DB53T 447.4-2022 云岭牛 第4部分：胚胎移植

ICS65.020.30CCSB4353DB53/T447.4-2012DB53/T447.4—2022I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件为DB53/T447—2022《云岭牛》的第4部分。DB53/T447已经发布了以下部分：——第1部分：品种；——第2部分：养殖场建设规范；——第3部分：人工授精；——第4部分：胚胎移植；——第5部分：体外胚胎生产；——第6部分：饲养管理；——第7部分：饲草加工与调制技术；——第8部分：育肥技术；——第9部分：疫病防治；——第10部分：档案管理；——第11部分：胴体生产、评定及分割技术。本文件代替DB53/T447.4-2012《BMY牛第4部分：胚胎移植技术规范》，与DB53/T447.4-2012a)更改标准名称为“云岭牛；d)更改了“胚胎移植的基本原则”中部分表述（见4.2）；）；）；）；）；）；k)更改了“胚胎解冻”中部分表述，并将细管装枪及移植部分内容并入10.5.4（见9.2、——2012年首次发布；——本次为第一次修订。DB53/T447.4—2022DB53/T447-2022《云岭牛》是以场（户）养殖水平和养殖效益，促进云南肉DB53/T447-2022由十一个部分——第1部分：品种。目的在于确立云岭牛特征和特性、生产性能、种牛等级和良种登记，适用于云岭牛品种鉴定和种牛等级评定。——第2部分：养殖场建设规范。目的在于确立云岭牛选址、规划与布局、牛舍建设和辅助设施建设等技术要求。——第3部分：人工授精。目的在于确立云岭牛种公牛选择、母牛的初配年龄与发情鉴定、输精方法、母牛妊娠诊断等技术要求。——第4部分：胚胎移植。目的在于确立云岭牛快速扩繁受体牛同期发情、供体牛超数排卵与输精、胚胎回收、胚胎质量鉴定、胚胎冷冻保存与解冻、胚胎移植、受体牛妊娠诊断等技术要求。——第5部分：体外胚胎生产。目的在于确立云岭牛供体牛的选择与饲养管理、卵母细胞的获取、卵母细胞的检出与分级、卵母细胞的IVM、卵母细胞的IVF、受精卵的IVC等技术要求。——第6部分：饲养管理。目的在于确立云岭牛饲养管理的基本要求以及牛场卫生、各类牛的饲养管理等技术要求。——第7部分：饲草加工与调制技术。目的在于确立云岭牛养殖过程中青贮饲料、秸秆氨（碱）化饲料、青干草饲料的加工调制技术要求。——第8部分：育肥技术。目的在于确立云岭牛优质牛肉生产和雪花牛肉生产技术要求。——第9部分：疫病防治。目的在于确立云岭牛的生物安全、牛场消毒、疫病防治及无害化处理等技术要求。——第10部分：档案管理。目的在于确立云岭牛养殖过程中建档范围、内容及档案管理的技术要——第11部分：胴体生产、评定及分割技术。目的在于确立云岭牛胴体生产、评定、分割以及分割肉包装等技术要求。DB53/T447-2022包含的十一部分内容均是符合生产实际需要，涵盖了生产环节中的品种、养DB53/T447.4—20221云岭牛第4部分：胚胎移植本文件规定了胚胎移植的要求、供体牛的选择与饲养管理、供体牛的超排及输精、胚胎回收、胚胎质量鉴定、胚胎的冷冻保存与解冻、胚胎移植、受体牛的妊娠诊断等技术要求。本文件适用于云岭牛的超数排卵及胚胎移植（MOET）的各个环节。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4143牛冷冻精液DB53/T247.3肉牛养殖综合标准第3部分：繁殖技术DB53/T447.3云岭牛第3部分：人工授精3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1供体牛donor提供卵子和胚胎的优秀繁殖母牛。3.2受体牛recipient接受胚胎（移植）的母牛。3.3同期发情synchronousestrus使用外源激素来调控一群母牛的发情进程，使之在预定的时间内集中发情和排卵。3.4超数排卵（简称超排）superovulation在母牛发情周期的适当时间，使用外源性腺激素，诱导更多的卵泡正常发育，并多排卵。