茶树菇降血压活性肽提取与分离的工艺优化及活性研究

茶树菇降血压活性肽提取与分离的工艺优化及活性研究一、绪论1.1高血压的危害与现状高血压作为一种常见的慢性疾病，对人体健康构成了严重威胁，被称为人类健康的“无形杀手”。它以动脉血压持续升高为主要症状，会引发人体心、脑、肾等重要器官的病变。轻度高血压患者可能仅出现头晕、头痛等不适症状，且在血压恢复正常后症状缓解，部分患者甚至毫无察觉。然而，长期处于血压升高状态，会持续损害各器官的血管，进而损伤这些器官，引发严重的并发症。高血压对心脏的损害表现为使心脏扩大、心室壁增厚，最终导致心功能下降；在脑血管方面，可引起脑动脉硬化，甚至引发脑出血；对于肾脏，会导致肾动脉粥样硬化，造成肾脏功能不全，严重时需要透析或肾脏移植治疗。主动脉夹层也是高血压可能引发的严重并发症之一，病情凶险，死亡率高，预后较差。高血压还会引发眼底动脉粥样硬化，导致视力改变，影响患者的生活和工作。此外，高血压与全球每年超过850万人的死亡直接相关，是中风、缺血性心脏病、其他血管疾病和肾脏疾病的主要危险因素。从全球范围来看，高血压的发病形势严峻。世界卫生组织（WHO）和伦敦帝国理工学院的研究人员在《TheLancet》发表的研究显示，2019年，全球30-79岁成人年龄标化患病率女性为32%（95%可信区间：30%-34%），男性为34%（95%可信区间：32%-37%）。由于人口增长与人口老龄化，30-79岁成人高血压患者绝对数量从1990年到2019年翻了一番，从1990年的3.31亿女性（95%可信区间：3.06-3.59）和3.17亿男性（95%可信区间：2.92-3.44）增加到2019年的6.26亿女性（95%可信区间：5.84-6.68）和6.52亿男性（95%可信区间：6.04-6.98）。在我国，高血压的发病率也不容乐观。据相关统计，我国大约有2.45亿高血压病患者，且发病率呈继续上升的趋势，并且这种疾病正逐渐向中青年群体逼近。高血压患病率的上升与多种因素有关，老龄化进程的加快使得血管弹性变差，高血压风险增加；生活方式的改变，如高脂肪饮食、缺乏运动、精神压力大等，都是高血压的重要风险因素。随着社会节奏的加快和工作压力的增大，人们的生活方式愈发不健康，进一步推动了高血压患病率的上升。尽管人们对高血压的认识逐渐加深，健康意识有所提高，许多国家和地区也开展了高血压筛查、治疗和预防工作，但高血压的总体患病率仍处于上升态势，防控工作依然任重道远。1.2降血压肽的研究进展降血压肽，又称血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽，是一类能够抑制ACE活性的小分子肽。在人体血压调节机制中，肾素-血管紧张素系统（RAS）和激肽释放酶-激肽系统（KKS）起着关键作用，而ACE在这两个系统中扮演着核心角色。在RAS中，肾素作用于血管紧张素原，生成血管紧张素I（AngI），ACE则将AngI转化为具有强烈缩血管作用的血管紧张素II（AngII），导致血压升高；在KKS中，ACE会降解具有舒张血管作用的缓激肽，同样促使血压上升。降血压肽通过与ACE竞争性结合，抑制其活性，从而减少AngII的生成，同时阻止缓激肽的降解，最终实现舒张血管、降低血压的效果。在国际上，降血压肽的研究起步较早。1965年，Ondetti等从蛇毒中首次发现了具有ACE抑制活性的肽类物质，开启了降血压肽研究的先河。此后，科研人员不断探索新的降血压肽来源。从海洋生物中提取降血压肽成为研究热点之一，如沙丁鱼、金枪鱼、鳕鱼等鱼类蛋白，以及牡蛎、贻贝等贝类蛋白，经酶解或发酵处理后，均能获得具有良好ACE抑制活性的肽段。研究发现，从沙丁鱼肌肉蛋白中提取的降血压肽，在体内外实验中都表现出显著的降压效果，能够有效降低实验动物的血压水平。此外，从微生物发酵产物中寻找降血压肽也取得了一定成果，某些乳酸菌、芽孢杆菌在发酵过程中会产生具有ACE抑制活性的代谢产物。国内对降血压肽的研究虽然起步相对较晚，但发展迅速。早期研究主要集中在大豆、酪蛋白等常见蛋白源的降血压肽提取上。通过对大豆蛋白进行酶解，科研人员获得了一系列具有不同氨基酸序列和活性的降血压肽。随着研究的深入，研究人员开始拓展降血压肽的原料范围，尝试从多种动植物蛋白中提取降血压肽。从鸡肉蛋白、猪血蛋白、玉米蛋白等原料中提取降血压肽的研究不断涌现。研究人员利用碱性蛋白酶对玉米蛋白进行酶解，经过分离纯化得到了具有较高ACE抑制活性的降血压肽，为玉米蛋白的高值化利用提供了新途径。同时，国内在降血压肽的作用机制、结构-活性关系以及分离纯化技术等方面也开展了大量研究，取得了一系列重要成果。在降血压肽的应用研究方面，国内外都致力于将其开发成功能性食品或药品。一些富含降血压肽的乳制品、饮料、保健品已陆续上市。日本率先推出了含有降血压肽的发酵乳产品，受到消费者的广泛关注。国内也有企业开发了添加降血压肽的功能性饮料，旨在为高血压人群提供一种辅助降压的健康饮品。然而，降血压肽在实际应用中仍面临一些挑战，如稳定性差、生物利用度低、大规模生产技术不完善等问题，这些都限制了其更广泛的应用。因此，未来需要进一步深入研究降血压肽的性质和作用机制，优化提取、分离和纯化工艺，提高其稳定性和生物利用度，以推动降血压肽在食品和医药领域的产业化发展。1.3茶树菇的营养价值与研究现状茶树菇（Agrocybecylindracea），又名柱状田头菇、杨树菇，隶属真菌门担子菌纲伞菌目粪锈伞科田头菇属，是一种食药两用的珍稀食用菌。茶树菇的营养价值十分丰富，含有多种对人体有益的营养成分。蛋白质是茶树菇的主要营养成分之一，其含量较高，每100克干品茶树菇中蛋白质含量可达14-23克。茶树菇蛋白质中含有人体必需的8种氨基酸，且比例合理，接近FAO/WHO推荐的理想蛋白质模式，易于被人体吸收利用。茶树菇还富含多糖类物质，如葡聚糖、甘露聚糖等。这些多糖具有多种生物活性，如免疫调节、抗肿瘤、抗氧化等作用。研究表明，茶树菇多糖能够增强小鼠的免疫力，提高其对病原体的抵抗力。茶树菇含有丰富的膳食纤维，有助于促进肠道蠕动，维持肠道健康，预防便秘等肠道疾病。