《刺参“鲁海1号”种质》

ICS

备案号：

山东水产学会团体标准

T/SSF0010-2021

刺参“鲁海1号”种质

Seacucumber“LuhaiNo.1”—germplasm

（送审稿）

××××-××-××发布××××-××-××实施

山东水产学会发布

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前言

本文件按照GB/T1.1－2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由山东水产学会提出、组织实施并归口。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件起草单位：山东省海洋科学研究院、威海洋德海洋生物科技有限公司、山东黄河三角洲海洋

科技有限公司、山东省渔业发展和资源养护总站、威海市文登区海洋发展事务中心。

本文件主要起草人：李成林、胡炜、韩莎、赵斌、姚琳琳、吴鹏、徐涛、陈晓红、王琦、刘兆存。

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1范围

本文件规定了刺参Apostichopusjaponicus（Selenka1867）“鲁海1号”新品种的名称与

分类、主要形态构造特征、生长与繁殖、细胞遗传学特性及检测方法等的通用要求，描述了

对应的证实方法。

本文件适用于刺参Apostichopusjaponicus（Selenka1867）“鲁海1号”新品种的种质检

测和鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期

的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括

所有的修改单）适用于本文件。

GB/T18654.1养殖鱼类种质检验第1部分

GB/T18654.2养殖鱼类种质检验第2部分:

GB/T18654.12养殖鱼类种质检验第12部分

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

疣足palillae

位于背面或侧面，呈锥形肉刺状，与水管系统相通。

3.2

管足podia

棘皮动物特有组织器官，末端有吸盘，吸盘由钙质骨板所支持，内部与水管系统相通。

3.3

步带区ambulacralzone

体壁上有管足分布的区域。

3.4

品种variety

经人工选育成的、遗传性状稳定的、具有不同于同种内其他群体的优良经济性状的水生

动植物。

4学名与分类

4.1刺参“鲁海1号”

