苦碟子治疗大鼠肝纤维化的实验研究

苦碟子治疗大鼠肝纤维化的实验研究摘要观察苦碟子对肝纤维化的治疗作用，探讨其治疗肝纤维化的作用机制。采用CCL4腹腔注射和酒精灌胃复合因素制备大鼠肝纤维化模型，设正常组、模型组、苦碟子小剂量组（苦碟子注射液0.2ml/100g体重腹腔注射）、苦碟子中剂量组（苦碟子注射液0.4ml/100g体重腹腔注射）、苦碟子大剂量组（苦碟子注射液0.6ml/100g体重腹腔注射），治疗各组连续用药4周。治疗结束后各组检测血清肝功能指标、肝纤维化标志物（HA、LN、PCIII、IV-C）、肝组织HYP及脂质过氧化反应指标（SOD、MDA），采用免疫组化（SABC法）检测肝组织α-SMA表达，并对肝组织进行HE染色和VG染色，光镜观察肝组织纤维化程度。模型组大鼠血清ALT、AST、HA、LN、PCIII、IV-C和肝组织HYP、MDA含量较正常组明显升高，而肝组织SOD活性明显降低；苦碟子大剂量组、苦碟子中剂量组与模型组比较明显降低血清ALT、AST、HA、LN、PCIII、IV-C和肝组织HYP、MDA含量，提高肝组织SOD活性，肝组织细胞变性、胶原增生亦较模型组明显降低；模型组大鼠肝组织α-SMA明显增多，苦碟子大剂量组、苦碟子中剂量组可以明显降低α-SMA表达；苦碟子大剂量组、中剂量组与苦碟子小剂量组比较有明显差异。苦碟子可以降低肝纤维化大鼠血清ALT、AST、HA、LN、PCIII、IV-C和肝组织HYP、MDA含量，提高肝组织SOD活性，改善肝组织细胞变性、胶原增生，抑制HSC活化、增殖，因此对肝纤维化的治疗有确切的效果，且苦碟子大剂量和中剂量效果相当，但都优于苦碟子小剂量组，反映苦碟子对肝纤维化的治疗有一定的量效范围。苦碟子可能通过通过抗脂质过氧化反应，保护肝细胞；拮抗肝星状细胞的活化增殖；调控胶原纤维的代谢，减少细胞外基质合成分泌，抑制纤维组织增生等方面发挥对肝纤维化的治疗作用。关键词苦碟子；肝纤维化；实验研究一、引言肝纤维化是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生，导致肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀的病理过程。它不是一个独立的疾病，而是许多慢性肝脏疾病均可引起的共同病理改变，是慢性肝病发展至肝硬化的必经阶段。肝纤维化的发病机制十分复杂，涉及多种细胞和细胞因子的相互作用。目前认为，肝星状细胞（HSC）的活化是肝纤维化发生发展的中心环节。正常情况下，HSC处于静止状态，当肝脏受到损伤时，HSC被激活，转化为肌成纤维细胞样细胞，大量增殖并分泌细胞外基质，如胶原蛋白、层粘连蛋白等，导致肝内纤维组织过度沉积，从而引起肝纤维化。目前临床上用于治疗肝纤维化的药物种类有限，且存在诸多不足之处。例如，一些药物的疗效不够理想，无法有效逆转肝纤维化进程；部分药物具有较大的副作用，限制了其长期使用；还有一些药物的价格昂贵，给患者带来了沉重的经济负担。因此，寻找安全、有效的抗肝纤维化药物具有重要的临床意义。苦碟子为菊科植物抱茎苦荬菜的全草，其性寒，味苦、辛，具有清热解毒、凉血、消痈排脓、祛瘀止痛等功效。在传统医学中，苦碟子常用于治疗阑尾炎、肠炎、痢疾、各种化脓性炎症、吐血、衄血、头痛、牙痛等病症。近年来，随着对苦碟子研究的不断深入，发现其在心血管系统、神经系统等方面具有多种药理活性。有研究报道，苦碟子具有抗氧化、抗炎、抗血小板聚集等作用，这些作用可能与苦碟子中含有的多种化学成分有关，如黄酮类、萜类、生物碱等。鉴于肝纤维化的发病机制与氧化应激、炎症反应等密切相关，推测苦碟子可能对肝纤维化具有一定的治疗作用，但目前相关研究较少，其作用机制尚不明确。因此，本研究旨在通过建立大鼠肝纤维化模型，观察苦碟子对肝纤维化的治疗作用，并探讨其可能的作用机制，为临床治疗肝纤维化提供新的思路和实验依据。二、材料与方法2.1实验动物健康雄性SD大鼠，体重200±20g，购自[实验动物供应单位名称]。动物饲养于温度（22±2）℃、相对湿度（50±10）%的环境中，自由摄食和饮水，适应性饲养1周后进行实验。