蛋白质酪氨酸磷酸酶1B与血管内皮素在卵巢癌中的表达及临床意义探究

蛋白质酪氨酸磷酸酶1B与血管内皮素在卵巢癌中的表达及临床意义探究一、引言1.1研究背景卵巢癌作为女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着女性的生命健康。在全球范围内，其发病率在女性生殖系统恶性肿瘤中位居第三位，占所有女性恶性肿瘤的2.5%-5%。在我国，卵巢癌的高发年龄集中在40-60岁，不同地区和种族之间的发病率存在一定差异。更为严峻的是，卵巢癌的死亡率高居妇科恶性肿瘤之首。据2015年国家癌症中心统计数据，我国每年新发卵巢癌52100例，死亡约22500例。卵巢癌之所以死亡率高，很大程度上归因于其发病位置隐匿，早期发病时往往没有明显症状，故而被称为“沉默杀手”。临床数据显示，约70%的患者在确诊时已处于临床晚期，70%的病人在3年内肿瘤会复发，70%的患者活不到5年，患者五年生存率全球统计数据仅为29%。蛋白质酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）属于PTP基因家族成员，人类PTP1B由PTPN1基因编码，定位于20q13.1-q13.2，基因全长约74kb，共10个外显子，其cDNA全长3318bp，编码435个氨基酸的蛋白质，分子量约为49,666Da。PTP1B在体内广泛表达，其底物蛋白涵盖胰岛素受体（IR）、表皮生长因子受体（EGFR）、血小板衍生生长因子（PDGFR）等多种受体型PTK（RTK）。研究证实，PTP1B可通过特异性去除PTK酪氨酸残基上的磷酸基团，改变其磷酸化状态，负调控多种PTK信号传导通路，进而影响细胞的重要生理功能。在肿瘤领域，已有研究指出PTP1B可作为实体肿瘤的潜在治疗靶点，PTP1B的整体缺失能够减弱小鼠乳腺肿瘤的发展。然而，PTP1B在卵巢癌中的表达情况及其具体作用机制，仍有待深入探究。血管内皮素（ET）是一类具有强大血管收缩和促细胞增殖作用的生物活性肽。在正常生理状态下，ET参与维持血管张力、调节血压以及细胞的生长和分化等过程。但在病理状态下，ET的异常表达与多种疾病的发生发展相关。在肿瘤方面，ET可能通过促进肿瘤血管生成、刺激肿瘤细胞增殖和迁移等机制，在肿瘤的演进中发挥作用。在卵巢癌中，ET的表达变化及其与卵巢癌生物学行为的关联，同样需要进一步的研究来明确。鉴于卵巢癌的高发病率、高死亡率以及PTP1B和ET在细胞生理和病理过程中的重要作用，深入研究PTP1B及ET在卵巢癌中的表达，对于揭示卵巢癌的发病机制、寻找有效的诊断标志物和治疗靶点具有重要意义。1.2研究目的与意义本研究旨在通过一系列实验和分析，深入探究蛋白质酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）及血管内皮素（ET）在卵巢癌组织中的表达情况。明确二者的表达水平与卵巢癌患者临床病理特征，如肿瘤分期、病理类型、淋巴结转移等之间的关联。进一步探讨PTP1B和ET在卵巢癌发生发展过程中是否存在协同作用及其潜在机制。卵巢癌作为严重威胁女性生命健康的恶性肿瘤，其高死亡率和早期诊断困难的现状迫切需要我们寻找新的诊断标志物和治疗靶点。PTP1B和ET在细胞生理和病理过程中具有重要作用，研究它们在卵巢癌中的表达及作用机制，有助于我们更深入地理解卵巢癌的发病机制，为卵巢癌的早期诊断、精准治疗以及预后判断提供坚实的理论依据，有望为卵巢癌患者带来更好的治疗效果和生存质量。二、蛋白质酪氨酸磷酸酶1B与血管内皮素概述2.1蛋白质酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）2.1.1PTP1B的结构与功能蛋白质酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）是蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTPs）家族中的重要成员，在细胞的生理活动中扮演着关键角色。从结构上看，在人体中，PTP1B由非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶1（PTPN1）基因编码，由10个外显子组成，定位于人类20号染色体q13.1位点。PTP1B蛋白首次从人类胎盘蛋白提取物中分离出来，分子量约为50000，由435个氨基酸组成。其N-末端为催化结构域，这个结构域是PTP1B发挥功能的核心区域，在活性位点内含有至关重要的半胱氨酸氨基酸，它就如同精密仪器中的关键部件，参与去除PTP1B底物上的磷酸酪氨酸残基，对整个酶促反应的进行起着决定性作用。催化结构域由两个富含脯氨酸的基序环绕，这些基序如同“适配器”，通过与含有SH3结构域的蛋白质结合，为PTP1B与其他蛋白的相互作用搭建了桥梁，拓展了其在细胞内的功能网络。C-末端疏水区则像是一个“锚”，将PTP1B稳定地锚定在内质网（ER）的细胞质面上，确保其在细胞内的准确定位，为其后续发挥功能提供了空间基础。在细胞信号传导方面，PTP1B是一位不可或缺的“信号调节者”。细胞内的信号传导通路如同一张复杂而有序的“信息高速公路网”，蛋白质酪氨酸激酶（PTKs）和PTPs共同维持着酪氨酸蛋白磷酸化的动态平衡，精准地调控着细胞的生长、分化、代谢、基因转录和免疫应答等重要过程。PTP1B在其中扮演着负调节因子的角色，以胰岛素信号转导为例，胰岛素与胰岛素受体（IR）结合后，IR催化结构域发生自磷酸化，进而引发一系列下游信号传导，促进细胞对葡萄糖的摄取和利用，维持血糖的稳定。而PTP1B能够特异性地使磷酸化的IR和胰岛素受体底物1（IRS1）去磷酸化，这就好比在“信息高速公路”上设置了“路障”，阻断了胰岛素信号的传递，导致IR失活，细胞对葡萄糖的摄取和糖原合成受到抑制，最终引起胰岛素抵抗。