为人工选育新品种，属刺参（ApostichopusjaponicusSelenka）。

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4.2分类地位

棘皮动物门（Echinodermata），游走亚门（Eleutherozoa），海参纲（Holothuroidea），

楯手目（Aspidochirota），刺参科（Stichopodidae），仿刺参属（Apostichopus）

5主要形态与构造特征

5.1外部形态特征

外部形态特征应符合表1。

表1刺参“鲁海1号”形态特征

体形体略呈扁平状圆筒形，两端较细，中间较粗，体横断面接近四角形

体色呈黄褐色、绿褐色

体长成参体长20cm～40cm

口和肛门口在前端，偏于腹部，肛门在后端，偏于背面

疣足背、侧面有4列（或6列）纵向排列疣足，大小不一、排列不规则

步带区体壁分为5个步带区和5个间步带区，彼此相间排列

腹面腹面平坦，管足密集，排列成不规则3条纵带

刺参“鲁海1号”外部形态见图1。

图1刺参“鲁海1号”外部形态

5.2内部构造

5.2.1体壁

由角质层、表皮、结缔组织和无数小型骨片组成。

5.2.2肌肉层

由环肌和纵肌组成，外层为环肌，内层为纵肌，纵肌5束。

5.2.3消化系统

由口、咽、食道、胃、肠和排泄腔组成。

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5.2.4循环系统

由血管、血窦和围血系统组成，血液透明呈淡褐色。

5.2.5石灰环

咽部周围有由5个辐片和5个间辐片构成的石灰环。

5.2.6波里氏囊

呈圆形或卵圆形。

5.2.7呼吸树

在体内具有一从泄殖腔壁延伸出的呼吸树，分出左右两个分枝的盲囊，外观呈树枝状。

6生长与繁殖

6.1生长

生长速度快，单位产量高。在相同养殖条件下，与未经选育的刺参相比，24月龄刺参“鲁

海1号”体重平均提高24.8%，养殖成活率平均提高23.5%。

6.2繁殖

6.2.1性成熟年龄

雌雄异体，雌性和雄性个体一般在2龄～3龄左右性成熟。

6.2.2性腺发育周期

生殖周期分为休止期、增殖期、生长期、成熟期和排放期5个时期。

6.2.3产卵量

成熟雌性个体可排卵1次～3次，产卵量一般在300～600万粒，大个体可达1000万粒。

7细胞遗传学特性

7.1染色体数

2n=46。

7.2分子遗传学特征

7.2.1微卫星位点

应用5对微卫星引物Ajssr01、Ajssr02、Ajssr03、Ajssr04和Ajssr05对刺参“鲁海1

号”基因组DNA进行扩增，PCR扩增多态图谱见图2～图6。

共检测到23个等位基因，每个微卫星座位检测到的等位基因数为3个～5个。群体的观测

杂合度平均值为0.4727，多态信息含量为0.54124。

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图2微卫星位点Ajssr01扩增图谱（多态）

图3微卫星位点Ajssr02扩增图谱（多态）

图4微卫星位点Ajssr03扩增图谱（多态）

图5微卫星位点Ajssr04扩增图谱（多态）

图6微卫星位点Ajssr05扩增图谱（多态）

8检测方法

8.1性状测定

按GB/T18654.1、GB/T18654.2的规定执行。

8.2染色体检测

按GB/T18654.12的规定执行。

9结果判定

按GB/T18654.1的规定执行。

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山东水产学会团体标准

《刺参“鲁海1号”种质》

（送审稿）

编制说明

山东省海洋科学研究院

二〇二一年十一月

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山东水产学会团体标准

《刺参“鲁海1号”种质》编制说明

一、制定本标准的项目背景

上世纪90年代中期开始，我国的刺参市场消费需求空间不断拓展，特别是2003年“非

典”事件之后，产业发展速度和生产规模均达到前所未有的水平，现已成为国内海水养殖

的主导产业之一。山东省作为我国刺参的重要原产地和第一养殖大省，近年来充分发挥海

洋科技强省优势，开展了一系列刺参生产重大关键技术的研发与成果转化推广，形成了从

育种、养殖、加工到市场流通较为完善的全产业链体系，生产技术水平居全国首位。2020

年产参苗332.9亿头（占全国60.5%），增养殖规模119.5万亩（占全国32.8%，占全省海

水养殖面积的13.73%），年产商品参9.89万吨（占全国50.3%，占全省海水养殖产量的

1.92%），养殖年产值约160亿元，用仅占全省海水养殖2%的产量创造了约17%的产值。

种质是养殖产业能否健康持续发展的根本，随着刺参增养殖产业的不断发展，人们对优质

健康刺参苗种的需求日益强烈。

2021年4月21日，农业农村部发布“十四五”期间将通过实施“五大行动”来推进

水产绿色健康养殖，明确要求开展水产种质资源基本情况普查，摸清原种、地方品系、新

品种和引进种的种类、群体数量、区域分布和保护利用等情况，持续推进水产原良种生产

体系建设。刺参“鲁海1号”国审新品种(品种登记号：GS-01-011-2018)是山东省海洋科

学研究院（原山东省海洋生物研究院）李成林研究团队以2003年-2004年从我国烟台、威

海、青岛、大连、日照野生刺参中收集挑选的2700头个体为基础群体，以体重为目标性

状，采用群体选育技术，经连续4代选育而成，在相同养殖条件下，与未经选育的刺参相

比，具有明显的生长速度快、抗逆性强等优势生产性状，24月龄刺参“鲁海1号”体重平

均提高24.8%，养殖成活率平均提高23.5%，目前在全省核心示范规模已超过50万m3，有