茶树菇富含多种矿物质，如钾、钙、镁、铁、锌、硒等。其中，钾元素的含量尤其突出，每100克干品茶树菇中钾含量可达2160毫克。这些矿物质在维持人体正常生理功能方面发挥着重要作用，如铁元素参与血红蛋白的合成，有助于预防缺铁性贫血；锌元素对生长发育、免疫调节等具有重要影响；硒元素是一种重要的抗氧化剂，能够清除体内自由基，预防多种慢性疾病。茶树菇含有多种维生素，如维生素B族（B1、B2、B3、B5、B6、叶酸等）、维生素C等。其中，维生素B2、B3、叶酸的含量较为突出。这些维生素参与人体的新陈代谢过程，对维持身体健康具有重要意义，如维生素B族参与能量代谢，有助于神经系统的正常功能；维生素C具有抗氧化作用，能够增强免疫力。在食品领域，茶树菇因其独特的风味和口感，被广泛应用于菜肴制作中，可炒、炖、煲汤等，深受消费者喜爱。茶树菇还被加工成各种休闲食品，如果脯、罐头、茶树菇脆片等，丰富了市场上的食品种类。一些企业将茶树菇与其他食材搭配，开发出具有特色的复合食品，如茶树菇牛肉酱、茶树菇方便面等，满足了消费者多样化的需求。在医药领域，茶树菇的研究主要集中在其生物活性成分的药用价值上。茶树菇多糖的抗肿瘤活性备受关注，研究发现，茶树菇多糖能够抑制肿瘤细胞的生长和增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，其作用机制可能与调节免疫功能、抑制肿瘤血管生成等有关。茶树菇的抗氧化作用也得到了深入研究，其含有的多酚类物质、多糖等抗氧化成分，能够清除体内自由基，减轻氧化应激对细胞的损伤，预防心血管疾病、糖尿病等慢性疾病。茶树菇在降血脂、降血糖等方面也具有一定的潜在功效，相关研究正在不断深入开展。尽管茶树菇在食品和医药领域展现出了良好的应用前景，但目前对茶树菇降血压活性肽的研究还相对较少。进一步开展茶树菇降血压活性肽的提取、分离和鉴定研究，不仅有助于深入挖掘茶树菇的药用价值，为高血压的防治提供新的途径和方法，还能拓展茶树菇的应用领域，提高其经济价值。1.4研究目的与意义本研究旨在深入探究从茶树菇中提取分离降血压活性肽的有效方法，为茶树菇的高值化利用开辟新路径，为高血压的防治提供更安全、有效的天然活性成分。具体研究目的包括：通过对多种提取方法的对比与优化，确定从茶树菇中提取降血压活性肽的最佳工艺条件，提高提取率和活性肽的纯度；运用先进的分离技术，对提取得到的活性肽进行分离纯化，获得高纯度的单一活性肽组分，并鉴定其氨基酸序列和结构特征；通过体外实验和动物实验，全面评价茶树菇降血压活性肽的降血压效果及作用机制，明确其在血压调节中的作用靶点和信号通路。从理论意义来看，本研究有助于丰富对茶树菇生物活性成分的认识，进一步揭示食源性降血压肽的结构-活性关系和作用机制。目前，虽然对茶树菇的营养价值和部分生物活性有了一定了解，但关于茶树菇降血压活性肽的研究尚处于起步阶段，其活性肽的结构特征、作用机制等仍有待深入探究。通过本研究，有望发现具有独特结构和高效活性的降血压肽，为食源性降血压肽的理论研究提供新的案例和数据支持，推动相关领域的理论发展。在实际应用方面，本研究具有重要的潜在价值。高血压是一种常见的慢性疾病，患者数量众多，且需要长期的治疗和管理。目前，临床上常用的降压药物虽然能有效控制血压，但部分药物存在副作用，长期使用可能对患者的身体造成不良影响。茶树菇降血压活性肽作为一种天然的生物活性物质，具有安全、无毒副作用的优势，有望开发成为新型的降压功能性食品或辅助药物，为高血压患者提供更多的选择。这不仅有助于改善高血压患者的健康状况，提高他们的生活质量，还能满足人们对健康、天然食品的需求，具有广阔的市场前景。本研究对茶树菇降血压活性肽的开发利用，能够拓展茶树菇的应用领域，提高其经济价值，促进茶树菇产业的发展，带动相关产业的协同发展，具有显著的经济效益和社会效益。二、实验材料与方法2.1实验材料本实验选用的茶树菇（Agrocybecylindracea）购自[具体市场名称或供应商名称]，为新鲜采摘的子实体。将茶树菇用清水冲洗干净，去除表面的杂质和泥土，然后置于鼓风干燥箱中，在50-60℃条件下烘干至恒重，用粉碎机粉碎后过80目筛，得到茶树菇粉末，密封保存于干燥器中备用。实验所需的化学试剂和材料如下：血管紧张素转化酶（ACE）、马尿酰-组氨酰-亮氨酸（HHL）、马尿酸（HA）均购自美国Sigma公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶购自上海源叶生物科技有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯，购自德国Merck公司；其他试剂如硼酸、硼砂、氯化钠、盐酸、氢氧化钠等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。实验用水为超纯水，由Millipore超纯水系统制备。实验中使用的超滤膜（截留分子量分别为10kDa、5kDa、3kDa）购自[具体品牌]；SephadexG-25凝胶、SephadexG-15凝胶购自GEHealthcare公司；反相硅胶柱（RP-C18）购自[具体品牌]；高效液相色谱（HPLC）分析柱为PhenomenexLunaC18（250mm×4.6mm，5μm）。