T-CVMA 287-2025 非洲猪瘟病毒微流控荧光PCR检测方法

T/CVMA287—2025非洲猪瘟病毒微流控荧光PCR检测方法MicrofluidicReal-timePCRdetectionmethodforAfricanswinefevervirus2025-9-30发布2025-9-30实施中国兽医协会发布I请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利12规范性引用文件GB/T6682分析实验室用水NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范ASFV：非洲猪瘟病毒（AfricanSwiCt值：每个检测体系内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数（Cyclethreshold）DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）FAM：6-羧基荧光素（6-carboxyfluorescein）HEPES：4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonicacid）MAOPA：磁珠介导的一体化聚合酶扩增（MagneticbeadsmediatedAll-in-OnePolymeraseAmplification）PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphatebufferedsaline）PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReactioROX：羧基-X-罗丹明（Carboxy-X-rhodamine）2本方法核心在于通过微流控卡槽式芯片技术将核酸提取与荧光PCR程参与核酸的吸附、洗涤、洗脱和扩增，实现基于MAOPA技术裂解区域；之后卡盒放入到带有电磁功能、变温功能及实时荧光检测一6.1.4裂解液，按照附录A.3配制。6.1.6针对ASFVB646L基因序列设计的特异性引物和探针，并根据外源性DNA序物和探针。B646L基因参考序列见附录B.1，内标基因参考序列6.1.7阳性对照样品：阳性重组大肠杆菌菌液，参考附录B6.1.9内标样品：内标重组大肠杆菌菌6.1.10其它商品化试剂：石蜡、硅油、荧光PCR预6.2.2离心管（1.5mL，无核酸酶）。38样品采集、处理和储存样品采集及运输按照NY/T541的规定执行。采集猪血清、血浆、口鼻拭子等液体8.3.1应在二级生物安全柜中处理检测前样品。8.3.2血清、血浆样品：无需处理，可直接吸取上8.3.3唾液样品：充分涡旋震荡30s尽力挤压拭子后，5000r/min离心），8.3.6精液样品：反复冻融3次，5000r/min离心2min，吸取上清待检。9.1扩增反应液的配制9.2微流控检测卡盒的制备9.2.1样品裂解区4括但不限于硅油等）封闭该区，通过塑性材料活塞实现对9.2.2洗涤液Ⅰ区使用自动化灌装设备或手动将140μL洗涤液Ⅰ灌装至空卡9.2.3洗涤液Ⅱ区9.2.4扩增反应区9.3.1加样水平摇晃，使卡盒内液体充分混匀，转移至检测区，每轮样品检测设阴9.3.2测定58°C30s，共45个扩增循环，于每一循环退火结束时收9.4废弃物及剩余样品无害化处理检测实验结束后，使用过的微流控检测卡盒和一次性废弃物（例如用过的吸头）应用1%次氯酸钠用有效消毒剂对实验室内可能接触到的设备设施和环境进行全面阳性对照显示检测结果为阳性，同时FAM通道Ct值≤30并出现典型的扩增曲线，且内标ROX通道Ct值≤30并呈现典型的扩增曲线；阴性对照显示检测结果为阴性，同时FAM通道无Ct值且无典型的扩增曲线，且内标ROX通道Ct值≤30并呈现典型的扩增曲线，则判为试验成立。否则试验不成立，应分5当阳性对照的FAM通道和内标ROX通道均出现典型的S型扩增曲线且Ct值≤30，同时阴性对照的待检样品FAM通道Ct值＜36并呈现典型的扩增曲线，ROX通道Ct值≤30并呈现典型的扩待检样品FAM通道无Ct值且无典型的扩增曲线，ROX通道Ct值≤30并呈现典待检样品FAM通道36≤Ct值≤45并呈现典型的扩增曲线，ROX通道Ct值≤30并呈现典型的扩增曲线，判为疑似；对疑似样品按原条件进行复检，结果FAM通道Ct值≤45并呈现典型的扩增曲线，ROX通道Ct值≤30并呈现典型的扩增曲线，则判为阳性；否6A.1洗涤液Ⅰ称取15.138g三羟甲基氨基甲烷、100g聚乙二醇，加灭菌纯称取486.59g异硫氰酸胍、26.8g无水乙酸钠、60mLTritonX-100、2mL乙酸，加灭菌纯化水定容至1L，混合均匀，0.22μm滤膜过滤除菌。