效提高了我省刺参良种覆盖率10%以上。

为加强新品种的保护和利用，亟需明确该新品种的生物学特性、生长与繁殖及其遗传

学特性与检测方法等技术内容，故制定本标准。本标准制定由刺参“鲁海1号”第一育种

完成单位提出，项目技术团队具有丰富的刺参一线生产经验和扎实的理论研究基础，目前

承担着国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”重点专项、山东省刺参产业创新团队建设、

山东省农业良种工程等多项刺参育种相关课题，完全可保证标准的科学性、适用性和可操

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作性。

二、制定本标准的工作简况

1.任务来源

根据《国务院关于印发深化标准化工作改革方案的通知》（国发【2015】13号）、山东

省政府《关于开展国家标准化综合改革试点工作的实施方案》、《山东水产学会团体标准管

理办法（试行）》的要求和山东水产学会《关于开展山东水产学会团体标准立项申请的通

知》，标准起草小组提出申请，经审查、专家评议，于2021年8月16日获批立项。本标

准制定任务由山东水产学会提出、组织实施并归口，山东省海洋科学研究院，威海洋德海

洋生物科技有限公司，山东黄河三角洲海洋科技有限公司，山东省渔业发展和资源养护总

站承担起草制定工作。

2.制定单位

标准第一制定单位为山东省海洋科学研究院（原山东省海洋生物研究院），是我国最

早进行刺参育苗及养殖技术研究的单位，现有省级刺参良种场及苗种繁育、养殖生产基地，

相关设施及大型分析试验仪器配套齐全，可方便地进行不同样品间的比对。目前，已完成

制定《无公害食品刺参》、《栉孔扇贝苗种》、《刺参工厂化养殖技术规程》、《刺参养殖池

塘建设规范》、《刺参生态苗种培育技术规范》、《刺参池塘中间培育技术规范》、《刺参浅海

网箱养殖技术规范》、《刺参-凡纳滨对虾轮养技术规范》、《刺参筏式笼养技术规范》等近

40项国家、行业及地方标准，熟悉相关标准的技术内容，了解标准制定的工作程序，为标

准的制定提供了良好的技术基础。

此外，标准制定团队拥有我省刺参产业技术体系创新团队首席专家兼育种岗位专家、

增养殖岗位专家等多名产业相关高层次人才，学科带头人同时兼任山东省渔业协会特聘专

家、“胶东刺参”质量保障联盟特聘专家、省水产专家顾问团专家成员等多个学术团体的

重要职务，对全省刺参产业尤其是养殖生产现状与需求有着深入了解，具备丰富的实践经

验，相关科研成果已获国家及省部级各类奖项近30项。因此，本单位及标准起草人员完

全能够胜任本标准的制定工作。

在标准制定过程中，为规范项目组织管理，依托单位加强起草小组成员间协同配合，

提高各项工作绩效，围绕标准建设的任务要求和标准制定项目的特色，制定了组织管理制

度，合理划分了责任任务，强化了协同配合，充分保证了各成员间的交流畅通与资源共享，

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对项目的顺利实施和按期完成也起到了很好的保障支撑作用。

3.协作单位

威海洋德海洋生物科技有限公司，位于威海市文登区泽库镇刘家村村东，占地60亩，

固定资产总值5000万，主要从事海参苗种的繁育和推广，公司年育苗量达5万斤以上，

年产值1000万，场内现拥有现有种质创制车间1栋，种质保存车间1栋，苗种繁育车间1

栋，工厂化育苗车间水体15000立方米，海水源热泵机组2台，淀淀池30亩，重力沙滤

塔2座，蓄水池1座，实验室、监控室、档案室、展示厅配备齐全。育苗室配套设施齐全、

先进，增氧、投饲、水质监测和渔业通远程鱼病诊断系统等设备齐全，运行良好。场内建

有养殖用水净化和废水处理设施设备，养殖废水达标排放。公司发展优势明显，一是养殖

资源相对丰富，区位优势比较明显。项目区水源充足，水质优良，无污染，汞、砷、酚、

铬及氰化物等五种有毒物质含量均低于国家规定标准。渔业用水的水源和水质有可靠保障。

二是科技创新进步，带动示范效果好。育苗场通过加强与国内多家水产科研院所的密切合

作，抓好先进水产养殖技术的研究和推广应用，不断增强自主创新能力和产业发展的科技

含量，加速科技成果向生产力的转化。育苗场还利用当地渔业科技入户工程，加强与市县

渔业技术专家交流学习，有力地促进了育苗场的养殖技术水平的提高。

山东黄河三角洲海洋科技有限公司，山东黄河三角洲海洋科技有限公司，成立于2015

年10月，注册资金1000万元，至今已完成投资11000余万元。公司位于东营市河口区新

户镇大义路北，马新河东侧，占地1500余亩，现有职工56人，其中高级职称2人、本科

以上学历6人，从事技术研发人员12人。公司现为山东省现代农业产业技术体系刺参、

贝类、虾蟹类等三个产业创新团队的示范基地，同时为中国科学院海洋研究所智能化对虾

养殖示范基地、山东省水产健康养殖示范场，2019年9月上榜东营市农业产业化重点龙头

企业。公司成立至今，始终秉承以科技创新驱动企业高质量发展的运营理念，先后邀请山

东省海洋生物研究院李成林研究员（山东省刺参创新团队首席专家）团队、中科院海洋研

究所王雷研究员团队、山东省海洋生物研究院郭文研究员（山东省贝类创新团队首席专家）

团队入驻全程服务，使公司的科技创新能力不断提高。

山东省渔业发展和资源养护总站，是2021年6月17日经山东省事业单位监督管理局

核准登记的事业单位，由原山东省渔业技术推广站、山东省水生生物资源养护管理中心合

并组建，主要承担渔业关键技术的引进、试验、示范、推广工作；承担水产养殖、渔业捕

捞生产、水生生物资源养护、休闲渔业等管理的技术支持工作；承担水生动植物病害的监

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测、预报和预防工作；承担渔业水域生态环境保护、养殖面源污染防控等技术性、事务性