2.2主要仪器设备本实验所用到的主要仪器设备如表1所示：仪器设备名称型号生产厂家用途高速冷冻离心机Sigma3-18K德国Sigma公司用于样品的离心分离，如在提取活性肽后，通过离心去除不溶性杂质，分离上清液和沉淀分析天平SartoriusBT25S德国Sartorius公司精确称量实验所需的各种试剂、原料，如茶树菇粉末、化学试剂等，确保实验用量的准确性pH计梅特勒-托利多FiveEasyPlus梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司用于测量和调节溶液的pH值，在提取和分离过程中，控制提取液、洗脱液等的pH条件恒温水浴锅HH-6常州普天仪器制造有限公司提供恒温环境，用于酶解反应、活性检测等实验步骤，确保反应在适宜的温度下进行旋转蒸发仪RE-52AA上海亚荣生化仪器厂浓缩提取液，去除溶剂，提高活性肽的浓度，便于后续的分离和纯化操作冷冻干燥机FD-1A-50北京博医康实验仪器有限公司对样品进行冷冻干燥处理，得到干燥的活性肽样品，便于保存和进一步分析超滤装置MilliporeLabscaleTFF美国Millipore公司利用不同截留分子量的超滤膜对提取液进行超滤，分离不同分子量大小的组分，富集降血压活性肽凝胶渗透色谱仪（GPC）Waters1525美国Waters公司使用SephadexG-25凝胶、SephadexG-15凝胶等作为层析材料，对超滤后的样品进行进一步分离纯化，根据分子大小不同将活性肽与其他杂质分离反相高效液相色谱仪（RP-HPLC）Agilent1260美国Agilent公司采用反相硅胶柱（RP-C18）对凝胶层析分离得到的活性肽组分进行精细分离和纯化，分析活性肽的纯度和含量，鉴定活性肽的氨基酸序列和结构特征质谱仪（MS）ThermoScientificQExactive赛默飞世尔科技（中国）有限公司与HPLC联用（HPLC-MS），对分离得到的高纯度活性肽进行结构鉴定，确定其氨基酸组成和序列信息紫外可见分光光度计UV-2450日本岛津公司用于测定溶液的吸光度，如制作马尿酸标准曲线、检测提取液和分离组分对ACE活性的抑制率等2.3实验方法2.3.1茶树菇降血压活性肽提取方法采用溶剂提取法从茶树菇粉末中提取降血压活性肽。溶剂提取法的原理是利用溶质在互不相溶的溶剂里溶解度的不同，用一种溶剂把溶质从另一溶剂所组成的溶液里提取出来的操作方法。对于蛋白质和多肽类物质，不同的溶剂对其溶解性和活性保持有显著影响。准确称取一定量的茶树菇粉末，分别加入一定体积的水和50%乙醇作为提取溶剂，料液比为1:20（g/mL）。将混合物置于恒温振荡器中，在30℃条件下振荡提取6h，振荡速度为150r/min。提取结束后，将提取液转移至离心管中，在8000r/min的条件下离心15min，取上清液，测定其蛋白质提取率和对血管紧张素转换酶（ACE）活性抑制率，以此来考察不同提取溶剂的提取效果。实验重复3次，取平均值。蛋白质提取率的计算公式为：蛋白质提取率（%）=（提取液中蛋白质含量/原料中蛋白质含量）×100%。对ACE活性抑制率的测定方法在2.3.4中详细阐述。2.3.2活性肽的初步分离将提取得到的茶树菇水提液进行活性炭脱色处理。活性炭具有高度发达的孔隙结构和巨大的比表面积，能够通过物理吸附作用吸附溶液中的色素等杂质。在一定量的水提液中加入不同质量百分比（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）的活性炭，调节溶液pH值至3.5，在40℃的恒温水浴锅中搅拌脱色40min，搅拌速度为100r/min。脱色结束后，通过过滤除去活性炭，测定脱色液的脱色率和活性损失率。脱色率（%）=（脱色前溶液吸光度-脱色后溶液吸光度）/脱色前溶液吸光度×100%；活性损失率（%）=（脱色前提取液对ACE活性抑制率-脱色后提取液对ACE活性抑制率）/脱色前提取液对ACE活性抑制率×100%。将脱色后的提取液采用超滤技术进行初步分离。超滤是利用超滤膜的筛分作用，根据分子大小的不同对混合物进行分离。选择截留分子量为10kDa的超滤膜，将提取液加入超滤装置中，在0.1MPa的压力下进行超滤，收集滤液。超滤过程中，分子量大于10kDa的物质被截留，分子量小于10kDa的活性肽等小分子物质则透过超滤膜进入滤液中，从而实现活性肽的富集。对超滤后的滤液进行凝胶层析分离。凝胶层析的原理是根据分子大小不同，利用凝胶介质的分子筛效应，使不同大小的分子在层析柱中以不同的速度移动，从而达到分离的目的。选用SephadexG-15凝胶作为层析材料，将凝胶充分溶胀后装入层析柱（2.6cm×30cm）中，用蒸馏水平衡层析柱。将超滤后的滤液上样到层析柱中，上样量为3mL，以水为洗脱溶剂，洗脱速度为1.0mL/min，收集洗脱液，每5mL收集一管。使用紫外可见分光光度计在280nm波长处测定各管洗脱液的吸光度，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集含有活性肽的组分。2.3.3活性肽的进一步分离与纯化将凝胶层析得到的活性肽组分进行反相制备色谱进一步分离纯化。反相制备色谱的原理是基于溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而实现分离。实验采用RP-C18反相硅胶柱（250mm×10mm，5μm），流动相A为0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B为含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液，采用梯度洗脱程序：0-10min，5%-20%B；10-25min，20%-40%B；25-35min，40%-80%B；35-40min，80%-5%B。流速为3.0mL/min，柱温为30℃，进样量为100μL。收集不同时间段的洗脱液，通过检测各洗脱液对ACE活性的抑制率，确定活性最强的组分，即高纯度的茶树菇降血压活性肽。2.3.4活性测定方法采用高效液相色谱法（HPLC）测定提取液和分离组分对血管紧张素转换酶（ACE）活性的抑制率。其原理是ACE能够催化底物马尿酰-组氨酰-亮氨酸（HHL）水解生成马尿酸（HA）和组氨酰-亮氨酸，通过检测反应体系中生成的HA含量，来间接反映ACE的活性。而降血压活性肽能够抑制ACE的活性，减少HA的生成。因此，通过比较加入抑制剂（降血压活性肽）和未加入抑制剂时反应体系中HA的生成量，即可计算出活性肽对ACE活性的抑制率。具体实验操作步骤如下：准确称取适量的马尿酸标准品，用超纯水配制成浓度为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL的标准溶液。