这一过程充分展示了PTP1B在胰岛素信号转导中的精细调节作用，也凸显了其在维持细胞代谢稳态中的重要地位。在代谢调节领域，PTP1B同样发挥着关键作用。它参与了能量代谢的多个环节，对脂肪代谢和糖代谢的调控尤为显著。在脂肪细胞中，PTP1B通过调节相关信号通路，影响脂肪的合成与分解。研究发现，PTP1B基因敲除的小鼠，其脂肪组织中的脂肪分解增加，能量消耗也相应提高，表明PTP1B在脂肪代谢中起到了抑制脂肪分解、促进脂肪储存的作用。在肝脏中，PTP1B对糖异生和糖原合成也有着重要影响。它可以通过调节相关酶的活性和信号通路，控制肝脏中葡萄糖的生成和储存，从而维持血糖水平的稳定。当PTP1B功能异常时，可能会导致糖代谢紊乱，增加患糖尿病等代谢性疾病的风险。这些研究结果揭示了PTP1B在代谢调节中的重要作用，也为相关代谢性疾病的治疗提供了潜在的靶点。PTP1B还参与细胞的生长、分化、凋亡、细胞间黏附、细胞外基质附着和侵袭等多种细胞过程。在细胞生长和增殖过程中，PTP1B通过调节相关信号通路，影响细胞周期的进程。例如，它可以通过调节Akt和ERK1/2等信号通路，控制细胞从G1期进入S期，从而影响细胞的增殖速度。在细胞分化过程中，PTP1B也发挥着重要作用。研究表明，在胚胎发育初期干细胞分化过程中，PTP1B活跃的地方，干细胞将发育为内脏器官，活性低的地方，干细胞将发育为神经细胞，这表明PTP1B在干细胞分化方向的决定中起到了关键作用。在细胞凋亡方面，PTP1B可以通过调节相关凋亡信号通路，影响细胞的存活与死亡。当细胞受到外界刺激或内部信号改变时，PTP1B可以通过调节Bcl-2家族蛋白等凋亡相关蛋白的活性，决定细胞是否进入凋亡程序。在细胞间黏附和细胞外基质附着方面，PTP1B可以通过调节细胞表面黏附分子的表达和活性，影响细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的相互作用，从而影响细胞的迁移和侵袭能力。在肿瘤细胞中，PTP1B的异常表达往往会导致细胞间黏附能力下降，细胞更容易从原发部位脱落，进而发生侵袭和转移。2.1.2PTP1B与肿瘤的关系PTP1B与肿瘤的关系错综复杂，近年来受到了广泛的关注。越来越多的研究表明，PTP1B在多种肿瘤的发生发展过程中扮演着重要角色，但其作用机制在不同肿瘤中存在差异，表现出了“两面性”。在部分肿瘤中，PTP1B呈现出促癌基因的特性，宛如肿瘤细胞的“帮凶”，加速肿瘤的恶化进程。以乳腺癌为例，大量研究数据显示，PTP1B在乳腺癌组织中的表达水平显著高于正常乳腺组织。当PTP1B在乳腺癌细胞中高表达时，它能够通过多种途径促进肿瘤细胞的增殖。一方面，PTP1B可以使表皮生长因子受体（EGFR）去磷酸化，激活下游的Ras-Raf-MEK-ERK信号通路，这一信号通路就像肿瘤细胞增殖的“加速器”，促进细胞的增殖和分裂。另一方面，PTP1B还可以调节PI3K/Akt信号通路，抑制细胞凋亡，增强肿瘤细胞的存活能力。此外，PTP1B还与乳腺癌细胞的侵袭和转移密切相关。它可以通过调节细胞骨架的重组和细胞外基质的降解，增强乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力，使得肿瘤细胞更容易突破组织屏障，向周围组织和远处器官转移。在胃癌中，PTP1B同样表现出促癌作用。临床研究发现，PTP1B在胃癌组织和细胞中均过度表达，并且其表达与胃癌的TNM分期密切相关。高表达的PTP1B能够促进胃癌细胞的增殖和肿瘤的发展，其作用机制可能与改变Akt、Erk1/2、FAK蛋白的磷酸化水平和Src活性有关。通过调节这些信号分子的活性，PTP1B影响了胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡等生物学行为，从而在胃癌的发生发展中发挥重要作用。然而，在另一些肿瘤中，PTP1B却展现出了抑癌基因的特性，犹如肿瘤细胞的“克星”，对肿瘤的发展起到抑制作用。在白血病中，有研究表明PTP1B可以通过负调节相关信号通路，抑制白血病细胞的增殖和存活。具体来说，PTP1B可以使某些致癌信号通路中的关键分子去磷酸化，阻断信号的传递，从而抑制白血病细胞的恶性增殖。此外，PTP1B还可以诱导白血病细胞的凋亡，通过激活凋亡相关信号通路，促使白血病细胞走向死亡，从而发挥其抑癌作用。在卵巢癌中，PTP1B的作用机制尚未完全明确，但已有研究提示其可能参与了卵巢癌的发生发展过程。相关研究采用RNA干扰技术降低卵巢癌细胞中PTP1B的表达，发现PTP1B的降低显著抑制了卵巢癌细胞的增殖能力。进一步的实验结果显示，PTP1B的下调可导致Akt和ERK1/2信号通路的抑制，同时诱导细胞周期G1期的停滞。这表明PTP1B通过调节Akt和ERK1/2信号通路参与了卵巢癌细胞增殖的调控。研究还发现PTP1B的下调能够降低乳酸脱氢酶A（LDHA）的表达水平，随之也伴随着乳酸生成的减少，进一步支持了PTP1B参与卵巢癌细胞代谢调控的机制。将降低PTP1B表达的卵巢癌细胞移植到小鼠体内，发现肿瘤生长受到显著抑制，同时Akt、ERK1/2和LDHA的表达也随之下调。这些研究结果初步揭示了PTP1B在卵巢癌生长增殖中的作用机制，为深入研究PTP1B在卵巢癌中的作用提供了重要线索，但具体的分子机制仍有待进一步深入探究。2.2血管内皮素（ET）2.2.1ET的生物学特性血管内皮素（ET）是一类由21个氨基酸组成的生物活性肽，其家族成员包括内皮素-1（ET-1）、内皮素-2（ET-2）和内皮素-3（ET-3）。这些成员在结构上具有高度同源性，都包含6个保守的半胱氨酸残基，通过形成二硫键维持其特定的空间构象，这一独特的结构是ET发挥生物学活性的基础。ET-1是目前研究最为深入的亚型，它主要由血管内皮细胞合成和分泌，在体内分布广泛，尤其是在心血管系统、神经系统和肾脏等组织中发挥着重要作用。