工作。

威海市文登区海洋发展事务中心，原威海市文登区水产技术推广站。负责水生动植物

病害、疫情防治监测和渔业病害测报、水生动物疫病监测、防疫检疫工作；负责渔业健康

发展研究，促进远洋渔业管理健康发展；负责开展水生生物资源养护及休闲渔业、海洋牧

场发展的技术支持和服务工作；负责海域和海岛监测、海洋防灾减灾、海洋科学调查与勘

测工作等。

4.主要工作过程

1、成立标准制定小组，明确主要执笔人及任务分工。

2、收集刺参种质生物学特征、生长与繁殖、遗传学特性检测方法相关参考文献资料，

包括专著、国内外公开发布论文、科研成果，结合项目组的前期研究成果，参考国家、行

业、及其他省份地方标准，初步确定了标准需制定的技术内容，并起草了标准制定草案。

3、根据标准制定草案开展刺参种质相关特征、性状的检测工作，统计分析实验数据

结果，为标准的技术参数制定提供科学依据。

4、调研山东省威海、烟台、青岛、日照、东营等地沿海的刺参“鲁海1号”生产企

业，广泛征求并记录了生产企业对标准化工作的意见和建议，为标准内容的规定、技术参

数的制定提供了支持，并对标准草案进行修改完善。

5、组织科研、生产单位同行专家及相关人员共同开展调研活动，对刺参各关键技术

参数逐条进行了推敲与核实，形成征求意见稿，呈送有关科研、教学、推广、生产和管理

部门的专家广泛征求意见。

5.主要起草人及其工作

李成林：项目主持人，负责方案制定、调研、数据采集、标准起草和修改等工作；

胡炜：主要起草人，负责组织调研、试验和标准起草、修改等工作；

韩莎：主要起草人，参与开展试验研究、标准修改等工作；

赵斌：主要起草人，参与数据分析、标准起草、修改等工作；

姚琳琳：主要起草人，参与意见汇总、标准修改等工作；

吴鹏：主要起草人，参与意见汇总、标准修改等工作；

徐涛：主要起草人，参与意见汇总、标准修改等工作；

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陈晓红：主要起草人，参与意见汇总、标准修改等工作；

王琦：主要起草人，参与意见汇总、标准修改等工作；

刘兆存：主要起草人，参与意见汇总、标准修改等工作。

三、编制本标准的原则和依据

1、遵循有关方针、政策、法规和规章，按照GB/T1.1-2020标准化工作导则要求编写。

主要对刺参“鲁海1号”种质的生物学特征、生长与繁殖、遗传学特性检测方法等技术内

容进行规定。

2、本标准的制定，遵循国家有关方针、政策、法规和规章，严格执行强制性国家标

准，参考行业标准，充分考虑国际上通用标准。在格式上按照GB/T1.1-2020的规定进行

编写，编制说明按国家技术监督局“国家标准管理办法”第三章第十六条和《农业部国家

（行业）标准的计划编制、制定、和审查管理办法》第二章的基本要求编写。

3、标准的文字表达力求准确、简明、易懂，结构合理、层次分明、逻辑严谨。具有

可操作性，便于贯彻实施。标准中的术语、符号统一，与相关标准相协调。

4、广泛听取和征求从事刺参相关研究的专家和科研人员、刺参生产企业的意见，进

行广泛的调查研究和必要的试验验证工作，全面掌握目前生产实际情况。

5、对获得的资料和数据进行综合研究，使数据科学化，在充分考虑可操作性的同时，

做到经济合理。

6、密切结合我省情况，同时参照国家、行业标准，有利于规范刺参“鲁海1号”的

安全保护和高效利用，有利于推动提高刺参产业的良种覆盖率。

四、本标准主要内容说明

本标准适用于刺参“鲁海1号”新品种的种质检测和鉴定。本标准共包括八部分内容，

包括范围、规范性引用文件、名称与分类、主要形态构造特征、生长与繁殖、细胞遗传学

特征、检测方法、结果判定等。其中，标准部分制定的技术内容及确定依据具体如下：

1.染色体检测

1.1秋水仙素处理取刺参的原肠后期幼虫20个左右与过滤海水一起装入10ml的试管

中,加入秋水仙素溶液处理（秋水仙素处理最终浓度为0.08%），然后静置1个小时。

1.2柠檬酸钠低渗低渗用离心机经过离心，转速约为2400转/分，时间3分钟。将含

有秋水仙素的溶液取出，然后加入7％柠檬酸钠溶液低渗40min。

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1.3固定低渗后离心，轻轻移出上层柠檬酸钠溶液，随即加入甲醇固定1次后再加入

