土壤湿润，但膜内相对湿度不宜过大，一般控制在85%-90%，移栽苗茎干粗壮，成活率达100%。发展美国在20世纪中期应用组培技术而获得的芹菜苗已成功地取代了种子繁殖的传统方法。中国21世纪初在番茄、辣椒、马铃薯、生菜、人参和果品生产中也已广泛投产应用。原理植物组织培养的原理是细胞全能性。也就是说每个植物细胞里都含有一整套遗传物质，只不过在特定条件下不会表达。基于此原理就可以将已处于分化终端或正在分化的植物组织脱分化，诱导形成愈伤组织，再在愈伤组织上形成新的丛生芽。培养过程1.愈伤组织的培养条件：必须无菌操作。2.材料：刚生长不久，具有高度分裂能力的茎尖，芽尖，感染病毒的机会很小。3.植物细胞全能性，确保组织能培养成植株。4.在无菌操作室中完成接种工作，然后放于培养室[光照（日光灯照射），温度（25度）中培养。完成操作后，在培养室中培养时就需要光照条件了。作用1、改良作物2、增加遗传变异性2.1单倍体育种通过花药培养，从小孢子获得单倍体植株，染色体加倍后获得正常二倍体植株，这是一条育种的新途径。单倍体育种可以缩短育种年限，节约人力物力，较快地获得优良品种，21世纪初已有四十多种植物获得了单倍体植株。中国在水稻、小麦、烟草、柏树、橡胶、辣椒等植物的单倍体育种的工作上，处于领先地位。2.2胚培养、子房培养、胚珠培养为了克服远缘杂交的不亲和性，可采用胚、子房、胚珠培养和试管受精等手段。最早成功的例子是两个栽培种亚麻的杂交胚发生败育，利用杂种胚培养克服了一些障碍，得到种子。在棉花、黄麻上获得成功。从玉米的离体子房培养，经体外受粉可以得到种子。2.3突变体的选择和应用由于植物的单细胞培养成功，可以用这个方法诱发单细胞进行突变，通过筛选所需要的突变体，然后使细胞分化成植株，再通过有性世代使遗传性稳定下来，这是从细胞水平来改造植物的一种途径。除细胞外，愈伤组织、花药、原生质体都可诱发突变。70年代以来，世界各国在这方面已有不少成功的例子，如：已选育出抗花叶病毒的甘蔗无性系，抗1-2%NaCl的野生烟草细胞株，抗除草剂的白三叶草细胞株等。2.4体细胞杂交和遗传工程自1960年以来用酶法获得大量有活力的植物原生质体，现已从四十多种植物的原生质体产生出再生植株。通过异种原生质体的相互融合（即体细胞杂交）为植物育种工作开阔新的途径。原生质体融合的工作自1972年Carlson在两个烟草种间成功以来，21世纪初除种内与种间能获得杂种植株外，在属间甚至不同科的植物间亦做了许多工作，如烟草与大豆、烟草与天仙子、矮牵牛与小花矮牵牛、番茄与矮牵牛等都得到了杂种植株。此外，通过原生质体融合，并以选择胞质链霉素抗性做手段以转移烟草的雄性不育性状，或通过原生质体融合转移胞质的抗林可霉素因子都得到成功。原生质体没有胞壁，容易接受外来的引入物质。由于致癌农杆菌可以使多种植物形成肿瘤，以及已发现它所带的Ti质粒可以有效的插入植物细胞的基因组中，所以一些研究者也设想能否以Ti质粒作为载体，与固氮基因重组后转入植物的细胞中，如能实现将固氮基因转到非豆科植物如水稻、小麦、玉米等作物中，则遗传工程在创新植物类型上的前景，无疑是非常广阔的。三、繁殖植物组织培养中从一个单细胞，一块愈伤组织，一个芽（或其它器官）都可以获得无性系。无性系就是用植物体细胞繁殖所获得的后代。用植物组织培养技术繁殖的无性系可概括为五个类型：原球茎细胞或组织培养经原球茎途径分化成植株。大部分兰花属于这一类型，即兰花的各个部分的离体组织都能诱导形成原球茎，再经培养分化形成植株。器官发生型即从细胞或愈伤组织培养通过不定芽形成植株，如烟草愈伤组织培养分化所得的植株。胚状体发生型从细胞或愈伤组织通过胚状体途径，即由球形期、鱼雷期、心形期、子叶期经成熟胚发育成植株，如胡萝卜体细胞培养可通过胚状体途径形成植株。从离体珠茎、花芽、叶、鳞片等，亦即从离体的母体组织直接产生小植株，如贝母、百合等。无菌短枝扦插。选取已发育成熟的腋芽，连同短枝经表面灭菌后在无菌条件下培养，使其生根。腋芽可用生长激素处理促使其萌发。这一方法在较短时间内即可获得一个植株，对保存珍贵的优良树种或花卉品种是简易而有效的方法。通过组织培养可以做到快速繁殖一年中从一个芽得到103-106个芽，达到快速目的。国外在草莓、苹果、柑桔、兰花、石竹、铁线莲、杜鹃、月季、桉树等进行快速繁殖已达到商品化。中国已获成功的有甘蔗、月季、菊花、无籽西瓜、栎树、山楂、猕猴桃、雪松等。通过组织培养可以进行无病毒植株的培育，病毒是植物的严重病害，病毒病的种类不下五百多种。受害的粮食作物有水稻、小麦、马铃薯、甘薯，蔬菜作物有：油菜、大蒜，果树有：柑桔、苹果、枣，花卉有：唐菖蒲、石竹、兰花等。防治无方，只好拔除病株，因而造成很大经济损失。病毒在植株上的分布是不均一的，老叶、老的组织和器官病毒含量高，幼嫩的未成熟组织和器官病毒含量较低，生长点几乎不含病毒或病毒较少。1952年法国Morel用生长点培养法获得无病毒植株成功，以后许多国家开展了这方面的工作。已在马铃薯、甘薯、大蒜、石竹、百合、兰花、草霉等植物上得到成功。如果采用0.1毫米以下的生长点，则培养时间长（1-1.5年），成活率低，无病毒苗。在我国