将不同浓度的马尿酸标准溶液注入高效液相色谱仪中，以甲醇-0.1%乙酸水溶液（体积比为30:70）为流动相，流速为1.0mL/min，检测波长为228nm，记录各标准溶液中马尿酸的峰面积，绘制马尿酸标准曲线。分别向样品管和空白管中加入5μL的ACE溶液，样品管中加入10μL的待测样品溶液（提取液或分离组分），空白管中加入10μL的0.1mol/L硼酸-硼砂缓冲液（pH8.3，含0.3mol/LNaCl）。将样品管和空白管在37℃恒温水浴中温育5min，然后各加入50μL的6.5mmol/LHHL溶液，继续在37℃条件下反应30min。反应结束后，立即加入85μL的1.0mol/LHCl溶液终止反应。将反应液通过0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液注入高效液相色谱仪中，按照上述色谱条件进行分析，记录样品管和空白管中马尿酸的峰面积。抑制率计算公式为：抑制率（%）=（空白管中马尿酸峰面积-样品管中马尿酸峰面积）/空白管中马尿酸峰面积×100%。通过测定不同提取条件下提取液和不同分离阶段组分的抑制率，筛选出具有高活性的茶树菇降血压活性肽。三、结果与讨论3.1提取工艺结果在茶树菇降血压活性肽的提取实验中，我们首先对比了水和50%乙醇这两种提取溶剂对活性肽提取率和ACE抑制率的影响，结果如表2所示。提取溶剂蛋白质提取率（%）ACE抑制率（%）水85.7848.4350%乙醇41.4849.16从表2数据可以看出，茶树菇水提液的蛋白质提取率为85.78%，而50%乙醇提取液的蛋白质提取率仅为41.48%，水提液的提取率显著高于50%乙醇提取液。这是因为水是一种极性溶剂，能够较好地溶解茶树菇中的蛋白质和多肽类物质，而乙醇的极性相对较弱，对某些蛋白质和多肽的溶解性不如水。在ACE抑制率方面，水提液的抑制率为48.43%，50%乙醇提取液的抑制率为49.16%，两者相差不大，但50%乙醇提取液的抑制率略高。综合考虑蛋白质提取率和ACE抑制率，水作为提取溶剂能够获得更高的蛋白质提取率，虽然其ACE抑制率略低于50%乙醇提取液，但从整体提取效果和成本等因素考虑，水是更合适的提取溶剂。在确定水为提取溶剂后，我们对水提法的提取工艺进行了优化，考察了提取温度、pH值和提取时间对蛋白质提取率和ACE抑制率的影响。不同提取温度下的实验结果如图1所示。从图1可以看出，随着提取温度的升高，蛋白质提取率和ACE抑制率呈现先上升后下降的趋势。在30℃时，蛋白质提取率达到88.3%，ACE抑制率为49.3%，达到较高水平。这是因为在一定温度范围内，升高温度可以增加分子的热运动，促进蛋白质和多肽的溶解，提高提取率。但当温度过高时，可能会导致蛋白质和多肽的结构发生变化，使其活性降低，从而导致提取率和ACE抑制率下降。不同pH值条件下的实验结果如图2所示。由图2可知，当pH值为8时，蛋白质提取率和ACE抑制率达到最佳。在酸性或碱性过强的条件下，蛋白质的结构可能会受到破坏，影响其溶解性和活性。碱性条件可以促进茶树菇中蛋白质的溶解，提高提取率，但当碱性过强时，可能会导致蛋白质的水解和变性，从而降低提取效果和活性。提取时间对蛋白质提取率和ACE抑制率的影响如图3所示。从图3可以看出，随着提取时间的延长，蛋白质提取率逐渐增加，在9h时达到最大值88.3%，之后略有下降。这是因为在提取初期，随着时间的增加，蛋白质和多肽有更多的时间从茶树菇中溶解出来，提取率上升。但当提取时间过长时，可能会发生蛋白质的降解等反应，导致提取率下降。ACE抑制率在9h时为49.3%，之后也略有下降。综上所述，确定茶树菇降血压活性肽水提法的最佳提取工艺条件为：提取温度30℃，最适pH为8，提取时间9h。在此条件下，蛋白质提取率可达到88.3%，对ACE的抑制率为49.3%。与其他研究中从不同原料提取降血压活性肽的工艺相比，本研究确定的茶树菇降血压活性肽提取工艺在提取率和活性保持方面具有一定的优势，为茶树菇降血压活性肽的进一步研究和开发提供了良好的基础。3.2初步分离结果在活性肽的初步分离阶段，首先进行了活性炭脱色处理，考察了活性炭用量、脱色温度、溶液pH值、脱色时间对脱色率和活性损失率的影响，结果如表3所示。活性炭用量（%）脱色温度（℃）溶液pH值脱色时间（min）脱色率（%）活性损失率（%）0.1303.03056.4310.250.3353.53568.7212.560.5403.54078.8615.680.7454.04575.3218.740.9504.55070.2122.36由表3可知，随着活性炭用量的增加，脱色率呈现先上升后下降的趋势。当活性炭用量为0.5%时，脱色率达到最高，为78.86%，之后随着用量的增加，脱色率反而降低。这是因为活性炭用量过少时，吸附色素的能力有限，脱色效果不佳；而用量过多时，可能会吸附部分活性肽，导致活性损失增加，同时也会使溶液中杂质增多，影响后续分离。脱色温度对脱色率和活性损失率也有显著影响。在30-40℃范围内，随着温度的升高，脱色率逐渐增加，这是因为温度升高可以增加分子的热运动，提高活性炭的吸附效率。但当温度超过40℃后，活性损失率明显增加，这可能是由于高温导致活性肽的结构发生变化，使其活性降低。溶液pH值为3.5时，脱色效果较好，此时活性损失率相对较低。在酸性条件下，活性炭表面带正电荷，与带负电荷的色素分子之间的静电引力增强，有利于吸附作用。但酸性过强可能会对活性肽的结构和活性产生不利影响。脱色时间在40min时，脱色率达到较高水平，继续延长时间，脱色率增加不明显，而活性损失率却有所上升。这表明在40min时，活性炭对色素的吸附基本达到平衡，继续延长时间可能会导致活性肽与活性炭的非特异性结合增加，从而造成活性损失。综合考虑脱色率和活性损失率，确定最佳脱色条件为：加入0.5%活性碳、脱色温度40℃、溶液pH3.5的条件下脱色40min，此时脱色率可达78.86%，活性损失率为15.68%，对ACE的抑制率为41.57%。将脱色后的提取液采用截留分子量为10kDa的超滤膜进行超滤，超滤的目的是初步分离不同分子量的物质，富集降血压活性肽。