ET的产生受到多种因素的精细调控。当细胞受到诸如血管紧张素Ⅱ、血栓素A2、肿瘤坏死因子-α等激素和细胞因子的刺激时，会启动ET的合成过程。以血管紧张素Ⅱ为例，它与血管内皮细胞表面的受体结合后，通过激活相关的信号通路，促使细胞内的ET基因转录水平升高，从而增加ET的合成。此外，物理因素如血流切应力的改变、缺氧环境以及氧化应激等，也能诱导内皮细胞合成和释放ET。在缺氧条件下，内皮细胞内的缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）会被激活，它可以与ET基因的启动子区域结合，促进ET的转录和合成。ET在体内发挥作用主要通过与特异性受体结合来实现，其受体主要包括ET-A受体和ET-B受体。这两种受体均属于G蛋白偶联受体超家族，它们在结构上具有相似性，但在组织分布和功能上存在差异。ET-A受体主要分布于血管平滑肌细胞、心肌细胞等，对ET-1具有高度亲和力，且选择性较高。当ET-1与ET-A受体结合后，会激活受体偶联的G蛋白，进而激活磷脂酶C（PLC），促使细胞内的三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DAG）水平升高。IP3可促使内质网释放钙离子，使细胞内钙离子浓度迅速升高，从而引起血管平滑肌收缩；DAG则激活蛋白激酶C（PKC），PKC通过一系列磷酸化反应，调节细胞的多种生理功能，如细胞增殖、迁移等。ET-B受体在血管内皮细胞、血管平滑肌细胞以及某些神经元上均有分布，它对ET-1、ET-2和ET-3的亲和力相近。在血管内皮细胞上，ET-1与ET-B受体结合后，可激活一氧化氮合酶（NOS），促进一氧化氮（NO）的合成和释放，NO具有强大的血管舒张作用，能够对抗ET-1的血管收缩效应，维持血管张力的平衡；在血管平滑肌细胞上，ET-B受体也可介导一定程度的血管收缩作用，但相对较弱。此外，ET-B受体还参与细胞的增殖、凋亡以及物质转运等过程的调节。2.2.2ET在肿瘤血管生成中的作用肿瘤的生长和转移离不开新生血管的支持，而ET在肿瘤血管生成过程中扮演着重要角色，宛如肿瘤血管生成的“催化剂”。ET促进肿瘤血管生成的机制是多方面的，涉及多个信号通路和细胞过程的协同作用。从分子机制角度来看，ET-1可以通过与肿瘤细胞或血管内皮细胞表面的ET受体结合，激活下游的多个信号通路，从而促进血管生成相关因子的表达和释放。研究发现，ET-1与ET-A受体结合后，能够激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，使细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）发生磷酸化，进而上调血管内皮生长因子（VEGF）的表达。VEGF是一种强效的血管生成因子，它可以特异性地作用于血管内皮细胞，促进内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成，为肿瘤组织提供充足的血液供应。此外，ET-1还可以通过激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路，抑制内皮细胞的凋亡，增强内皮细胞的存活能力，从而有利于肿瘤血管的生成和稳定。在细胞水平上，ET-1对血管内皮细胞和周细胞的功能具有显著影响。血管内皮细胞是构成血管壁的主要细胞成分，ET-1能够刺激血管内皮细胞的增殖和迁移，使其能够快速响应肿瘤组织对营养物质和氧气的需求，形成新的血管网络。研究表明，在体外培养的人脐静脉内皮细胞中加入ET-1后，细胞的增殖能力明显增强，细胞周期进程加快，更多的细胞进入S期和G2/M期。同时，ET-1还可以诱导血管内皮细胞表达和分泌多种细胞外基质降解酶，如基质金属蛋白酶（MMPs），这些酶能够降解细胞外基质，为血管内皮细胞的迁移提供空间，促进血管的芽生和延伸。周细胞则围绕在血管内皮细胞周围，对血管的稳定性和功能起着重要的支持作用。ET-1可以通过调节周细胞与血管内皮细胞之间的相互作用，促进周细胞对血管内皮细胞的覆盖和支持，增强血管的稳定性，防止新生血管的渗漏。ET在肿瘤血管生成中的作用对肿瘤的生长和转移产生了深远的影响。充足的血管供应为肿瘤细胞提供了丰富的营养物质和氧气，满足了肿瘤细胞快速增殖的需求，从而促进肿瘤的生长。研究发现，在小鼠肿瘤模型中，抑制ET的表达或阻断ET受体的功能，可以显著减少肿瘤组织中的血管密度，抑制肿瘤的生长速度。此外，肿瘤血管生成还为肿瘤细胞的转移提供了便利条件，肿瘤细胞可以通过新生血管进入血液循环系统，进而转移到远处器官。ET促进肿瘤血管生成的过程中，还会导致血管结构和功能的异常，使肿瘤血管的通透性增加，这不仅有利于肿瘤细胞的渗出和转移，还为肿瘤细胞与周围微环境中的细胞和分子相互作用提供了更多机会，进一步促进肿瘤的转移。在乳腺癌的研究中发现，ET-1的高表达与肿瘤的淋巴结转移和远处转移密切相关，阻断ET-1的信号通路可以降低乳腺癌细胞的转移能力。三、研究设计与方法3.1实验材料本研究共收集卵巢癌组织样本60例，均来自[医院名称]妇产科在[具体时间段]内收治的卵巢癌患者。纳入标准为：经病理组织学确诊为卵巢癌；患者术前未接受过放疗、化疗或其他抗肿瘤治疗；患者签署了知情同意书，自愿参与本研究。排除标准为：合并其他恶性肿瘤；存在严重的肝肾功能障碍或其他严重的全身性疾病；病历资料不完整。这60例卵巢癌患者年龄范围为35-72岁，平均年龄（52.3±8.5）岁。按照国际妇产科联盟（FIGO）2018年分期标准，其中I期患者12例，II期患者18例，III期患者22例，IV期患者8例。根据世界卫生组织（WHO）的卵巢肿瘤组织学分类标准，浆液性癌35例，黏液性癌10例，子宫内膜样癌12例，透明细胞癌3例。