3.5胚胎冷冻保存embryocryopreservation按胚胎冷冻的原理和方法，对胚胎进行冷冻，并在液氮中长期保存。3.6胚胎移植embryotransfer将受精卵（胚胎）移植到受体母牛子宫角内。4胚胎移植的要求DB53/T447.4—20222供体牛和受体牛应为同一属种，供体牛和受体牛的发情时间相差不应超过24h，且从供体牛输卵管内收集到的胚胎应移植到受体牛的输卵管内，从供体牛子宫角内收集到的胚胎应移植到受体牛的子宫角5供体牛的选择与饲养管理5.1供体牛的选择符合云岭牛的典型特征，系谱清楚，遗传性能稳定，种用价值高，健康、体质健壮、膘情中等。性周期正常，生殖机能好。年龄14月龄到10岁,体重280kg～600kg。经产母牛产后60天以上，生殖机能恢复正常。5.2供体牛的饲养管理保持环境卫生、避免各种应激、分群饲养、专人管理、加强蛋白营养、注重补充青绿饲料、优质青干草、维生素和微量元素，保持营养平衡。6供体牛的超排及输精6.1超排处理6.1.1超排激素FSH（促卵泡素）、PG（前列腺素及其类似物）、CIDR®或CUE-MATETM（孕酮阴道栓）、GnRH（促性腺激素释放激素）、LH（促黄体生成素）等。6.1.2超排方法6.1.2.1FSH+PG法在发情周期的任一天对供体牛用一次PG法进行同期发情处理或选择自然发情的供体牛在发情周期的第10天～11天开始采用递减法每天早、晚各注射一次FSH，连续注射4天，在注射FSH的第3天注射PG。6.1.2.2CIDR®或CUE-MATETM+FSH+PG法以供体牛发情当日为0天，在第（6±1）天置入CIDR®或CUE-MATETM，第10天～11天开始注射FSH，连续注射4天，第12天～13天（FSH注射第3天）注射PG，同时取出CIDR®或CUE-MATETM。6.1.2.3FSH和PG用量6.1.2.1和6.1.2.2中FSH和PG用量可采用下列任意一种组合：——日本产FSH24mg～36mg+美国产PG30mg～35mg或国产氯前列烯醇0.6mg～0.8mg；——加拿大产FSH320mg～380mg+美国产PG30mg～35mg或国产氯前列烯醇0.6mg～0.8mg；——国产FSH10mg～12mg+国产氯前列烯醇0.6mg～0.8mg。6.2发情鉴定在注射PG24h后进行发情鉴定，发情鉴定方法按DB53/T247.3的规定执行。6.3冻精质量检查DB53/T447.4—20223应符合GB4143的规定。6.4输精注射PG后48h采用直肠把握输精法进行第一次输精，间隔12h进行第二次输精，输精方法按DB53/T447.3的规定执行。在第一次输精时注射GnRH或其类似物50μg～100μg或在第一次输精时注射LH2000IU～3000IU。7胚胎回收（冲胚）7.1冲胚时间供体牛以超排发情后第一次输精当日为0天，在第（7±0.5）天，用非手术法回收胚胎。7.2冲胚前的准备7.2.1主要器材冲胚管及内芯、子宫颈扩张棒、子宫颈黏液吸除器、过滤式集卵（胚）杯、Y字型三通硅胶管，以及50mL注射器、20mL注射器、10mL注射器、5mL注射器、培养皿、量筒、毛剪、镊子等。7.2.2药剂新洁尔灭、2%利多卡因、0.9%生理盐水、酒精、青霉素、链霉素等。7.2.3冲胚液的配制基液：杜氏磷酸缓冲液（PBS），配方见附录A。也可用进口PBS粉配制。冲胚液：含1%FCS（胎犊血清）或CS（犊牛血清）加含抗生素的PBS液。也可直接用进口的冲胚液。