DB53T 1059.2-2021 滇金丝猴检疫技术 第2部分：毛首线虫实验室检测技术规范

CCSB41l53QuarantinetechniqueforRhinopithecusb—Part2:TechnicalspecificationsforlaboratoryexaminationofCapillaria云南省市场监督管理局发布DB53/T1059.2—2021I前言 Ⅴ 12规范性引用文件 13术语和定义 14缩略语 15试验原理 26试验条件 26.1实验室通用要求 26.2人员要求 26.3生物安全要求 27仪器设备和试剂 27.1主要仪器设备 27.2主要试剂 28样品采集与保存 39试验步骤 39.1形态学检测 39.2PCR检测 310试验数据处理 310.1虫卵检测 410.2虫体检测 4附录A（规范性）粪样的采集和保存方法 5附录B（规范性）毛首线虫的基本形态特征 7DB53/T1059.2—2021本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起本文件是DB53/T1059《滇金丝猴检疫技术》的第2部分。DB53/T1059已经发布了以下部分：——第1部分：产气荚膜梭菌实验室检测技术规范；——第2部分：毛首线虫实验室检测技术规范；——第3部分：隐孢子虫实验室检测技术规范；——第4部分：志贺杆菌实验室检测技术规范。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由云南省林业与草原局、云南省市场监督管理局共同提出。本文件由云南省林业标准化技术委员会（YNTC02）归口。本文件主要起草单位：云南农业大学、云南省标准化研究院、昆明动物园、云南省动物卫生监督所。本文件主要起草人：杨建发、黄艳梅、蒙英雯、朱勋程、衡昭君、杨俊、邹丰才、陈培富、宋海洋、张誉方、李云乔、朱尤帅。DB53/T1059.2—2021Ⅴ滇金丝猴（Rhinopithecusbieti）是中国特有珍稀濒危灵长类动物，属于国家Ⅰ级重点保护野生动物，列入《世界自然保护联盟》（IUCN）濒危物种红色名录。编制并发布DB53/T1059《滇金丝猴检疫技术》地方标准，推进滇金丝猴疫病诊断的标准化和规范化，指导从事野生动物保护相关的专业人员按规范程序实施对滇金丝猴相关病原的实验室检测，为滇金丝猴的科学研究和保护工作提供病原或疫病调查的基础数据，为滇金丝猴检疫、疫病监测和防治提供重要的参考依据，促进滇金丝猴繁育和扩群，维护地区物种与生态平衡，提升生物多样性保护成效。本文件已发布4个部分：——第1部分：产气荚膜梭菌实验室检测技术规范。本部分从产气荚膜梭菌实验室检测技术的总则、产气荚膜梭菌分型、仪器设备和试剂、样品、试验步骤、试验数据处理等方面制定了规范；——第2部分：毛首线虫实验室检测技术规范。本部分从毛首线虫实验室检测技术规范的试验原理、试验条件、仪器设备和试剂、样品采集与保存、试验步骤、试验数据处理等方面制定了规范；——第3部分：隐孢子虫实验室检测技术规范。本部分从隐孢子虫实验室检测技术的试验原理、试验条件、仪器设备和试剂、样品、试验步骤、试验数据处理等方面制定了规范；——第4部分：志贺杆菌实验室检测技术规范。本部分从志贺杆菌实验室检测技术涉及的总则、志贺杆菌分类、仪器设备和试剂、样品、试验步骤、试验数据处理等方面制定了规范。DB53/T1059.2—20211滇金丝猴检疫技术第2部分：毛首线虫实验室检测技术规范本文件规定了滇金丝猴（Rhinopithecusbieti）检疫技术中毛首线虫实验室检测技术规范的试验原理、试验条件、仪器设备和试剂、样品采集与保存、试验步骤、试验数据处理。本文件适用于滇金丝猴检疫技术中毛首线虫实验室检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1线虫nematodes线虫动物门为假体腔动物，线虫属通常呈圆柱形，线状或毛发状，某些种类呈鞭状或球状。不分节，两侧对称并具有三胚层假体腔，一般为雌雄异体。虫体大小随种类不同差别较大，雄虫一般较雌虫小。寄生性线虫最常见寄生于消化道。3.2毛首线虫trichuris毛首线虫是滇金丝猴最为常见也是危害最大的消化道线虫。虫卵随滇金丝猴粪便排到外界，在粪便和土壤中发育为感染性虫卵；经口感染后，幼虫在小肠内孵出，钻入肠绒毛间发育，然后移行到盲肠和结肠内发育为成虫。4缩略语下列缩略语适用于本文件。PCR：聚合酶链式反应PolymeraseChainReactionTAE：Tris-乙酸电泳缓冲液TrisAcetate-EDTABufferDNA：脱氧核糖核酸DeoxyribonucleicAcidNCBI：美国国家生物技术信息中心NationalCenterforBiotechnologyInformationBLAST：基于局部序列比对算法的搜索工具BasicLocalAlignmentSearchToolDB53/T1059.2—202125试验原理镜检滇金丝猴消化道内的毛首线虫虫卵或虫体，依据其形态特征鉴定病原；采用PCR方法开展分子鉴定。6试验条件6.1实验室通用要求实验室应满足GB19489的要求。6.2人员要求采样与试验人员具有相应的专业知识。6.3生物安全要求采样及试验过程中做好自身防护，试验结束后的检验器具要进行消毒处理，废弃样品要及时进行无害化集中处理。