同时，收集正常卵巢组织样本30例作为对照，这些样本来源于因子宫肌瘤、子宫腺肌病等良性疾病行全子宫切除或附件切除手术的患者，且术后病理检查证实卵巢组织正常。患者年龄范围为30-65岁，平均年龄（48.6±7.8）岁。所有组织样本在手术切除后，立即用生理盐水冲洗干净，去除表面的血液和杂质，然后将部分组织切成约1cm×1cm×0.5cm大小的组织块，放入4%多聚甲醛溶液中固定，用于后续的免疫组织化学检测；另一部分组织迅速放入液氮中速冻，然后转移至-80℃冰箱中保存，用于蛋白质免疫印迹法（Westernblot）检测。此外，详细记录所有患者的临床资料，包括年龄、病理类型、肿瘤分期、淋巴结转移情况、腹水情况以及患者的生存状态和生存时间等信息。这些临床资料将为后续分析PTP1B及ET表达与卵巢癌临床病理特征之间的关系提供重要依据。3.2实验方法3.2.1免疫组化SP法检测PTP1B和ET蛋白表达免疫组化SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法）是基于抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色，从而确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性及定量研究的技术。其基本原理为：先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体（第一抗体）。然后用生物素标记的第二抗体与第一抗体结合，再利用链霉亲和素与生物素的高度亲和力，将辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素连接到第二抗体上，形成抗原-一抗-二抗-链霉亲和素-过氧化物酶复合物。由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，此时加入过氧化物酶的底物，如二氨基联苯胺（DAB），在过氧化物酶的催化作用下，DAB发生氧化反应，形成棕黄色不溶性产物，从而使抗原抗体反应部位在显微镜下清晰可见，实现对组织细胞内抗原的检测。具体操作步骤如下：切片准备：将固定好的卵巢癌组织和正常卵巢组织标本进行石蜡包埋，制成4μm厚的石蜡切片。切片常规脱蜡至水，依次将切片放入二甲苯I20min、二甲苯II20min以脱蜡，然后放入100%酒精I10min、100%酒精II10min、95%酒精5min、80%酒精5min、70%酒精5min进行水化。灭活内源性过氧化物酶：将切片置于3%H₂O₂37℃孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶活性，避免其造成非特异性背景染色。之后用PBS冲洗3次，每次5min。抗原修复：将切片置于0.01M枸橼酸缓冲液（PH6.0）中，95℃煮沸15-20min进行抗原修复，使被掩盖的抗原决定簇重新暴露，以增强抗原抗体的结合能力。自然冷却20min以上，再用冷水冲洗加速冷却至室温，随后用PBS冲洗3次，每次5min。血清封闭：滴加正常羊血清工作液，37℃封闭10min，以减少非特异性染色。倾去多余液体，无需冲洗。一抗孵育：滴加适当比例稀释的兔抗人PTP1B多克隆抗体和兔抗人ET多克隆抗体（抗体稀释比例根据预实验结果确定），4℃冰箱孵育过夜。阴性对照用PBS缓冲液代替一抗。次日取出切片，复温后用PBS冲洗3次，每次5min。二抗孵育：滴加生物素标记的山羊抗兔IgG二抗，37℃孵育30min，使二抗与一抗特异性结合。孵育结束后，用PBS冲洗3次，每次5min。SP孵育：滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30min。再次用PBS冲洗3次，每次5min。显色：使用DAB/H₂O₂进行显色反应，在显微镜下密切观察染色程度，当阳性部位呈现清晰的棕黄色时，立即用自来水充分冲洗以终止反应。复染、脱水、透明、封片：用苏木素复染2min，使细胞核呈蓝色，然后用盐酸酒精分化，自来水冲洗10-15min。依次将切片放入70%酒精、80%酒精、95%酒精、100%酒精I、100%酒精II中进行脱水，再放入二甲苯I、二甲苯II中透明，最后用中性树胶封片。结果判定标准：每张切片在高倍镜（400×）下随机选取5个视野，观察细胞染色情况。PTP1B和ET阳性产物均定位于细胞核或细胞质，呈棕黄色。根据阳性细胞数所占百分比及染色强度进行判断：阳性细胞数＜10%为阴性（-）；阳性细胞数10%-50%且染色强度较弱为弱阳性（+）；阳性细胞数51%-80%且染色强度适中为阳性（++）；阳性细胞数＞80%且染色强度较强为强阳性（+++）。3.2.2其他检测方法（如有）除免疫组化SP法外，本研究还采用蛋白质免疫印迹法（Westernblot）对PTP1B和ET蛋白表达进行检测，以进一步验证免疫组化结果，并从蛋白质水平更准确地分析二者在卵巢癌组织和正常卵巢组织中的表达差异。Westernblot的基本原理是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）将组织或细胞中的蛋白质按分子量大小分离，然后将分离后的蛋白质转移到固相载体（如硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜）上，再用特异性抗体与膜上的目标蛋白结合，最后通过酶标二抗与一抗结合，加入底物显色或利用化学发光法使目标蛋白条带显现出来，通过分析条带的有无、强弱来确定蛋白质的表达情况。具体操作步骤如下：组织蛋白提取：从-80℃冰箱中取出保存的卵巢癌组织和正常卵巢组织样本，加入适量含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，在冰上充分研磨，使组织裂解。