（正式版）DB22∕T 2049-2014 《动物源性饲料中鸭源性成分测定PCR方法》

备案号：41837-2014Determinationofduckderi2014-04-30实施2014-04-30实施吉林省质量技术监督局发布I本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、国家农业深加工产品质量监督检验中心、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。本标准主要起草人：史艳宇、刘金华、邴炜、王莹、周亮、吕航、郎乐、张庆波、宫国强。1本标准规定了动物源性饲料中鸭源性成分的PCR检测方法，该方法的检出限为0.1%。本标准适用于动物源性饲料中鸭源性成分的定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。鸭种属特异性DNA片段。对样品进行DNA提取，通过PCR扩增，检测鸭特异性基因片段。5试剂和材料除特别说明以外，所有试剂均为分析纯，水为按照GB/T6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。5.1鸭源性成分检测用引物(对)序列为：a)上游引物：5'-CATCTATCCTGCTAGCCGCC-3'b)下游引物：5'-GGCTTGAGTGGAAGAATGCC-3'5.3dNTP:dATP(deoxyadenosinetriphosphate,脱氧腺苷三磷酸)、dGTP(deoxyguanosinatriphosphate,脱氧鸟苷三磷酸)、dCTP(deoxycytidinetriphosphate,脱氧胞苷三磷酸)、dTTP(deoxythymidinetriphosphate,脱氧胸苷三磷酸)。5.4动物基因组DNA提取纯化试剂盒。5.5RNaseA酶：冻干品，不含DNase。5.6蛋白酶K:冻干品。5.7三羟甲基氨基甲烷(Tris)。25.1310×PCR缓冲液：含200mmol/LTris-HCI(p5.15酶切缓冲液：含10mmol/LTris-HCI(pH7.5),10mmol/LMgCl₂,50mmol/LNaCl,0.1mg/mL5.16RNaseA酶溶液：用高压灭菌的去离子水溶解RNaseA酶为10mg/mL的溶液，分装后于-20℃5.18乙酸钠溶液，3mol/L:在80mL水中到5.2,用水定容到100mL,分装后高压灭菌。5.19Tris-HCl,1mol/L,pH8.0:在800mL去离子水中溶解121.1gTris,冷却至室温后用浓盐酸调节溶液的pH值至8.0,加水定容至1L,分装后高压灭菌。5.20EDTA,0.5mol/L,pH8.0:称取186.1gEDTA-Na₂·2H₂O,加入700mL水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用10mol/L氢氧化钠调pH值至8.0,用水定容到1L,分装后高压灭菌。5.21CTAB提取缓冲液I:在800mL去离子水中加入46.75g氯化钠，溶解后加入1mol/LTris-HCl (pH8.0)50mL,0.5mol/LED调节溶液的pH值至8.0,用水定容至1L,分装后高压灭菌。5.22CTAB提取缓冲液Ⅱ:在800mL去离子水中加入46.75g氯化钠，20gCTAB,完全溶解后加入1mol/LTris-HCl(pH8.0)50mL,0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL,用水定容至1L,分装后高压灭5.25TE缓冲液(pH8.0):在800mL水中，依次加入10mL的1mol/LTris-HCI(pH8.0)和2mL的0.5mol/LEDTA(pH8.0),用水定容到1L,分装后高压灭菌。5.26电泳缓冲液：Tris54g,硼酸27.5g,0.5mol/LEDTA溶液(pH8.0)20mL,加蒸馏水至1000mL;使用时10倍稀释。5.27溴化乙锭贮存液：用水配制成10mg/mL。5.28加样缓冲液：称取溴酚蓝250mg,加水10mL,在室温下过夜溶解；再称取二甲腈蓝250mg,用10mL水溶解；称取蔗糖50g,用30mL水溶解，合并三种溶液，用水定容至100mL,在4℃保存。36.9pH计。μL于65℃预热的CTAB提取缓冲液II,混匀，65℃保温30min~90min,期间不时轻缓颠倒混匀；加入冷却至室温后加入5μLRNaseA溶液(10mg/mL),室温下放置30min;室温12000r/min离心10min,取上清液，于另一干净的2mL离心管中，分别用等体积Tris饱和苯酚、Tris饱和苯酚+三氯甲烷(1+1)和三氯甲烷+异戊醇(24+1)抽提三次，12000r/min离心10min;将上清液转移至干净的2mL离心管液(预先加热至65℃有利于溶解DNA)中，-20℃保存备用。取油脂饲料适量(液态油取30mL、磷脂类和固态油脂取5g)放入250mTris饱和苯酚+三氯甲烷(1+1),轻缓颠倒混匀溶液；12000r/min离心10min,取上清液，加入与上清液等体积三氯甲烷+异戊醇(24+1),轻缓颠倒混匀，12000r/min离心2min至分层；将上清液转移至于100μLTE缓冲液(预先加热至65℃有利于溶解DNA)中，-20℃保存备用。注：DNA提取和纯化过程应用水作为核酸提取空白对照。4取10μLDNA溶液加蒸馏水稀释至1mL,使用核酸蛋白仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值。DNA的浓度按照式(1)计算，当A₂6JA₂80比值在1.5～2.1之间时，适宜于PCR扩增。扩增前将所有样品DNA调至10ng/μL~50ng/μL。c——DNA浓度，单位为纳克每微升(ng/μL);4—260nm处的吸光值；N——核酸稀释倍数。7.4PCR检测7.4.1PCR反应体系PCR反应体系见表1。每个样品设置2个平行。10×PCR缓冲液dNTP溶液(10mmol/L)TaqDNA聚合酶(5U/μL)上游引物(10μmol/L)下游引物(10μmol/L)7.4.2PCR扩增条件94℃预变性5min,94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸30s,共35个循环，最后72℃延伸10min。4℃保存。不同仪器、不同TaqDNA聚合酶可根据要求将反应条件做适当调整。检测过程中设置PCR扩增空白对照、阴性对照和阳性对照。用已知含有鸭源性成分的样品DNA作阳性对照，用已知不含有鸭源性成分的样品DNA作阴性对照，用等体积的灭菌去离子水代替模板DNA作空白对照。7.4.3PCR扩增产物电泳检测取2g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分熔化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5μg/mL,制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将5μL～8μLPCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样，用分子量标记作参照。9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。7.4.4限制性内切酶酶切及产物电泳检测5如果PCR扩增产物电泳检测结果阳性，进行限制性内切酶酶切反应或进行测序(序列参考附录A)。酶切反应体系(20μL):StuI酶2U,酶切缓冲液2μL,加入PCR扩增产物至总体积20μL。酶切在37℃下进行，20min。酶切完成后电泳，方法见7.4.3。8结果判断与表述8.1PCR扩增产物电泳检测结果阳性样品的PCR扩增产物大小为201bp(序列参考附录A)。8.2限制性内切酶酶切结果阳性样品PCR产物采用内切酶StuI酶切后，酶切片段大小为118bp和83bp。PCR产物为阳性，限制性内切酶酶切产物片段大小正确，确认含有鸭源性成分，表述为检出鸭源性成分；酶切产物片段大小不正确，确认不含有鸭源性成分，表述为未检出鸭源性成分。PCR产物为阴性者判定不含有鸭源性成分，表述为未检出鸭源性成分。9检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403