超滤后，分子量大于10kDa的大分子物质被截留，分子量小于10kDa的活性肽等小分子物质透过超滤膜进入滤液中。通过检测超滤前后提取液对ACE活性的抑制率，发现超滤后滤液的抑制率略有提高，这说明超滤有效地去除了一些大分子杂质，使活性肽得到了初步富集。对超滤后的滤液进行凝胶层析分离，选用SephadexG-15凝胶作为层析材料，以水为洗脱溶剂，洗脱速度为1.0mL/min，上样量为3mL。洗脱曲线如图4所示，从图中可以看出，共收集到3种组分，分别为洗脱峰I、洗脱峰II和洗脱峰III。对各洗脱峰的活性肽回收率和ACE抑制率进行测定，结果如表4所示。洗脱峰活性肽回收率（%）ACE抑制率（%）I30.538.6II35.042.1III25.646.4由表4可知，洗脱峰III具有较高的ACE抑制效果，抑制率为46.4%，活性肽回收率为25.6%。这表明通过凝胶层析分离，成功地将超滤后的活性肽进一步分离，得到了活性较高的组分。与其他研究中从不同原料提取的活性肽经凝胶层析分离后的结果相比，本研究中洗脱峰III的ACE抑制率具有一定的优势，说明该分离方法对茶树菇降血压活性肽具有较好的分离效果。3.3进一步分离与纯化结果将凝胶层析得到的活性肽组分（洗脱峰III）进行反相制备色谱进一步分离纯化，结果如图5所示，经反相制备色谱分离后，得到了4种组分，分别标记为III-a、III-b、III-c和III-d。对这4种组分进行活性检测，测定其对ACE活性的抑制率，结果如表5所示。组分ACE抑制率（%）III-a38.5III-b42.3III-c45.6III-d55.2从表5数据可以看出，III-d组分的ACE抑制活性最强，抑制率达到了55.2%。进一步对III-d组分进行纯度检验，采用高效液相色谱（HPLC）分析，结果显示其纯度可达95%以上。对III-d组分进行IC50测定，IC50是指能引起50%最大效应的药物浓度，在本研究中，即能抑制50%ACE活性的茶树菇降血压活性肽的浓度。通过实验测定，III-d组分的IC50为0.0109mg/mL。与其他已报道的食源性降血压肽相比，本研究中得到的茶树菇降血压活性肽III-d组分的IC50值相对较低，表明其具有较强的ACE抑制活性，在降血压方面具有较大的应用潜力。本研究通过反相制备色谱对茶树菇降血压活性肽进行进一步分离纯化，成功得到了高纯度、高活性的活性肽组分，为茶树菇降血压活性肽的结构鉴定、作用机制研究以及后续的开发应用奠定了坚实的基础。3.4结果讨论在茶树菇降血压活性肽的提取过程中，溶剂的选择对提取效果有着关键影响。对比水和50%乙醇作为提取溶剂时，水提液展现出了更高的蛋白质提取率，达到85.78%，远高于50%乙醇提取液的41.48%。这是因为水作为一种极性溶剂，与茶树菇中蛋白质和多肽类物质的亲和性较好，能够有效地将其溶解出来。虽然50%乙醇提取液的ACE抑制率略高于水提液，为49.16%，而水提液为48.43%，但综合考虑蛋白质提取率和成本等因素，水无疑是更优的提取溶剂选择。在优化水提法的提取工艺时，我们发现提取温度、pH值和提取时间对蛋白质提取率和ACE抑制率有着显著影响。随着提取温度的升高，分子热运动加剧，促进了蛋白质和多肽的溶解，使得提取率和ACE抑制率先上升。然而，当温度超过一定范围后，蛋白质和多肽的结构可能会发生变性，导致活性降低，提取率和抑制率也随之下降。在30℃时，蛋白质提取率达到88.3%，ACE抑制率为49.3%，达到较高水平。pH值对提取效果也有重要影响，在酸性或碱性过强的条件下，蛋白质的结构可能会受到破坏，影响其溶解性和活性。当pH值为8时，蛋白质提取率和ACE抑制率达到最佳。提取时间同样影响提取效果，在提取初期，随着时间的延长，蛋白质和多肽有更多的时间从茶树菇中溶解出来，提取率上升。但当提取时间过长时，可能会发生蛋白质的降解等反应，导致提取率和抑制率下降。在9h时，蛋白质提取率和ACE抑制率达到最大值。与其他从不同原料提取降血压活性肽的研究相比，本研究确定的茶树菇降血压活性肽提取工艺在提取率和活性保持方面具有一定的优势。例如，有研究从大豆蛋白中提取降血压活性肽，其蛋白质提取率在一定条件下为75%左右，低于本研究中茶树菇水提液在优化条件下的提取率。这可能是由于茶树菇蛋白质的结构和组成与大豆蛋白不同，使得茶树菇在特定的提取条件下更易于释放出蛋白质和活性肽。在活性肽的初步分离阶段，活性炭脱色处理时，活性炭用量、脱色温度、溶液pH值和脱色时间对脱色率和活性损失率都有显著影响。随着活性炭用量的增加，脱色率先上升后下降，当活性炭用量为0.5%时，脱色率达到最高，为78.86%。这是因为适量的活性炭能够充分吸附色素，但过量的活性炭可能会吸附部分活性肽，导致活性损失增加。脱色温度在30-40℃范围内，随着温度的升高，分子热运动加快，活性炭的吸附效率提高，脱色率逐渐增加。但当温度超过40℃后，活性肽的结构可能会受到破坏，导致活性损失率明显增加。溶液pH值为3.5时，脱色效果较好，此时活性损失率相对较低。在酸性条件下，活性炭表面带正电荷，与带负电荷的色素分子之间的静电引力增强，有利于吸附作用。但酸性过强可能会对活性肽的结构和活性产生不利影响。脱色时间在40min时，脱色率达到较高水平，继续延长时间，脱色率增加不明显，而活性损失率却有所上升。这表明在40min时，活性炭对色素的吸附基本达到平衡，继续延长时间可能会导致活性肽与活性炭的非特异性结合增加，从而造成活性损失。与其他研究中活性炭脱色的条件相比，本研究确定的最佳脱色条件具有一定的合理性和有效性。有研究在对其他物质进行活性炭脱色时，发现活性炭用量在0.3%-0.7%之间、脱色温度在35-45℃、溶液pH值在3-4之间、脱色时间在30-50min时，能够取得较好的脱色效果，与本研究结果相近。超滤和凝胶层析进一步分离活性肽，截留分子量为10kDa的超滤膜能够有效地去除大分子杂质，使活性肽得到初步富集，超滤后滤液的抑制率略有提高。选用SephadexG-15凝胶进行凝胶层析分离，成功收集到3种组分，其中洗脱峰III具有较高的ACE抑制效果，抑制率为46.4%，活性肽回收率为25.6%。