新鲜配制的卡诺氏固定液（甲醇:冰醋酸3:1）固定2次。

1.4滴片、染色取适量固定的胚胎，加入50%的冰醋酸振荡、打碎，迅速在50℃左右

的载玻片上进行滴片，然后自然干燥。用5%左右的吉姆萨染色液（磷酸缓冲液PH=6.8）

染色，染色40分钟后，用自来水洗掉多余的染液自然干燥后，用中性树脂封片镜检。显

微镜观察，统计染色体数目，进行显微摄影。同时在100×显微镜下，随机统计30个视野，

计算细胞的有丝分裂指数。

2.微卫星位点分析

按GB/T18654.12-2008的规定执行。

2.1DNA的提取

2.1.1取“鲁海1号”约100mg，用液氮研磨至粉末。

2.1.2加入裂解液600μL（2%CTAB、1.4MNaCl、0.1MTris-HCl、20mMEDTA-Na2、

0.2%β-羟基乙醇，pH=8.0），15μL20mg/mL的蛋白酶K，混合均匀。

2.1.360℃水浴锅中3～5h，期间每隔一阵缓慢晃动离心管。

2.1.4用氯仿:异戊醇=24:1抽提两次。

2.1.5用酚:氯仿:异戊醇=25:24:1抽提两次。

2.1.6加入等量异丙醇。

2.1.7用预冷的无水乙醇沉淀。

2.1.8吸出管内无水乙醇后，风干沉淀物质。

2.1.9用灭菌ddH2O溶解沉淀物质。

2.1.10通过1%琼脂糖电泳检测DNA是否降解。若电泳后的条带比较清晰并且带型单

一，则DNA的完整性较好，符合试验要求。若电泳的结果不好，则重新提取DNA，直至电

泳的结果符合要求。

2.1.11检测OD260/280以确定DNA的纯度。把DNA样品用分光光度计检测浓度，每

个样品测量三次，对三次测量求平均值作为最终结果，样品的浓度在180ng/ml-700ng/ml

之间。

2.1.12将各DNA样品浓度稀释到100ng/ml左右，用此浓度的DNA作为模板进行电泳

时电泳条带比较清晰，并且相对节省DNA溶液。-20℃中保存备用。

2.2微卫星位点引物序列

表1微卫星位点引物序列

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序列号引物序列

ACTAAAAAGTCATGGACACCC

Ajssr01AATCATAGCCCATTTTTCTGT

GCAGGAGGATCTAAAATACAT

Ajssr02ATCGAACACAACACACTTATC

CAAACGCATACAATTACACA

Ajssr03CGATCGATAGTCCTCAATC

GCTGAAGGCAAAAGGAATCT

Ajssr04GTAGCAAATGTGGCAAGGAT

GTTGTAGGGTTGTTTGAC

Ajssr05AACCACTGCCACAAATCG

2.3微卫星DNA的扩增

每个PCR反应体系总体积为10μL，含10ng“鲁海1号”基因组DNA，1μmol·L-1

引物，0.25mmol·L-1dNTPs，2.5mmol·L-1Mg2+，1×PCR反应Buffer，0.25UTaqDNA聚合

酶。PCR反应条件如下：首先循环前94℃预变性5min；94℃变性45s，按每对引物的退火

温度反应45s，72℃延伸45s，进行35个循环扩增；最后72℃延伸10min，4℃保存备用。

在PCR反应产物中加入7.5μL变性剂，离心混匀，将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳

（PAGE），使其基因分型。方法如下：

2.3.1玻璃板准备：提前准备聚丙烯酰胺凝胶电泳所使用的大小玻璃板，反复清洗，

直立晾干。将待用的边条与梳子洗净，并擦干水分。

2.3.2硅化：将大玻璃板放置在水平处，使用纸巾蘸取无水乙醇擦拭干净，吸取3mL