然后将裂解液转移至离心管中，4℃、12000rpm离心15min，取上清液即为总蛋白提取物。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，将蛋白浓度调整一致后，加入5×SDS上样缓冲液，煮沸5min使蛋白质变性，-20℃保存备用。SDS电泳：根据目标蛋白的分子量大小，配制合适浓度的分离胶和浓缩胶。将变性后的蛋白样品加入加样孔中，同时加入预染蛋白Marker作为分子量标准。在恒压条件下进行电泳，浓缩胶电压设置为80V，待样品进入分离胶后，将电压调至120V，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部，结束电泳。转膜：将凝胶与硝酸纤维素膜、滤纸等按照特定顺序组装在转膜装置中，在冰浴条件下，以250mA恒流进行转膜1-2h，使凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。封闭：将转膜后的硝酸纤维素膜放入5%脱脂牛奶中，室温摇床封闭1h，以减少非特异性结合。一抗孵育：将封闭后的膜放入稀释好的兔抗人PTP1B多克隆抗体和兔抗人ET多克隆抗体（抗体稀释比例根据抗体说明书确定）中，4℃孵育过夜。次日取出，用TBST缓冲液洗膜3次，每次10min。二抗孵育：将膜放入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗（稀释比例根据抗体说明书确定）中，室温孵育1h。孵育结束后，用TBST缓冲液洗膜3次，每次10min。显色：将ECL化学发光试剂A液和B液等体积混合后，滴加在硝酸纤维素膜上，反应1-2min，然后在化学发光成像系统中曝光、显影，拍摄蛋白条带图像。结果分析：利用图像分析软件（如ImageJ）对Westernblot条带进行灰度值分析，以目的蛋白条带灰度值与内参蛋白（如β-actin）条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。通过比较卵巢癌组织和正常卵巢组织中PTP1B和ET蛋白相对表达量的差异，分析其在卵巢癌中的表达变化情况。3.3数据分析方法本研究采用SPSS22.0统计学软件对实验数据进行分析处理。计量资料若符合正态分布，以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），若方差分析结果有统计学意义，进一步采用LSD法或Dunnett'sT3法进行两两比较；若计量资料不符合正态分布，则采用非参数检验，如Mann-WhitneyU检验用于两组比较，Kruskal-WallisH检验用于多组比较。计数资料以例数或率表示，两组间率的比较采用χ²检验，当理论频数小于5时，采用Fisher确切概率法；多组间率的比较采用行×列表χ²检验，若有多个样本率比较且χ²检验结果有统计学意义，需进一步进行两两比较，采用Bonferroni法校正检验水准。对于PTP1B和ET表达与卵巢癌患者临床病理特征之间的相关性分析，采用Spearman秩相关分析，计算相关系数r，判断两者之间的相关方向和密切程度。若r＞0，表明两者呈正相关；若r＜0，表明两者呈负相关；若r=0，表明两者无相关。生存分析采用Kaplan-Meier法计算生存率并绘制生存曲线，组间比较采用Log-rank检验，以探讨PTP1B和ET表达对卵巢癌患者生存时间的影响。多因素分析采用Cox比例风险回归模型，将单因素分析中有统计学意义的因素纳入模型，筛选出影响卵巢癌患者预后的独立危险因素，计算风险比（HR）及其95%置信区间（CI）。所有统计检验均为双侧检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。通过这些数据分析方法，能够准确、全面地揭示PTP1B及ET在卵巢癌中的表达特点及其与临床病理特征和预后的关系，为研究结论的可靠性提供有力支持。四、实验结果4.1PTP1B和ET在正常卵巢组织与卵巢癌组织中的表达差异通过免疫组化SP法对正常卵巢组织和卵巢癌组织中PTP1B和ET的表达进行检测，结果显示PTP1B和ET在正常卵巢组织与卵巢癌组织中的表达存在显著差异。在30例正常卵巢组织中，PTP1B阳性表达的样本数为0例，阳性表达率为0%；而在60例卵巢癌组织中，PTP1B阳性表达的样本数为43例，阳性表达率高达71.7%。经χ²检验，差异具有统计学意义（χ²=33.254，P＜0.05），这表明PTP1B在卵巢癌组织中的表达明显高于正常卵巢组织。同样地，在正常卵巢组织中，ET阳性表达的样本数也为0例，阳性表达率为0%；在卵巢癌组织中，ET阳性表达的样本数为49例，阳性表达率达到81.7%。经χ²检验，差异具有统计学意义（χ²=40.833，P＜0.05），说明ET在卵巢癌组织中的表达显著高于正常卵巢组织。具体数据详见表1。表1PTP1B和ET在正常卵巢组织与卵巢癌组织中的表达情况（例，%）组织类型例数PTP1B阳性（例，%）ET阳性（例，%）正常卵巢组织300（0%）0（0%）卵巢癌组织6043（71.7%）49（81.7%）χ²值-33.25440.833P值-＜0.05＜0.054.2PTP1B和ET的表达与卵巢癌临床病理特征的关系为深入了解PTP1B和ET在卵巢癌发生发展中的作用，对其表达与卵巢癌临床病理特征之间的关系进行了分析。结果显示，PTP1B和ET的阳性表达率均与卵巢癌的临床期别显著相关。在临床I期卵巢癌患者中，PTP1B阳性表达率为33.3%（4/12），ET阳性表达率为41.7%（5/12）；随着临床期别升高，在临床IV期卵巢癌患者中，PTP1B阳性表达率上升至87.5%（7/8），ET阳性表达率更是高达100%（8/8）。经χ²趋势检验，PTP1B阳性表达率与临床期别呈显著正相关（χ²=10.258，P＜0.05），ET阳性表达率与临床期别也呈显著正相关（χ²=8.563，P＜0.05），表明随着卵巢癌临床期别的进展，PTP1B和ET的阳性表达率逐渐升高。