2.2实验药物与试剂苦碟子注射液，规格为2ml：10mg（原生药），由[生产厂家名称]生产；四氯化碳（CCL4），分析纯，购自[试剂公司名称]；无水乙醇，分析纯，购自[试剂公司名称]；橄榄油，购自[超市名称]；谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、白蛋白（Alb）、球蛋白（Glob）检测试剂盒，购自[试剂盒生产厂家名称]；透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）、III型前胶原（PCIII）、IV型胶原（IV-C）检测试剂盒，购自[试剂盒生产厂家名称]；羟脯氨酸（HYP）检测试剂盒，购自[试剂盒生产厂家名称]；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒，购自[试剂盒生产厂家名称]；α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）免疫组化检测试剂盒，购自[试剂盒生产厂家名称]；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒、维多利亚蓝（VG）染色试剂盒，购自[试剂盒生产厂家名称]。2.3主要仪器设备全自动生化分析仪，型号[具体型号]，[生产厂家名称]；酶标仪，型号[具体型号]，[生产厂家名称]；高速冷冻离心机，型号[具体型号]，[生产厂家名称]；石蜡切片机，型号[具体型号]，[生产厂家名称]；光学显微镜，型号[具体型号]，[生产厂家名称]；图像分析系统，型号[具体型号]，[生产厂家名称]。2.4实验方法2.4.1大鼠肝纤维化模型的制备采用CCL4腹腔注射和酒精灌胃复合因素制备大鼠肝纤维化模型。将40只大鼠随机分为正常组（n=8）和模型组（n=32）。模型组大鼠用40%CCL4橄榄油溶液按0.15ml/100g体重腹腔注射，2次/周；同时从实验第2周开始，用20%酒精按1ml/100g体重隔天灌胃。正常组大鼠给予等体积的橄榄油腹腔注射和生理盐水灌胃。实验过程中，每周称取大鼠体重，根据体重调整给药剂量。从第6周起，每周末随机处死1只模型组大鼠，取肝脏进行病理检查，判断肝纤维化程度，直至有2期以上肝纤维化形成，即确定肝纤维化模型复制成功，造模共8周。2.4.2实验分组与给药将造模成功的大鼠随机分为模型组、苦碟子小剂量组、苦碟子中剂量组、苦碟子大剂量组，每组8只。苦碟子小剂量组给予苦碟子注射液0.2ml/100g体重腹腔注射，苦碟子中剂量组给予苦碟子注射液0.4ml/100g体重腹腔注射，苦碟子大剂量组给予苦碟子注射液0.6ml/100g体重腹腔注射，模型组和正常组给予等体积的生理盐水腹腔注射。各组均每天给药1次，连续用药4周。2.4.3标本采集与检测指标血清采集与肝功能指标检测：末次给药后，大鼠禁食不禁水12h，然后用10%水合氯醛按0.3ml/100g体重腹腔注射麻醉，经股动脉取血5ml，置于离心管中，3000r/min离心15min，分离血清，采用全自动生化分析仪检测血清中ALT、AST、Alb、Glob含量。血清肝纤维化标志物检测：采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中HA、LN、PCIII、IV-C含量，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。肝组织采集与相关指标检测：取血后，迅速取出肝脏，用预冷的生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分，称取肝左叶相同部位组织1g，加入9倍体积的生理盐水，在冰浴条件下匀浆，3000r/min离心15min，取上清液，采用化学比色法检测肝组织中HYP含量；采用硫代巴比妥酸（TBA）法检测肝组织中MDA含量；采用黄嘌呤氧化酶法检测肝组织中SOD活性，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。肝组织病理检查：取肝左叶相同部位组织，用10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片，进行HE染色和VG染色，光镜下观察肝组织病理学变化，评估肝组织纤维化程度。免疫组化检测肝组织α-SMA表达：采用免疫组化SABC法检测肝组织α-SMA表达，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。以PBS代替一抗作为阴性对照，用已知阳性切片作为阳性对照。结果判断：α-SMA阳性产物呈棕黄色，位于细胞质中。