亲和硅烷涂抹在玻璃板上，涂抹均匀。静置30分钟。注：时间不宜过长。

2.3.3装配规定玻璃板：将干净的边条放在硅化好的大玻璃板两侧，小玻璃板盖在大

玻璃板上，使用四个夹子夹住两个玻璃板，注意要控制夹子的压力均匀，否则会造成凝胶

薄厚不均匀。

2.3.4PAGE胶的配制：将50mL6%的丙烯酰胺胶加入烧杯中，依次加入125μL过

硫酸铵溶液，64μL的TEMED溶液，搅拌混匀。

2.3.5灌胶：用洗耳球和移液管将配好的丙烯酰胺胶快速均匀的从小玻璃板的凹口处

灌入两玻璃板之间，灌胶过程中若有气泡出现，可用洗耳球轻轻敲打玻璃板，使气泡消失，

当胶充满整个玻璃板时，将梳子的平面一端从小玻璃板的凹口处插入大小玻璃板之间，注

意梳子的插入程度要平直，深度要适当，以便在凝固后得到一个点样的平面。灌好胶后，

静置1小时以上，等待胶凝固。

2.3.6凝胶装配到电泳槽：将凝固好胶的玻璃板拔掉梳子，清洗好上样口，放在电泳

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槽上固定好，电泳槽上下加适量的1×TBE，构成导电回路。设置电泳仪1500V，150mA，

150W预电泳10分钟。

2.3.7上样及电泳：预电泳后，使用注射器将点样口吹打干净，将梳子有齿一面插入

胶面，分隔出胶孔，将PCR扩增产物逐个快速加入点样孔中4.5μL。设置电泳仪1500V，

150mA，150W电泳90分钟。

2.3.8染色：将玻璃板从电泳槽卸下，用夹子将小玻璃板分离开，将附有聚丙烯酰胺

胶的大玻璃板放入避光的装有染色液的水槽中，胶面向上，染色7分钟。

2.3.9漂洗：用蒸馏水迅速冲洗染色后的带胶玻璃板，然后迅速转移到显色液中。

2.3.10显色：将胶板放在显色液中，胶面朝上，轻轻摇晃，直到条带出现，时间不

宜过久，否则会造成胶脱离玻璃板。

2.3.11漂洗和干燥：用自来水冲洗胶板，去除胶板表面的显色液，室温下晾干。电

泳完毕后，用硝酸银染色检测其多态性。

2.4微卫星位点主要遗传学参数的估算

多态性的评价采用30个仿刺参个体经过PCR扩增后用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。需

要计算的参数包括每个微卫星位点的观测杂合度（Observedheterozygosity‚Ho）和期

望杂合度（Expectedheterozygosity‚He）。具体计算方法如下：Ho为杂合子观察数与样

本含量之比；He＝1—∑Pi2‚式中Pi为该位点中第i个等位基因的频率。采用软件GENEPOP

和马尔可夫链法对微卫星位点是否符合哈迪-温博格平衡性（Hardy-Weinberg

equilibrium‚HWE）进行检测。

3.群体遗传多样性分析

进行群体线粒体DNA16SrRNA基因克隆与分析。分析比较刺参“鲁海1号”与未经

选育的不同地理群体刺参遗传差异。

3.1引物合成

合成两条16SrRNA上游引物和反向序列，使用之前短暂离心后加适量的超纯水溶解，

使其终浓度达10pM，分装备用。其序列为：

D16SAR：5’-CGCCTGTTTAACAAAAACAT（20bp）

D16SBR：5’-CCGGTCTGAACTCAGATCATG（21bp）

3.216SrRNA基因扩增

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以提取得DNA为模板，以正向引物D16SAR和反向引物D16SBR为引物，在25uL

反应体系内进行16SrRNA基因的PCR扩增。PCR纯化产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行