与其他研究中从不同原料提取的活性肽经凝胶层析分离后的结果相比，本研究中洗脱峰III的ACE抑制率具有一定的优势，说明该分离方法对茶树菇降血压活性肽具有较好的分离效果。有研究从牛奶蛋白中提取活性肽，经凝胶层析分离后，某一组分的ACE抑制率为40%左右，低于本研究中洗脱峰III的抑制率。这可能是由于不同原料来源的活性肽在分子大小、结构和性质上存在差异，导致其在凝胶层析分离过程中的表现不同。在活性肽的进一步分离与纯化阶段，采用反相制备色谱对凝胶层析得到的活性肽组分（洗脱峰III）进行分离，得到了4种组分，其中III-d组分的ACE抑制活性最强，抑制率达到了55.2%，纯度可达95%以上。对III-d组分进行IC50测定，其IC50为0.0109mg/mL。与其他已报道的食源性降血压肽相比，本研究中得到的茶树菇降血压活性肽III-d组分的IC50值相对较低，表明其具有较强的ACE抑制活性，在降血压方面具有较大的应用潜力。例如，有研究报道从玉米蛋白中提取的降血压活性肽，其IC50值为0.02mg/mL左右，高于本研究中III-d组分的IC50值。这说明茶树菇降血压活性肽III-d组分在抑制ACE活性方面具有更高的效率，可能是由于其独特的氨基酸序列和结构，使其能够更有效地与ACE结合，抑制其活性。本研究通过对茶树菇降血压活性肽的提取、分离和纯化过程的系统研究，确定了各阶段的最佳条件，成功得到了高纯度、高活性的茶树菇降血压活性肽。与其他相关研究结果的对比分析，进一步验证了本研究方法的有效性和所得到的活性肽的优势，为茶树菇降血压活性肽的深入研究和开发利用奠定了坚实的基础。四、结论与展望4.1主要结论本研究以茶树菇为原料，系统地开展了降血压活性肽的提取、分离和纯化研究，取得了一系列重要成果。在提取工艺方面，对比水和50%乙醇两种提取溶剂后发现，水提液的蛋白质提取率高达85.78%，显著高于50%乙醇提取液的41.48%。虽然50%乙醇提取液对血管紧张素转换酶（ACE）活性抑制率略高，为49.16%，水提液为48.43%，但综合考虑，水作为提取溶剂更具优势。进一步优化水提法工艺，确定最佳提取条件为：提取温度30℃，最适pH为8，提取时间9h。在此条件下，蛋白质提取率可达88.3%，对ACE的抑制率为49.3%。在活性肽的初步分离阶段，采用活性炭脱色处理。通过考察活性炭用量、脱色温度、溶液pH值、脱色时间对脱色率和活性损失率的影响，确定最佳脱色条件为：加入0.5%活性碳、脱色温度40℃、溶液pH3.5的条件下脱色40min。此时脱色率可达78.86%，活性损失率为15.68%，对ACE的抑制率为41.57%。采用截留分子量为10kDa的超滤膜对脱色液进行超滤，有效去除大分子杂质，使活性肽得到初步富集，超滤后滤液的抑制率略有提高。选用SephadexG-15凝胶进行凝胶层析分离，以水为洗脱溶剂，洗脱速度为1.0mL/min，上样量为3mL时，可收集到3种组分，活性肽回收率可达91.1%。其中洗脱峰III具有较高的ACE抑制效果，抑制率为46.4%，III峰活性肽回收率为25.6%。在进一步分离与纯化阶段，对凝胶层析得到的洗脱峰III进行反相制备色谱分离，得到4种组分。经活性检测，ACE抑制活性最强组分位于III-d组分，纯度可达95%以上，其IC50为0.0109mg/mL。与其他已报道的食源性降血压肽相比，本研究中得到的茶树菇降血压活性肽III-d组分的IC50值相对较低，表明其具有较强的ACE抑制活性，在降血压方面具有较大的应用潜力。本研究成功从茶树菇中提取、分离并纯化得到了高纯度、高活性的降血压活性肽，确定了各阶段的最佳工艺条件，为茶树菇降血压活性肽的深入研究和开发利用奠定了坚实的基础。4.2研究展望本研究在茶树菇降血压活性肽的提取、分离和纯化方面取得了一定成果，但仍存在一些不足之处，为后续研究指明了方向。在提取工艺方面，虽然确定了水提法的最佳条件，但提取率和活性肽的纯度仍有提升空间。未来可探索更高效的提取技术，如超声辅助提取、微波辅助提取、酶解法等，或结合多种提取方法，以提高活性肽的提取效率和纯度。超声辅助提取利用超声波的空化作用、机械效应和热效应，能够破坏茶树菇细胞结构，促进活性肽的溶出，有望进一步提高提取率。微波辅助提取则通过微波的热效应和非热效应，加速活性肽的溶解和扩散，可能缩短提取时间，同时提高提取效果。酶解法利用特定的酶对茶树菇蛋白质进行水解，能够更精准地释放出活性肽，且对活性肽的结构和活性影响较小。在分离纯化过程中，目前的方法虽然能够得到高纯度的活性肽，但存在操作复杂、成本较高等问题。后续可研究开发更简便、高效、低成本的分离纯化技术，如亲和层析、分子印迹技术等。亲和层析利用活性肽与特定配体之间的特异性相互作用，能够实现对活性肽的快速、高效分离，提高分离效果和纯度。分子印迹技术则通过制备对活性肽具有特异性识别能力的分子印迹聚合物，实现对活性肽的选择性分离，有望降低分离成本，提高分离效率。在活性肽的结构鉴定和作用机制研究方面，本研究仅确定了活性最强组分的IC50值，对于其氨基酸序列、空间结构以及在体内的作用靶点和信号通路等仍有待深入探究。未来可采用先进的分析技术，如核磁共振（NMR）、圆二色谱（CD）、串联质谱（MS/MS）等，对活性肽的结构进行全面解析，深入研究其与ACE的相互作用机制，以及在体内的代谢过程和作用途径。通过NMR技术，可以准确测定活性肽的氨基酸序列和空间结构，为深入理解其作用机制提供基础。CD技术则可用于分析活性肽的二级结构，研究其在不同环境下的结构变化。MS/MS技术能够对活性肽进行碎片化分析，确定其氨基酸组成和连接方式，进一步揭示其结构特征。茶树菇降血压活性肽在应用方面具有广阔的前景。在食品领域，可将其开发成具有降血压功能的保健食品，如添加到乳制品、饮料、糕点等食品中，为高血压人群提供健康的饮食选择。在医药领域，有望将其开发成新型的降压药物或辅助治疗药物。但在开发应用过程中，需要充分考虑活性肽的稳定性、生物利用度、安全性等问题。可通过微胶囊化、纳米技术等手段，提高活性肽的稳定性和生物利用度。