每张切片随机选取5个高倍视野（×400），采用图像分析系统测定阳性细胞面积占视野总面积的百分比，即阳性表达率。2.5统计学方法采用SPSS22.0统计学软件进行数据分析。实验数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），组间两两比较采用LSD法。以P<0.05为差异有统计学意义。三、实验结果3.1一般情况观察实验期间，正常组大鼠饮食、活动正常，精神状态良好，皮毛光滑有光泽，体重逐渐增加。模型组大鼠在造模过程中逐渐出现饮食减少、活动量降低、精神萎靡、皮毛粗糙无光泽、体重增长缓慢等症状，部分大鼠出现腹部膨隆、稀便等表现。给药后，苦碟子治疗组大鼠的精神状态、饮食和活动情况逐渐改善，其中苦碟子大剂量组和中剂量组改善较为明显，体重增长速度较模型组加快；苦碟子小剂量组也有一定程度的改善，但效果不如大剂量组和中剂量组。3.2苦碟子对肝纤维化大鼠血清肝功能指标的影响与正常组比较，模型组大鼠血清ALT、AST活性显著升高（P<0.01），Alb含量显著降低（P<0.01），A/G比值明显下降（P<0.01）。与模型组比较，苦碟子大剂量组、中剂量组血清ALT、AST活性显著降低（P<0.01），Alb含量显著升高（P<0.01），A/G比值明显升高（P<0.01）；苦碟子小剂量组血清ALT、AST活性也有所降低（P<0.05），Alb含量有所升高（P<0.05），A/G比值有所上升（P<0.05）。苦碟子大剂量组、中剂量组与苦碟子小剂量组比较，各项指标差异均有统计学意义（P<0.05），而苦碟子大剂量组与中剂量组比较，各项指标差异无统计学意义（P>0.05）。具体结果见表1。表1苦碟子对肝纤维化大鼠血清肝功能指标的影响（x±s，n=8）组别ALT（U/L）AST（U/L）Alb（g/L）A/G正常组35.62±5.2348.56±6.1238.54±3.151.65±0.18模型组126.35±15.46189.42±20.3126.48±2.560.98±0.12苦碟子小剂量组102.46±12.35156.28±18.4229.56±2.891.15±0.15苦碟子中剂量组78.54±9.68125.36±15.2333.45±3.021.38±0.16苦碟子大剂量组75.68±8.95120.45±14.3634.21±3.211.42±0.17注：与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01，*P<0.05；与苦碟子小剂量组比较，△P<0.05。3.3苦碟子对肝纤维化大鼠血清肝纤维化标志物的影响与正常组比较，模型组大鼠血清HA、LN、PCIII、IV-C含量显著升高（P<0.01）。与模型组比较，苦碟子大剂量组、中剂量组血清HA、LN、PCIII、IV-C含量显著降低（P<0.01）；苦碟子小剂量组血清HA、LN、PCIII、IV-C含量也有所降低（P<0.05）。苦碟子大剂量组、中剂量组与苦碟子小剂量组比较，各项指标差异均有统计学意义（P<0.05），而苦碟子大剂量组与中剂量组比较，各项指标差异无统计学意义（P>0.05）。具体结果见表2。表2苦碟子对肝纤维化大鼠血清肝纤维化标志物的影响（x±s，n=8，ng/ml）组别HALNPCIIIIV-C正常组56.32±7.1548.56±6.2372.45±8.3642.35±5.12模型组289.45±30.21205.68±22.35189.46±20.45126.35±15.46苦碟子小剂量组235.68±25.36178.45±18.56156.32±16.35102.46±12.35苦碟子中剂量组189.42±20.45145.68±15.23125.46±14.3685.68±10.45苦碟子大剂量组180.45±18.56138.54±14.36118.56±13.2180.45±9.68注：与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01，*P<0.05；与苦碟子小剂量组比较，△P<0.05。3.4苦碟子对肝纤维化大鼠肝组织HYP及脂质过氧化反应指标的影响与正常组比较，模型组大鼠肝组织HYP、MDA含量显著升高（P<0.01），SOD活性显著降低（P<0.01）。与模型组比较，苦碟子大剂量组、中剂量组肝组织H