16%井冈•噻呋酰胺悬浮剂编制说明征求意见稿

第页PAGE三、检测方法确认1有效成分井冈霉素A质量分数分析方法确认1.1分析方法介绍1.1.1方法提要试样用缓冲液溶解，以缓冲液+甲醇为流动相，使用ODS2-C18（5µm）为填充物的不锈钢柱和紫外检测器。在210nm波长下对16%井冈·噻呋酰胺悬浮剂剂中的有效成分井冈霉素A进行高效液相色谱分离和测定，外标法定量。1.1.2试剂、溶液及标准品甲醇，色谱纯，赛默飞世尔公司；磷酸氢二钠，分析纯，天津市光复精细化工研究院；磷酸，优级纯，南京化学试剂股份有限公司；实验室用水，哇哈哈纯净水；缓冲液：0.36g磷酸氢二钠蒸馏水定容至1000mL，磷酸调pH到6.8~7.2；井冈霉素A标样，含量95.5%，国家农药质量监督检验中心（沈阳）。1.1.3仪器及参数安捷伦1260高效液相色谱仪，美国安捷伦仪器公司；SECURA125-1CN电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；KQ-300E超声波清洗机,昆山超声仪器有限公司。色谱柱:250mm×4.6mm（i.d.）不锈钢柱，内装HpersilODSC18填充物，粒径5μm；流动相：缓冲液（称取0.36g磷酸氢二钠用水定容至1000mL，磷酸调pH到6.8～7.2）：甲醇=97:3；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：5µL检测波长：210nm保留时间：井冈霉素A约10min；1.1.4有效成分井冈霉素A质量分数的测定步骤1.1.4.1标样溶液与试样溶液的配制标样溶液：准确称取含井冈霉素A约0.1g的标样（精确至0.0002g）置于50mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀。用移液管移取上述溶液5mL于50mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，备用。试样溶液：准确称取约含井冈霉素A0.1g的试样（精确至0.0002g）置于50mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀。用移液管移取上述溶液5mL于50mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，备用。1.1.4.2有效成分质量分数的测定1.1.5计算将测得的两针试样溶液以及前后两针标样溶液中有效成分井冈霉素A的峰面积分别进行平均。试样中有效成分井冈霉素A的质量分数（%）按下列公式计算：式中A1——标样溶液中有效成分井冈霉素A峰面积的平均值；A2——试样溶液中有效成分井冈霉素A峰面积的平均值；——井冈霉素A标样的质量分数，%；m2——试样的质量，g；m1——井冈霉素A标样标样的质量，g；1.1.6允许差质量分数的两次平行测定结果之相对差，应不大于5%，取其算术平均值作为测定结果。1.2有效成分井冈霉素A质量分数分析方法确认及评价1.2.1方法特异性本试验采用HPLC-DAD的紫外吸收光谱鉴别井冈霉素A，采用峰纯度分析法来判断某色谱组分的分离情况，当井冈霉素A色谱峰峰纯度大于990，即可认为该有效成分处无其他物质干扰，所测该组份为纯组分，符合定量分析的要求。用色谱工作站采集标样溶液和试样溶液中有效成分井冈霉素A（RT约8.3min）在190-400nm范围内的紫外吸收光谱图。16%井冈•噻呋酰胺悬浮剂的有效组分紫外吸收光谱图与标样溶液中各对应组分的紫外吸收光谱图一致，最大紫外光谱吸收值无差异。结果表明，该16%井冈•噻呋酰胺悬浮剂的有效成分是井冈霉素A。同时对各有效成分的色谱峰进行光纯度分析，用匹配值与固定阈值990进行比较，均满足大于990，满足定量分析要求。结果列于“表1有效成分井冈霉素A定量测定方法特异性测试结果”。表1有效成分井冈霉素A定量测定方法特异性测试结果有效成分有效成分保留时间（min）匹配值测试结果井冈霉素A试样溶液8.3371000通过标样溶液8.3531000通过图1井冈霉素A标样峰纯度图2井冈霉素A标样紫外特异性图3试样中井冈霉素A峰纯度图4试样中井冈霉素A紫外特异性1.2.2线性相关性测定采用已知含量的井冈霉素A标样分别配制成5个已知浓度的梯度标样溶液（其中包含分析方法2.1.4中的浓度），以井冈霉素A浓度（mg/L）为横坐标，以井冈霉素A峰面积为纵坐标，绘制井冈霉素A含量测定线性关系图，并进行线性回归获取线性方程和相关系数。结果列于表2井冈霉素A含量测定方法确认-线性试验结果，线性方程为：Y=1.4478X+4.2343，线性范围内相关系数R为：0.9984，大于0.99，表明该分析方法线性关系良好。表2井冈霉素A含量测定方法确认-线性试验结果标样溶液序号标样质量（g）标样溶液浓度(mg/L)峰面积峰面积平均值相关系数r线性-10.0743141.17206.8207.50.9984208.2线性-20.0906172.14254.4253.0251.6线性-30.1012192.28291.6290.6289.6线性-40.1106210.14310.8311.2311.6线性-50.1208229.52335.7334.4333.1线性方程为：Y=1.4478X+4.2343图5井冈霉素A含量测定线性关系图1.2.3精密度试验对同一16%井冈·噻呋酰胺悬浮剂试样，按照上述分析方法，连续进行5次平行测定，分别计算有效成分井冈霉素A含量、平均值及相对标准偏差。若相对标准偏差小于2（1-0.5logC）×0.67（C为样品中的有效成分含量），说明该分析方法精密度良好。精密度试验结果列于表3井冈霉素A定量测定方法确认-精密度试验结果中，结果表明有效成分井冈霉素A色谱定量分析方法精密度均能满足定量分析要求。表3井冈霉素A定量分析方法确认-精密度试验结果序号试样