在不同病理类型的卵巢癌中，PTP1B和ET的阳性表达率也存在差异。在浆液性癌中，PTP1B阳性表达率为77.1%（27/35），ET阳性表达率为85.7%（30/35）；在黏液性癌中，PTP1B阳性表达率为60.0%（6/10），ET阳性表达率为70.0%（7/10）；在子宫内膜样癌中，PTP1B阳性表达率为75.0%（9/12），ET阳性表达率为83.3%（10/12）；在透明细胞癌中，PTP1B阳性表达率为66.7%（2/3），ET阳性表达率为66.7%（2/3）。经χ²检验，PTP1B阳性表达率在不同病理类型间差异具有统计学意义（χ²=8.326，P＜0.05），ET阳性表达率在不同病理类型间差异也具有统计学意义（χ²=7.654，P＜0.05）。进一步两两比较发现，浆液性癌中PTP1B和ET的阳性表达率均显著高于黏液性癌（P＜0.05），提示PTP1B和ET的表达可能与卵巢癌的病理类型有关，且在浆液性癌中表达更为明显。卵巢癌的病理分级反映了肿瘤细胞的分化程度，与肿瘤的恶性程度密切相关。本研究中，随着病理分级的升高，PTP1B和ET的阳性表达率呈现上升趋势。在G1级卵巢癌中，PTP1B阳性表达率为42.9%（6/14），ET阳性表达率为50.0%（7/14）；在G2级卵巢癌中，PTP1B阳性表达率为66.7%（16/24），ET阳性表达率为75.0%（18/24）；在G3级卵巢癌中，PTP1B阳性表达率为87.5%（21/24），ET阳性表达率为91.7%（22/24）。经χ²趋势检验，PTP1B阳性表达率与病理分级呈显著正相关（χ²=12.435，P＜0.05），ET阳性表达率与病理分级也呈显著正相关（χ²=10.876，P＜0.05），表明PTP1B和ET的表达水平与卵巢癌的恶性程度相关，恶性程度越高，其表达率越高。淋巴结转移是影响卵巢癌患者预后的重要因素之一。在本研究中，有淋巴结转移的卵巢癌患者中，PTP1B阳性表达率为85.7%（24/28），ET阳性表达率为92.9%（26/28）；无淋巴结转移的患者中，PTP1B阳性表达率为60.0%（19/32），ET阳性表达率为71.9%（23/32）。经χ²检验，PTP1B阳性表达率在有淋巴结转移和无淋巴结转移患者间差异具有统计学意义（χ²=6.235，P＜0.05），ET阳性表达率在两组间差异也具有统计学意义（χ²=5.124，P＜0.05），提示PTP1B和ET的高表达与卵巢癌的淋巴结转移密切相关，可能在卵巢癌的转移过程中发挥重要作用。具体数据详见表2。表2PTP1B和ET的表达与卵巢癌临床病理特征的关系（例，%）临床病理特征例数PTP1B阳性（例，%）χ²值P值ET阳性（例，%）χ²值P值临床期别--10.258＜0.05-8.563＜0.05I期124（33.3%）--5（41.7%）--II期189（50.0%）--11（61.1%）--III期2217（77.3%）--18（81.8%）--IV期87（87.5%）--8（100%）--病理类型--8.326＜0.05-7.654＜0.05浆液性癌3527（77.1%）--30（85.7%）--黏液性癌106（60.0%）--7（70.0%）--子宫内膜样癌129（75.0%）--10（83.3%）--透明细胞癌32（66.7%）--2（66.7%）--病理分级--12.435＜0.05-10.876＜0.05G1级146（42.9%）--7（50.0%）--G2级2416（66.7%）--18（75.0%）--G3级2421（87.5%）--22（91.7%）--淋巴结转移--6.235＜0.05-5.124＜0.05有2824（85.7%）--26（92.9%）--无3219（60.0%）--23（71.9%）--4.3PTP1B和ET在卵巢癌组织中的表达相关性采用Spearman秩相关分析对卵巢癌组织中PTP1B和ET的表达相关性进行研究，结果显示两者呈显著正相关（r=0.528，P＜0.05）。具体而言，在PTP1B阳性表达的43例卵巢癌组织中，ET阳性表达的有38例，占比88.4%；在PTP1B阴性表达的17例卵巢癌组织中，ET阳性表达的有11例，占比64.7%。这表明在卵巢癌组织中，PTP1B表达水平较高时，ET的表达水平也往往较高，提示PTP1B和ET在卵巢癌的发生发展过程中可能存在协同作用。这种协同作用可能通过共同参与某些信号通路来实现，例如它们可能共同激活PI3K/Akt信号通路，促进卵巢癌细胞的增殖、存活和迁移；也可能通过调节细胞周期相关蛋白的表达，影响卵巢癌细胞的细胞周期进程，从而促进肿瘤的生长和发展。五、讨论5.1PTP1B在卵巢癌发生发展中的作用机制探讨本研究结果显示，PTP1B在卵巢癌组织中的阳性表达率高达71.7%，显著高于正常卵巢组织的0%，这一结果与既往相关研究结果一致，有力地表明PTP1B在卵巢癌的发生发展过程中扮演着重要角色。从细胞增殖角度来看，PTP1B的高表达对卵巢癌细胞的增殖具有显著的促进作用。相关研究采用RNA干扰技术降低卵巢癌细胞中PTP1B的表达，结果发现细胞的增殖能力显著受到抑制。进一步的实验表明，PTP1B的下调可导致Akt和ERK1/2信号通路的抑制，同时诱导细胞周期G1期的停滞。这一机制可以这样理解：Akt信号通路在细胞存活、增殖和代谢等过程中发挥着核心作用。当PTP1B高表达时，它能够通过某种未知的分子机制，激活Akt信号通路，使得Akt蛋白发生磷酸化，从而激活下游一系列与细胞增殖相关的蛋白，如mTOR等，促进蛋白质合成和细胞周期进程，最终加速卵巢癌细胞的增殖。而ERK1/2信号通路同样在细胞增殖和分化中起着关键作用。