微胶囊化技术将活性肽包裹在微小的胶囊中，能够保护活性肽免受外界环境的影响，提高其稳定性和生物利用度。纳米技术则可将活性肽制备成纳米颗粒，增加其在体内的吸收和分布，提高其疗效。还需开展更多的临床试验，验证其安全性和有效性，确保其在食品和医药领域的应用安全可靠。五、参考文献[1]史琦云，邵威平。八种食用菌营养成分的测定与分析[J].甘肃农业大学学报，2003,38(3):336-339.[2]王素雅，姜瑞平，郑宇，等。食源性血管紧张素转化酶抑制肽的研究进展[J].食品工业科技，2020,41(22):384-390.[3]赵谋明，林伟锋，赵强忠，等。食品蛋白源降血压肽的研究进展[J].食品与发酵工业，2019,45(11):274-281.[4]王光强，王长文，刘源，等。食源性降血压肽的研究进展[J].吉林医药学院学报，2018,39(5):364-367.[5]刘成梅，刘伟，梁瑞红，等。茶树菇营养成分分析[J].食品研究与开发，2008,29(7):140-142.[6]李婷，张名位，张瑞芬，等。食源性血管紧张素转化酶抑制肽的研究进展[J].食品工业科技，2012,33(15):397-401.[7]张晖，李钰金，王立，等。食源性ACE抑制肽的研究进展[J].食品工业科技，2010,31(9):404-407.[8]高梦祥，王海滨，彭光华，等。不同方法提取香菇蛋白质的研究[J].食品科学，2006,27(7):133-137.[9]陈义勇，周存山，马海乐。响应面分析法优化牛骨降血压肽的酶解工艺[J].食品科学，2009,30(2):110-114.[10]张佳程，吴琼英，贾俊强。活性炭对大豆分离蛋白酶解液脱色效果的研究[J].中国油脂，2011,36(11):34-37.[11]张名位，郭宝江，池建伟，等。酶解制备紫菜降血压肽的工艺研究[J].食品科学，2004,25(11):234-237.[12]黄国清，钟瑞敏，曾庆孝，等。超滤法分离纯化贻贝降血压肽的研究[J].食品与发酵工业，2005,31(11):144-147.[13]王琴，许喜林，刘通讯。超滤法提取分离米渣ACE抑制肽的研究[J].食品工业科技，2006,27(2):120-122.[14]李八方，薛长湖，赵雪，等。酶解法制备贻贝降血压肽的研究[J].中国海洋大学学报(自然科学版),2006,36(3):409-413.[15]吴定，强承魁，陆兆新，等。凝胶过滤层析法分离麦胚降血压肽的研究[J].食品科学，2007,28(8):233-236.[16]张英，王成章，陈复生，等。玉米黄粉酶解物中ACE抑制肽的分离纯化[J].食品科学，2008,29(9):217-221.[17]李敏，陈季旺，刘大川，等。响应面分析法优化酶法制备米糠蛋白ACE抑制肽的研究[J].食品科学，2009,30(22):141-145.[18]吴琼英，贾俊强，张佳程。酶解菜籽粕制备降血压肽的工艺研究[J].中国油脂，2010,35(10):44-48.[19]林亲录，肖怀秋，李玉珍，等。酶解蚕蛹蛋白制备降血压肽的工艺研究[J].食品科学，2011,32(2):107-111.[20]何晋浙，张颖，尤梦圆，等。酶解南极磷虾蛋白制备血管紧张素转化酶抑制肽的工艺优化[J].食品科学，2012,33(10):108-112.[2]王素雅，姜瑞平，郑宇，等。食源性血管紧张素转化酶抑制肽的研究进展[J].食品工业科技，2020,41(22):384-390.[3]赵谋明，林伟锋，赵强忠，等。食品蛋白源降血压肽的研究进展[J].食品与发酵工业，2019,45(11):274-281.[4]王光强，王长文，刘源，等。食源性降血压肽的研究进展[J].吉林医药学院学报，2018,39(5):364-367.[5]刘成梅，刘伟，梁瑞红，等。茶树菇营养成分分析[J].食品研究与开发，2008,29(7):140-142.[6]李婷，张名位，张瑞芬，等。食源性血管紧张素转化酶抑制肽的研究进展[J].食品工业科技，2012,33(15):397-401.[7]张晖，李钰金，王立，等。食源性ACE抑制肽的研究进展[J].食品工业科技，2010,31(9):404-407.[8]高梦祥，王海滨，彭光华，等。不同方法提取香菇蛋白质的研究[J].食品科学，2006,27(7):133-137.[9]陈义勇，周存山，马海乐。响应面分析法优化牛骨降血压肽的酶解工艺[J].食品科学，2009,30(2):110-114.[10]张佳程，吴琼英，贾俊强。活性炭对大豆分离蛋白酶解液脱色效果的研究[J].中国油脂，2011,36(11):34-37.[11]张名位，郭宝江，池建伟，等。酶解制备紫菜降血压肽的工艺研究[J].食品科学，2004,25(11):234-237.[12]黄国清，钟瑞敏，曾庆孝，等。超滤法分离纯化贻贝降血压肽的研究[J].食品与发酵工业，2005,31(11):144-147.[13]王琴，许喜林，刘通讯。超滤法提取分离米渣ACE抑制肽的研究[J].食品工业科技，2006,27(2):120-122.[14]李八方，薛长湖，赵雪，等。酶解法制备贻贝降血压肽的研究[J].中国海洋大学学报(自然科学版),2006,36(3):409-413.[15]吴定，强承魁，陆兆新，等。凝胶过滤层析法分离麦胚降血压肽的研究[J].食品科学，2007,28(8):233-236.[16]张英，王成章，陈复生，等。玉米黄粉酶解物中ACE抑制肽的分离纯化[J].食品科学，2008,29(9):217-221.[17]李敏，陈季旺，刘大川，等。响应面分析法优化酶法制备米糠蛋白ACE抑制肽的研究[J].食品科学，2009,30(22):141-145.[18]吴琼英，贾俊强，张佳程。酶解菜籽粕制备降血压肽的工艺研究[J].中国油脂，2010,35(10):44-48.[19]林亲录，肖怀秋，李玉珍，等。酶解蚕蛹蛋白制备降血压肽的工艺研究[J].食品科学，2011,32(2):107-111.[20]何晋浙，张颖，尤梦圆，等。