7仪器设备和试剂7.1主要仪器设备7.1.1正置光学显微镜。7.1.2载玻片及盖玻片若干，漏斗、玻璃棒、烧杯。7.1.3金属筛：60目。7.1.4PCR扩增仪。7.1.5高速台式离心机。7.1.6单道可调移液器（量程0.5μL～10μL、2μL～20μL、10μL～100μL和100μL～1000μL）。7.1.7电子天平（量程0.01mg～10000mg）。7.1.8恒温水浴锅：36℃±1℃,65℃±1℃。7.1.9电泳槽、电泳仪，紫外凝胶成像仪，涡旋振荡器。7.2主要试剂7.2.1饱和食盐水。7.2.22.5%重铬酸钾液。7.2.3基因组DNA提取试剂盒。7.2.42×TaqPCRMasterMix。7.2.5DL2000DNAMarker。7.2.6无菌水。7.2.750×TAE缓冲液：Tris碱242g和57.1mL冰醋酸，用双蒸水定容到1L。7.2.8核酸染料，用于凝胶成像显示条带。7.2.91%琼脂糖凝胶：1g琼脂糖与100mL1×TAE缓冲液，加热融化均匀，加入10μL核酸染料，60℃时，倒入胶槽，插上样品梳。室温下待凝胶凝固后，垂直向上拔出固定在凝胶中的样品梳。DB53/T1059.2—202138样品采集与保存粪样的采集和保存方法见附录A。9试验步骤9.1形态学检测9.1.1虫卵检测采用饱和食盐水漂浮法，毛首线虫卵富集在饱和液表面。取粪样5g，加饱和食盐水50mL，用玻璃棒搅匀，通过60目金属筛或双层纱布过滤到干净烧杯中，静置0.5h；蘸取表面液膜，点样于载玻片上，盖上盖玻片，进行镜检。9.1.2虫体检测用生理盐水清洗干净虫体，放于载玻片，滴加乳酸酚透明液2～3滴，盖上盖玻片，在光学显微镜下观察透明虫体的内部形态构造。对于存疑虫体，结合下述PCR扩增方法对其进行虫种鉴定。9.2PCR检测9.2.1DNA提取和保存取粪样，用商品化DNA提取试剂盒进行DNA提取，提取步骤按照DNA提取试剂盒说明书进行。1周内使用到的DNA，放置于4℃冰箱中；需要长期保存的DNA，放置于-20℃冰箱中。9.2.2PCR扩增9.2.2.1PCR扩增引物针对线虫线粒体细胞色素C氧化酶第一亚基（COXI）基因设计引物，此引物灵敏度和特异性较高。上下游引物序列如下：JB3：5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′；JB4.5：5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′。9.2.2.2PCR扩增体系PCR扩增体系为25µL，包括2×TaqPCRMasterMix12.5µL，无菌水10.5µL，引物JB3和JB4.5各0.5µL，DNA模板1.0µL。9.2.2.3PCR扩增程序用PCR扩增仪设置反应程序，94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，设置36个循环反应，最后72℃延伸5min，16℃结束反应，同时设阴性对照和阳性对照。9.2.2.4PCR产物检测PCR扩增完成后，取PCR产物5µL，加入1%琼脂糖凝胶电泳孔中，以DL2000DNAMarker作为参照，110V电压电泳30min。将凝胶取出放入紫外凝胶成像仪中观察并拍照。若出现预期的420bp左右的条带，扩增条带进行测序后验证。10试验数据处理DB53/T1059.2—2021410.1虫卵检测经饱和食盐水漂浮法镜检发现如附录B中图B.1所示的虫卵，直接判定为滇金丝猴毛首线虫感染阳性。若发现存疑虫卵，对其进行PCR扩增后，将PCR产物测序结果与NCBIGenBank中的序列进行BLAST在线比对，判定是否为滇金丝猴毛首线虫感染阳性。10.2虫体检测对虫体进行镜检观察到如附录B中B.2描述的虫体，直接判定为滇金丝猴毛首线虫感染阳性。若发现存疑虫体，对其进行PCR检测后，将PCR产物测序结果与NCBIGenBank中的序列进行BLAST在线比对，判定是否为滇金丝猴毛首线虫感染阳性。DB53/T1059.2—20215（规范性）粪样的采集和保存方法A.1采样工具一次性PE手套、自封袋、样品管、记号笔、标签纸等。A.2粪样新鲜程度判定将粪便样品放于自封袋，根据粪便表面的湿润程度、完整程度以及气味等条件，判断粪便样品的新鲜程度并记录。A.3粪样的选取原则A.3.1应采集滇金丝猴新鲜粪样，同一堆粪样只采集一份样品，两堆样品的距离应大于3m。A.3.2如遇到滇金丝猴母幼粪样应分开采集；依据母猴和幼猴的粪样大小有明显差异作出判断，并在备注栏记录。A.4样品采集方法A.4.1采集粪样外部和内部的样品，每次采样时应更换新的PE手套，以避免样品间的交叉污染。A.4.2采集时，直接剥取分离新鲜粪样的表层部分和内部部分，分别放入自封袋，贴上样品标签纸，写上样品编号，将样品管放入自封袋，并再次写上样品编号。A.4.3同一堆粪样应尽量多取样品。A.5样品记录与编号在采集粪样时，应填写《滇金丝猴粪样采集记录表》（见表A.1）。记录采样信息包括样品编号，采集管数，内部管数，外部管数，种群，采集地名，经纬度、海拔，新鲜程度、采集日期，采集人等信息。表A.1滇金丝猴粪样采集记录表A.6样品的临时保存野外样品采回后，有条件在4℃下低温保存，直到样品送到相关实验室。A.7样品的运输和实验室保存DB53/T1059.2—20216野外样品采集完成后，应于48h内送到