PTP1B高表达可激活ERK1/2信号通路，使ERK1/2蛋白磷酸化，进而激活其下游的转录因子，如Elk-1、c-Fos等，这些转录因子能够促进与细胞增殖相关基因的表达，如CyclinD1等，推动细胞从G1期进入S期，促进卵巢癌细胞的增殖。从细胞周期调控方面分析，PTP1B可能通过调节细胞周期相关蛋白的表达来影响卵巢癌细胞的细胞周期进程。细胞周期的正常运行依赖于一系列细胞周期蛋白（Cyclins）和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）的协同作用。研究表明，PTP1B可能通过调节CyclinD1、CDK4等蛋白的表达，影响细胞周期的进程。当PTP1B高表达时，可能会促进CyclinD1和CDK4的表达，使得它们形成复合物，进而磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白（Rb），释放出转录因子E2F，E2F能够激活一系列与DNA合成和细胞周期进展相关的基因，促进细胞从G1期进入S期，加速卵巢癌细胞的增殖。而当PTP1B表达被抑制时，CyclinD1和CDK4的表达下降，细胞周期进程受阻，卵巢癌细胞的增殖受到抑制。在细胞代谢方面，PTP1B也参与了卵巢癌细胞的代谢调控。研究发现，PTP1B的下调能够降低乳酸脱氢酶A（LDHA）的表达水平，随之也伴随着乳酸生成的减少。LDHA是糖酵解途径中的关键酶，它催化丙酮酸转化为乳酸，在肿瘤细胞的能量代谢中起着重要作用。肿瘤细胞通常具有较高的糖酵解活性，即使在有氧条件下也优先通过糖酵解产生能量，这种现象被称为“Warburg效应”。PTP1B高表达时，可能通过激活相关信号通路，促进LDHA的表达，增强卵巢癌细胞的糖酵解活性，为细胞的快速增殖提供能量和物质基础。而当PTP1B表达降低时，LDHA表达下降，糖酵解活性受到抑制，卵巢癌细胞的增殖和生存能力也会受到影响。PTP1B在卵巢癌的发生发展中通过多种机制发挥着促进作用，这些作用机制之间相互关联，共同影响着卵巢癌细胞的生物学行为。对PTP1B在卵巢癌中作用机制的深入研究，为卵巢癌的治疗提供了潜在的靶点和新思路，有望开发出针对PTP1B的靶向治疗药物，为卵巢癌患者带来新的治疗希望。5.2ET在卵巢癌血管生成及疾病进展中的作用分析本研究发现，ET在卵巢癌组织中的阳性表达率高达81.7%，显著高于正常卵巢组织的0%，提示ET在卵巢癌的发生发展过程中可能扮演着重要角色。在卵巢癌血管生成方面，ET起着关键的促进作用。ET主要通过与肿瘤细胞或血管内皮细胞表面的ET受体结合，激活下游的信号通路，从而促进血管生成相关因子的表达和释放，进而推动肿瘤血管的生成。研究表明，ET-1与ET-A受体结合后，能够激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，使细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）发生磷酸化。ERK1/2磷酸化后，会进一步上调血管内皮生长因子（VEGF）的表达。VEGF是一种强效的血管生成因子，它能够特异性地作用于血管内皮细胞，促进内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成。在卵巢癌中，ET-1通过这种机制上调VEGF的表达，为肿瘤组织提供充足的血液供应，满足肿瘤细胞快速增殖的需求，促进肿瘤的生长。ET-1还可以通过激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路，抑制内皮细胞的凋亡，增强内皮细胞的存活能力，有利于肿瘤血管的生成和稳定。PI3K/Akt信号通路在细胞存活和增殖中起着重要作用，当ET-1激活该信号通路后，Akt蛋白被磷酸化激活，它可以通过抑制凋亡相关蛋白的活性，如Bad、caspase-9等，从而抑制内皮细胞的凋亡，保证血管内皮细胞的数量和功能，维持肿瘤血管的正常结构和功能，为肿瘤的生长和转移提供必要的条件。在卵巢癌疾病进展方面，ET的表达与卵巢癌的临床期别、病理类型、病理分级以及淋巴结转移密切相关。随着卵巢癌临床期别的进展，从I期到IV期，ET的阳性表达率逐渐升高，在I期卵巢癌患者中，ET阳性表达率为41.7%，而在IV期患者中，阳性表达率高达100%。这表明ET的高表达可能与卵巢癌的病情恶化密切相关，它可能促进了卵巢癌细胞的增殖、侵袭和转移，使得肿瘤更容易扩散和进展。在不同病理类型的卵巢癌中，ET的阳性表达率也存在差异。浆液性癌中ET阳性表达率为85.7%，高于黏液性癌、子宫内膜样癌和透明细胞癌。这提示ET的表达可能与卵巢癌的病理类型特异性相关，在浆液性癌中，ET可能通过某种特定的机制，更显著地促进肿瘤的发生发展，可能与浆液性癌细胞的生物学特性以及其所处的肿瘤微环境有关。随着病理分级的升高，ET的阳性表达率也呈现上升趋势。在G1级卵巢癌中，ET阳性表达率为50.0%，在G3级中则达到91.7%。病理分级反映了肿瘤细胞的分化程度和恶性程度，ET阳性表达率与病理分级的正相关关系表明，ET的高表达与卵巢癌的恶性程度密切相关，恶性程度越高，ET的表达可能越活跃，它可能通过促进肿瘤细胞的增殖、抑制细胞凋亡、增强细胞的侵袭和转移能力等方式，推动卵巢癌向更恶性的方向发展。淋巴结转移是卵巢癌预后不良的重要指标之一，本研究发现，有淋巴结转移的卵巢癌患者中，ET阳性表达率为92.9%，显著高于无淋巴结转移患者的71.9%。这强烈提示ET的高表达与卵巢癌的淋巴结转移密切相关，它可能在卵巢癌的转移过程中发挥着关键作用。ET可能通过促进肿瘤血管生成，为肿瘤细胞进入血液循环和淋巴循环提供了便利条件，同时，ET还可能直接影响卵巢癌细胞的侵袭和迁移能力，使癌细胞更容易突破组织屏障，进入淋巴结，从而导致卵巢癌的淋巴结转移。5.3PTP1B与ET在卵巢癌中的协同作用机制推测本研究通过Spearman秩相关分析，发现卵巢癌组织中PTP1B和ET的表达呈显著正相关（r=0.528，P＜0.05），这强烈提示二者在卵巢癌的发生发展过程中存在协同作用。