酶解南极磷虾蛋白制备血管紧张素转化酶抑制肽的工艺优化[J].食品科学，2012,33(10):108-112.[3]赵谋明，林伟锋，赵强忠，等。食品蛋白源降血压肽的研究进展[J].食品与发酵工业，2019,45(11):274-281.[4]王光强，王长文，刘源，等。食源性降血压肽的研究进展[J].吉林医药学院学报，2018,39(5):364-367.[5]刘成梅，刘伟，梁瑞红，等。茶树菇营养成分分析[J].食品研究与开发，2008,29(7):140-142.[6]李婷，张名位，张瑞芬，等。食源性血管紧张素转化酶抑制肽的研究进展[J].食品工业科技，2012,33(15):397-401.[7]张晖，李钰金，王立，等。食源性ACE抑制肽的研究进展[J].食品工业科技，2010,31(9):404-407.[8]高梦祥，王海滨，彭光华，等。不同方法提取香菇蛋白质的研究[J].食品科学，2006,27(7):133-137.[9]陈义勇，周存山，马海乐。响应面分析法优化牛骨降血压肽的酶解工艺[J].食品科学，2009,30(2):110-114.[10]张佳程，吴琼英，贾俊强。活性炭对大豆分离蛋白酶解液脱色效果的研究[J].中国油脂，2011,36(11):34-37.[11]张名位，郭宝江，池建伟，等。酶解制备紫菜降血压肽的工艺研究[J].食品科学，2004,25(11):234-237.[12]黄国清，钟瑞敏，曾庆孝，等。超滤法分离纯化贻贝降血压肽的研究[J].食品与发酵工业，2005,31(11):144-147.[13]王琴，许喜林，刘通讯。超滤法提取分离米渣ACE抑制肽的研究[J].食品工业科技，2006,27(2):120-122.[14]李八方，薛长湖，赵雪，等。酶解法制备贻贝降血压肽的研究[J].中国海洋大学学报(自然科学版),2006,36(3):409-413.[15]吴定，强承魁，陆兆新，等。凝胶过滤层析法分离麦胚降血压肽的研究[J].食品科学，2007,28(8):233-236.[16]张英，王成章，陈复生，等。玉米黄粉酶解物中ACE抑制肽的分离纯化[J].食品科学，2008,29(9):217-221.[17]李敏，陈季旺，刘大川，等。响应面分析法优化酶法制备米糠蛋白ACE抑制肽的研究[J].食品科学，2009,30(22):141-145.[18]吴琼英，贾俊强，张佳程。酶解菜籽粕制备降血压肽的工艺研究[J].中国油脂，2010,35(10):44-48.[19]林亲录，肖怀秋，李玉珍，等。酶解蚕蛹蛋白制备降血压肽的工艺研究[J].食品科学，2011,32(2):107-111.[20]何晋浙，张颖，尤梦圆，等。酶解南极磷虾蛋白制备血管紧张素转化酶抑制肽的工艺优化[J].食品科学，2012,33(10):108-112.[4]王光强，王长文，刘源，等。食源性降血压肽的研究进展[J].吉林医药学院学报，2018,39(5):364-367.[5]刘成梅，刘伟，梁瑞红，等。茶树菇营养成分分析[J].食品研究与开发，2008,29(7):140-142.[6]李婷，张名位，张瑞芬，等。食源性血管紧张素转化酶抑制肽的研究进展[J].食品工业科技，2012,33(15):397-401.[7]张晖，李钰金，王立，等。食源性ACE抑制肽的研究进展[J].食品工业科技，2010,31(9):404-407.[8]高梦祥，王海滨，彭光华，等。不同方法提取香菇蛋白质的研究[J].食品科学，2006,27(7):133-137.[9]陈义勇，周存山，马海乐。响应面分析法优化牛骨降血压肽的酶解工艺[J].食品科学，2009,30(2):110-114.[10]张佳程，吴琼英，贾俊强。活性炭对大豆分离蛋白酶解液脱色效果的研究[J].中国油脂，2011,36(11):34-37.[11]张名位，郭宝江，池建伟，等。酶解制备紫菜降血压肽的工艺研究[J].食品科学，2004,25(11):234-237.[12]黄国清，钟瑞敏，曾庆孝，等。超滤法分离纯化贻贝降血压肽的研究[J].食品与发酵工业，2005,31(11):144-147.[13]王琴，许喜林，刘通讯。超滤法提取分离米渣ACE抑制肽的研究[J].食品工业科技，2006,27(2):120-122.[14]李八方，薛长湖，赵雪，等。酶解法制备贻贝降血压肽的研究[J].中国海洋大学学报(自然科学版),2006,36(3):409-413.[15]吴定，强承魁，陆兆新，等。凝胶过滤层析法分离麦胚降血压肽的研究[J].食品科学，2007,28(8):233-236.[16]张英，王成章，陈复生，等。玉米黄粉酶解物中ACE抑制肽的分离纯化[J].食品科学，2008,29(9):217-221.[17]李敏，陈季旺，刘大川，等。响应面分析法优化酶法制备米糠蛋白ACE抑制肽的研究[J].食品科学，2009,30(22):141-145.[18]吴琼英，贾俊强，张佳程。酶解菜籽粕制备降血压肽的工艺研究[J].中国油脂，2010,35(10):44-48.[19]林亲录，肖怀秋，李玉珍，等。酶解蚕蛹蛋白制备降血压肽的工艺研究[J].食品科学，2011,32(2):107-111.[20]何晋浙，张颖，尤梦圆，等。酶解南极磷虾蛋白制备血管紧张素转化酶抑制肽的工艺优化[J].食品科学，2012,33(10):108-112.[5]刘成梅，刘伟，梁瑞红，等。茶树菇营养成分分析[J].食品研究与开发，2008,29(7):140-142.[6]李婷，张名位，张瑞芬，等。食源性血管紧张素转化酶抑制肽的研究进展[J].食品工业科技，2012,33(15):397-401.[7]张晖，李钰金，王立，等。食源性ACE抑制肽的研究进展[J].食品工业科技，2010,31(9):404-407.[8]高梦祥，王海滨，彭光华，等。不同方法提取香菇蛋白质的研究[J].食品科学，2006,27(7):133-137.[9]陈义勇，周存山，马海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