2A.4磁珠用商品化HEPES缓冲液（1mol/L）将商品化磁珠（1μm核酸提取硅7B.1非洲猪瘟病毒B646L基因片段参考序列（GenBankAccessionNo.MK333185'-ATGGCATCAGGAGGAGCTTTTTGTCTTATTGCTAACGATGGGATGGCCCAAGACTTGCTGAATAGCAGGATCTCTAACATTAAAAATGTGAACAAAAGACCCGATCCCGAACCCACTTTGAGTCAAATCGAAGAAACACATTTGGTGCATTTTATTAAGCCTTATGTTCCAGTAGGGTTTGAATACAATAAAGTACGCCCGCATACGGGTACCCCCTTGGGAAACAAGCTTACCTTTGGTATTCCCCAGTACGGAGACTTTTTCCATGATCCATCATATATTGGGTGCATGTCATTCATCCTGGCAGGATGCTCCGATTCATGGGGGCCCATGGGCAGCTTCAAACGTTTCCTCGCAACGGATATGACTGGGACAACCAACTTAGAGGGCGCCGTTTACACGCTTGTAGATCCTTTTGGAAGACCCATTGTACCCGGCATGCGTACCGAAACTTGGTTTACTACTGCGAATACCCCGGAGAACGACTTTATGAAATTCGATGTAAATGGAAATTCCCTAGACGAATATAGTTCGGATGTCACAACGCTTGTTGCATCCCAGGGGATAAAATGACTGGATATAAGCACTTGGTTGGCCAGGAGGTATGGAACCAGTGGCCCTCTCCTATGCAACATTCATGATTTGCACAAGCCGCACCAAAGCAAACCTCTTACCGATGAAAATGATACGCAGCGAACGTGTAGCCATACCAACCCGAAATTTCTATTTTCCCGAGAACTCTCACAATATCCAAACAGCAGGTAAACAAGATATTACTCCTATGCAACGTATCTGGACATAAGACGTAATGTTCATTACAGCTGTAATGGACCTCAAACCCCTATCAGCCCCCTCTTGCGCTCTGGATTAAGTTGCGCTTTTGGTTTAATGAGAACGTGAATATTCCCTCAGTATCCATTCCCTTCGGCGAGCGCTTTATCACCATAAAGCTTGCATCGCAAAAGGATTTGGTGAATGAATTTCCTGGACTTTTTGTACGCCAGTCACGTTTTATAGCTGGACGCAATATACGCTTTAAACCATGGTTTATCCCAGGAGTCATTAATGAAATCTCGCTCACGAAATGAACTTTACATCAATAACCTGTTTGTAACCCCTGAAATACACAACCTTTCGCTTTTCGCTGATACGTGTCCATAAAACGCAGGTGACCCACACCAACAATAACCACAAAACTAATGTCTGCTCTTAAATGGCCCATTGAATATATGTTTATAGGATTAACATCTCCGATCAAAATCCTCATCAACACCGAGATTGGCACAAGTTCGGACATGTTATTATGCAGCCCACTCACCACGCAGAGATAAGCTTTCAGGATAGAGATACAGCTCTTATGTTCATCTATATCTGATATTAGCCCCGTTACGTATCCGATCACATACCTATTATTAAAATCCGTAACTGCTCATGGTATCAATCTTATCGATAAATTTCCATCAAAGTTCTGCAGCTCTCCCTTCCACTACGGAGGCAATGCGATTAAAACCCCCGATGATCCGGGTGCGATGATGTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATACCAACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGATTTTATATTAGTTGGGACACGGATTACGTGGGGTCTATCACTACGGCTGATCTTGTCTGCTATTAACTTTCTTCTTCTTCAGAACGGTTCAGCTGTGCTGCGTTACAGTACCTAA-3'注：下划线部分为连入pUC57载体中的包含的目标检测片段部分，粗体为引物建重组大肠杆菌，重组大肠杆菌进行PCR鉴定和测序分析，结果8避免反复冻融，12个月内有效。9肠杆菌按0.5%（ml/ml）的比例接种于含有氨苄青霉素（100μg/ml）的LB培养基中，ASFVB646L基因和内标基因引物和探ASFVB646L基因和内标基因的引物、探针的名称与序列见表D.1。表D.1ASFVB646L基因和内标基因引物和ASFV检测上游引物5,-GCCTTATGTTCCA