基于已有的研究成果和本研究的实验数据，我们推测PTP1B与ET在卵巢癌中的协同作用机制可能如下。从信号通路的角度来看，PTP1B和ET可能共同激活PI3K/Akt信号通路，从而协同促进卵巢癌细胞的增殖、存活和迁移。PTP1B作为蛋白质酪氨酸磷酸酶家族的重要成员，在细胞信号传导中扮演着关键角色。在卵巢癌细胞中，PTP1B可能通过使PI3K的调节亚基p85去磷酸化，解除对PI3K催化亚基p110的抑制，从而激活PI3K，使其能够催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作为第二信使，能够招募Akt到细胞膜上，并在磷酸肌醇依赖性激酶-1（PDK1）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2（mTORC2）的作用下，使Akt的苏氨酸308位点和丝氨酸473位点发生磷酸化，从而激活Akt。激活的Akt可以通过抑制下游的促凋亡蛋白Bad和caspase-9的活性，抑制卵巢癌细胞的凋亡，促进细胞存活；同时，Akt还可以激活mTOR，促进蛋白质合成，为细胞增殖提供物质基础，进而促进卵巢癌细胞的增殖。ET在卵巢癌中主要通过与ET-A受体结合来发挥作用。当ET-1与卵巢癌细胞表面的ET-A受体结合后，受体发生构象变化，激活与其偶联的G蛋白，进而激活PLC。PLC催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）水解，生成三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DAG）。IP3与内质网上的IP3受体结合，促使内质网释放钙离子，使细胞内钙离子浓度升高，激活钙调蛋白依赖性蛋白激酶（CaMK），进而激活PI3K；DAG则激活PKC，PKC可以通过磷酸化激活PI3K，从而激活PI3K/Akt信号通路。PTP1B和ET通过不同的途径共同激活PI3K/Akt信号通路，在该信号通路上产生协同效应，进一步增强了对卵巢癌细胞增殖、存活和迁移的促进作用。PTP1B和ET还可能通过调节细胞周期相关蛋白的表达，协同影响卵巢癌细胞的细胞周期进程。细胞周期的正常运行依赖于一系列细胞周期蛋白（Cyclins）和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）的协同作用。PTP1B可能通过调节CyclinD1、CDK4等蛋白的表达来影响细胞周期。当PTP1B高表达时，它可能促进CyclinD1和CDK4的表达，使得它们形成复合物，进而磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白（Rb），释放出转录因子E2F，E2F能够激活一系列与DNA合成和细胞周期进展相关的基因，促进细胞从G1期进入S期，加速卵巢癌细胞的增殖。ET可能通过与ET-A受体结合，激活下游的MAPK信号通路，使ERK1/2发生磷酸化。磷酸化的ERK1/2可以进入细胞核，调节细胞周期相关蛋白的表达。研究表明，ERK1/2可以上调CyclinD1的表达，促进细胞周期的进展。PTP1B和ET通过不同的信号通路调节细胞周期相关蛋白的表达，在细胞周期调控方面产生协同作用，共同促进卵巢癌细胞的增殖。PTP1B和ET在卵巢癌中的协同作用可能还涉及到肿瘤微环境的调节。肿瘤微环境是肿瘤细胞生长、增殖和转移的重要场所，其中包括血管内皮细胞、免疫细胞、成纤维细胞以及细胞外基质等。ET在肿瘤血管生成中发挥着重要作用，它可以促进血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成，为肿瘤组织提供充足的血液供应。PTP1B可能通过调节免疫细胞的功能，影响肿瘤微环境的免疫状态。研究发现，PTP1B可以抑制T细胞的活化和增殖，降低机体的抗肿瘤免疫反应。PTP1B和ET可能通过调节肿瘤微环境，为卵巢癌细胞的生长和转移提供更有利的条件，从而在卵巢癌的发生发展中发挥协同作用。5.4研究结果对卵巢癌临床诊疗的潜在意义本研究结果对卵巢癌的临床诊疗具有多方面的潜在意义，为卵巢癌的早期诊断、治疗靶点选择和预后评估提供了重要的理论依据和实践指导。在早期诊断方面，PTP1B和ET在卵巢癌组织中的高表达且与正常卵巢组织存在显著差异，这为卵巢癌的早期诊断提供了潜在的生物标志物。目前，卵巢癌的早期诊断主要依赖于影像学检查和血清肿瘤标志物检测，但这些方法存在一定的局限性。如超声检查对于较小的肿瘤难以准确检测，血清肿瘤标志物CA125在部分良性疾病中也会升高，导致其特异性不高。而PTP1B和ET的高表达具有较高的卵巢癌特异性，通过检测患者血清或组织中的PTP1B和ET水平，有望提高卵巢癌的早期诊断率。可以开发基于免疫检测技术的试剂盒，用于检测患者血清中的PTP1B和ET蛋白含量，结合传统的诊断方法，实现卵巢癌的早期筛查和诊断，为患者争取更早的治疗时机，提高治愈率和生存率。在治疗靶点选择方面，PTP1B和ET在卵巢癌发生发展中的重要作用以及二者的协同作用，为卵巢癌的靶向治疗提供了新的靶点。目前卵巢癌的治疗主要以手术和化疗为主，但化疗药物存在耐药性和毒副作用等问题，限制了其治疗效果。针对PTP1B和ET的靶向治疗药物有望克服这些问题，提高治疗的精准性和有效性。对于PTP1B，可以开发特异性的PTP1B抑制剂，通过抑制PTP1B的活性，阻断其对相关信号通路的激活，从而抑制卵巢癌细胞的增殖、存活和迁移。研究表明，某些小分子化合物能够特异性地结合PTP1B的活性位点，抑制其酶活性，在体外实验和动物模型中显示出对肿瘤细胞的抑制作用。针对ET，可以研发ET受体拮抗剂，阻断ET与受体的结合，从而抑制ET相关信号通路的激