7.2.4冲胚准备按以下步骤进行冲胚准备：a)将供体牛在保定架内站立保定好，用2%利多卡因或普鲁卡因3mL～5mL进行硬膜外腔麻醉；b)将牛尾固定，清除直肠中的粪便；c)母牛阴部先用清水清洗，再用新洁尔灭溶液清洗，然后用灭菌卫生纸擦干，最后用酒精棉球消毒d)用子宫颈扩张棒扩张子宫颈口，再用黏液吸除器清除子宫颈黏液；e)检查冲胚管气囊是否完好，内芯用冲胚液湿润后插入冲胚管并固定好；f)将冲胚管缓慢插入到子宫角前端；g)用吸满20mL空气的注射器向气囊内注入空气，青年牛10mL～15mL，经产牛15mL～18mL；h)确定气囊是否在子宫角内理想的位置，固定冲胚管；i)抽出内芯，连接冲胚管与Y字型三通管；7.2.5冲胚按以下步骤冲胚：a)关闭三通管输出管开关，用50mL注射器或自动灌流仪每次吸取15mL～30mL冲胚液从输入管注入子宫角；DB53/T447.4—20224b)关闭输入管开关，用直肠中的手将子宫角上扬并进行适度按摩，打开输出管开关，使回收液从输出管流到集收杯中；c)每侧子宫角冲洗6次～10次，每侧子宫角用250mL～300mL冲胚液，根据供体牛子宫角的大小，先少后多，逐渐增量；d)一侧子宫冲胚完毕后，用注射器筒接到冲胚管的注气口将气囊中的气体放出，抽出冲胚管；e)用同样的方法对另一侧子宫角冲胚；f)两侧子宫角冲胚完成后，冲胚管抽回至子宫体，灌注抗菌素（青霉素200万单位＋链霉素100万单位溶液20mL～50mL）或其它预防子宫炎的药物，同时，肌肉注射PG（氯前列烯醇0.4mg～0.6mg）；g)将回收液送回实验室或检胚室，用集卵漏斗过滤，保留10mL左右的液体，倒入培养皿中，供镜检。8胚胎质量鉴定8.1检胚8.1.1在实验室（检胚室）内20℃~25℃常温下，将盛有回收液的培养皿或集卵杯置于实体显微镜下按图1所示顺序检胚，重复3遍～4遍。图1检胚顺序8.1.2检出的胚胎及时移放到盛有含20%犊牛血清（CS）的PBS保存液或TCM-199培养液的培养皿中（同一头供体牛的胚胎放入同一培养皿中），并做好标记。8.1.3胚胎用PBS保存液或TCM-199培养液清洗3次～5次，然后进行胚胎质量鉴定。8.2胚胎的质量鉴定8.2.1形态学方法8.2.1.1观察在40倍～80倍的实体显微镜或倒置显微镜下观察所回收的胚胎受精与否、发育状态、形态轮廓、色泽、卵裂球的大小、均匀度、细胞密度、透明带间隔、变性程度以及胚胎本身的发育阶段是否与胚胎实际日龄相一致等。8.2.1.2发育期划分DB53/T447.4—20225供体牛超排发情后第（7±1）天的胚胎发育期划分为以下6个时期：——早期桑椹胚（EarlyMorula，EM），卵裂球隐约可见，内细胞团基本占满卵周间隙；——致密桑椹胚（CompactMorula，CM），卵裂球进一步分裂变小，看不清卵裂球的界线，内细胞团致密收缩，占卵周间隙的60%～70%；——早期囊胚（EarlyBlastocyst，EB），出现透亮的囊胚腔，开始分为发暗的内细胞团和明亮的滋养层，但两层界线尚不明晰，细胞团占卵周间隙的70%～80%；——囊胚（Blastocyst，BL），囊胚腔增大明显，内细胞团和滋养层细胞界线清晰，细胞充满卵周——扩张囊胚（ExpandedBlastocyst，Exp），囊胚腔充分扩张，体积增至原来的1.2～1.5倍，透明带变薄，约为原厚度的1/3；——孵化囊胚（HatchedBlastocyst，Hed或HB），囊胚腔扩张到一定程度，透明带破裂，胚胎细胞团脱出透明带。8.2.1.3发育阶段供体牛排卵受精后不同时间的胚胎发育阶段见表1。表1供体牛排卵受精后不同时间的胚胎发育阶段胞胚胚胚胚8.2.1.4胚胎质量等级胚胎质量划分为下列四个等级：——1级，即优质胚，胚胎发育阶段正常、形态完整、轮廓清晰、色泽正常、几乎无水泡样卵裂球，没有变性细胞；——2级，即良质胚，发育阶段正常、形态基本正常、完整、轮廓清楚，但有一部分突出细胞可见，变性部分占10%以下；——3级，即普通胚，发育阶段正常、突出的细胞或较明显不均匀，变性部分占10%～30%；——4级，即不良胚，细胞不均匀、变性细胞明显，变性部分占30%～50%；发育缓慢和未受精卵。8.2.1.5胚胎使用1级～3级为正常胚胎，其中1级～2级胚胎可供鲜胚移植和冻胚保存。3级胚胎需经培养，从形态判断存活力后决定是否移植或冷冻或舍弃。4级胚不能使用。8.2.2体外培养法将被鉴定的胚胎用TCM-199＋F1CS或TCM-199＋FCS+β-ME(β-巯基乙醇）培养液，在5%CO2、95%空气、38.5℃、饱和湿度的培养箱中培养24h～48h，判断胚胎是否存活和活力。桑椹胚、早期囊胚以培养后的扩张囊胚率和孵化胚率来衡量胚胎的质量，扩张囊胚率和孵化率高表明胚胎质量好，形态正常的胚胎经培养后的孵化率应在70%以上。