检测，Marker为DL2000，凝胶成像系统观察、照相。

引物D16SAR、D16SBR具有很高的特异性，青岛、烟台、日照、长岛以及刺参“鲁

海1号”目的DNA片断经PCR扩增后，均得到分子量大小为570bp左右的片断，电泳谱

代整齐清晰。

M12345

570bp

M：标准分子质量DL2000；1：空白阴性对照；2～5分别为：刺参“鲁海1号”、青岛、烟台、日照、长

岛DNA样品。

图1不同刺参群体16SrRNA基因扩增电泳图谱

序列经ClustalX对位排序以后，去掉引物序列，得573bp左右的片断，该片断的平均

碱基含量见下表。

表2目的片断16SrRNA基因的碱基组成

碱基组成（%）总和（bp）

测试样品TCAGA+T

青岛（Q）28.620.228.822.457.4573

烟台（Y）28.720.428.922.057.6573

日照（R）28.820.228.922.157.7573

长岛（C）28.820.328.722.257.5573

刺参“鲁海1号”28.920.228.922.057.8573

平均28.720.228.822.057.6573

刺参DNA16SrRNA的碱基T、C、A、G和A+T含量分别为：28.7%、20.2%、28.8%、

22.0%和57.6%，通过比较比较看到，不同产地刺参群体碱基组成接近，而且（A+T）含量

为57.6%，远高于（G+C）的含量42.2%。

9

XXXX—XXXX

对扩增的5个刺参群体的16SrRNA片断，用DNAMEN比对后选取右差异位点的一

段，结果表明，长岛和烟台个体的序列完全一致，而烟台和日照个体在第352个碱基处出

现基因转换（A→G），与青岛个体之间在第335个碱基处出现基因转换（A→T），与选育

个体分别在第331个碱基处和第341个碱基处发生（G→T）和（T→A）两处转换。

YATAAAGTTTTGGTTGGGGCAACCGTGGAGAAAAAGAATCCTCCAGTTAGTTAGGAAGAAA360

C360

RG360

QT360

LTA360

图2不同刺参群体16SrRNA序列结果比较图

3.3不同刺参群体内遗传多样性分析

对青岛、烟台、长岛、日照四个不同地域野生刺参群体以及刺参“鲁海1号”的线粒

体DNA16SrRNA基因进行了扩增和测序的结果显示：73个个体均得到573bp大小的片断，

没有发现缺失/插入的核苷酸位点。但烟台和日照个体在第352个碱基处出现基因转换

（A→G），与青岛个体之间在第335个碱基处出现基因转换（A→T），而与刺参“鲁海1

号”个体分别在第331个碱基处和第341个碱基处发生（G→T）和（T→A）两处转换，

该基因变异是否与其选育优势相关尚不清楚，有待今后继续开展研究对其选育优势机理进

一步阐明。

用DNAsp3.99软件对各个野生刺参群体和刺参“鲁海1号”的遗传多样性参数进行

计算。数据显示，在5个群体中，烟台和刺参“鲁海1号”单倍型（Nhap）最多,分布范围

较大。刺参“鲁海1号”的碱基多态位点（S）比例最高，遗传多样性较丰富。

表3不同刺参群体内遗传多样性分析

青岛烟台长岛日照刺参“鲁海1号”

（Q）（Y）（C）（R）

个体数1516141315

单倍型数Nhap57539

多态位点S34325

平均核苷酸差异数K1.0231.0341.0211.0041.041

核苷酸多样性指数Pi0.001210.001320.001190.001080.00136

由平均核苷酸差异数K和平均核苷酸多样性指数Pi这两个指标上由16SrRNA基因片

断核苷酸序列反映出来的各个刺参群体遗传多样性指数的绝对值水平并不高，范围分别为

10

XXXX—XXXX

1.004～1.041和0.00108～0.00136，刺参“鲁海1号”和烟台群体的遗传多样性较高，其

次为青岛和长岛群体，最低为日照群体。

用DNAsp3.99软件对各个野生刺参群体和刺参“鲁海1号”之间的遗传多样性参数

进行计算，结果见下表。

表4不同刺参群体间遗传多样性分析

青岛烟台长岛日照刺参“鲁海1号”

（Q）（Y）（C）（R）

青岛（Q）

烟台（Y）1.219

长岛（C）1.2121.186

日照（R）1.1451.1340.994

刺参“鲁海1号”1.2081.2231.2271.231

不同群体之间平均核苷酸差异数（