DB53/T447.4—202269胚胎的冷冻保存及解冻9.1胚胎的冷冻保存9.1.1仪器、器材实体显微镜、胚胎冷冻仪、液氮罐、液氮、细管、封口仪、吸胚管、0.22µm过滤器、培养皿、记号笔等。9.1.2保存液与冷冻液含有20%犊牛血清(CS)的PBS液为保存液。用8%乙二醇（EG0.1mol/L海藻糖（Tre.m-PBS+20%CS,用0.22µm滤器过滤灭菌分装为冷冻液。9.1.3胚胎装管胚胎先在保存液微滴中清洗4次，然后在冷冻液微滴中清洗4次。将胚胎吸入0.25mL细管内，用封口机封口、分类、标记，在4℃的冰箱内放置平衡10min～15min后放入冷冻仪。9.1.4胚胎冷冻保存胚胎冷冻仪温度降至-7℃,在-7℃保持2min后进行人工植冰，继续保持至10min，以0.3℃/min的速率降温至-30℃,在-30℃保持10min后，直接放入盛有液氮的液氮罐中保存，并定期检查和加液氮。9.2胚胎解冻从液氮中取出装有胚胎的细管，空气浴6s后在32℃~35℃解冻杯中水浴10s。10胚胎移植10.1受体牛的选择供同期发情处理的受体牛必须是确认空怀的。受体牛的选择参见附录B。10.2受体牛的饲养管理10.2.1在移植前7周开始补饲，加强饲养管理。10.2.2在移植前5周，注射维生A、D、E，补充微量元素，如硒等。10.2.3保持受体牛饲养环境的相对稳定与卫生，避免应激。10.2.4妊娠受体牛在饲喂全价日粮饲料基础上，补充盐、矿物质和维生素，加强舍外运动。10.3受体牛的同期发情处理10.3.1PGF2α法10.3.1.1一次PGF2α法对受体牛在发情周期的任意一天（除发情当日）直肠检查，只对卵巢上有黄体的一次注射PGF2α或类似物（Lutalyse®或氯前列烯醇），在注射PG后24h～96h观察发情。10.3.1.2两次PGF2α法DB53/T447.4—20227在受体牛发情周期的任意一天（除发情当日外），不论卵巢上有无黄体，先注射PGF2α或类似物一次(Lutalyse®或氯前列烯醇)，间隔11天～14天再用等量注射一次，在第二次注射PG后24h～96h内观察发情。10.3.2CIDR®（CUE-MATETMPGF2α法在受体牛发情周期的任一天（除发情当日），无论卵巢上有无黄体，将CIDR®（CUE-MATETM）孕酮阴道栓置入阴道内，以置栓之日为0天，在第7天一次性肌注PGF2α类似物（氯前列烯醇），第9天取出CIDR®（CUE-MATETM或在第8天撤栓的同时注射氯前列烯醇，第10天～12天（取栓后72h内）或第9天~10天观察发情。10.3.3EB+CIDR®（CUE-MATETMPGF2α法在受体牛发情周期的任一天，将CIDR®（CUE-MATETM）置入阴道内，同时肌肉注射EB（EstradiolBenzoate，EB，苯甲酸雌二醇)。第8天撤栓,同时肌注氯前列烯醇；第9天再次注射EB，不观察发情，在第16天～17天检查黄体状况。10.3.4GnRH+PGF2α法对受体牛不作黄体检查，第1天注射GnRH或类似物（Fertagy）或促排3号（LHRH-A3），第7天肌注PGF2α（Lutalyse®或氯前列烯醇），第9天再次肌注同等量的GnRH。不观察发情，在第16天检查黄体状况。10.4受体牛的发情鉴定同供体牛发情鉴定。10.5受体牛的胚胎移植10.5.1器具、药剂解冻杯、移植枪、移植枪塑料外套和保护膜、毛剪、2%利多卡因、酒精棉球、5mL一次性注射器、无菌纸、生理盐水棉球。10.5.2移植时间根据发情记录和移植前黄体检查结果，判定供体（胚龄）与受体牛的发情日之差，最终确定移植时间。受体与供体发情时间宜同步，如不能同步，二者发情时间差应小于24h，特别是移植体内受精鲜胚时（见表2）。表2受体牛胚胎移植时间0早晚10.5.3黄体判定DB53/T447.4—20228胚胎移植前一天或移植当天，对发情正常的受体牛进行直肠检查，根据黄体的大小、弹性、突出状况确定是否合格，只对黄体合格（A、B级）而且黄体所处的时期与胚龄一致的受体牛移植。