质量

(g)

峰面积峰面积平均值标样质量(g)

峰面积峰面积平均值含量，%

平均值，%RSD(%)10.7705303.9304.30.1058303.9303.713.0713.110.26304.7303.520.7544298.4299.2303.6303.413.14300.0303.230.7648302.7303.8303.5303.513.11304.9303.540.7809309.2308.4302.9303.213.09307.6303.550.7768307.8307.2303.5302.713.13306.6301.9可接受RSD(%)2（1-0.5logC）×0.67=0.912.2.4准确度试验（添加回收率）按照配方比例要求，将除原药以外的所有助剂按制剂同样比例混匀，作为制剂空白。然后，在一定量的制剂空白中添加井冈霉素A标样，合成5个组成与16%井冈·噻呋酰胺悬浮剂相似的模拟试样，作为准确度试验样品溶液，标样溶液采用线性试验中3号溶液，再按照上述分析方法进行测定，通过准确度试验溶液中各有效成分井冈霉素A的测得值和实际添加值计算回收率（%）。测定结果列于表5井冈霉素A定量分析方法验证-准确度试验中，结果可见，回收率均在98～102%之间，满足NY/T2887-2016农药产品质量分析方法确认指南中制剂有效成分分析的回收率要求，表明该分析方法准确度良好。表4井冈霉素A定量分析方法准确度试验溶液配制表溶液编号添加标样质量(mg)空白制剂质量（g）经过霉素A标样标样折纯准确度-10.10080.09630.7655准确度-20.10760.10280.7525准确度-30.10660.10180.7514准确度-40.10750.10270.7412准确度-50.10230.09770.7466表5井冈霉素A定量分析方法验证-准确度试验结果溶液编号

峰面积峰面积平均值标样质量(g)

峰面积峰面积平均值实测值（g）回收率，%准确度-1292.2291.90.1058303.4303.40.0972100.93291.6303.4准确度-2308.8309.0303.3303.20.1030100.20309.2303.1准确度-3302.2301.6303.9303.70.100398.53301.0303.5准确度-4305.7305.7303.8303.50.101899.12305.7303.2准确度-5291.8290.0303.2303.40.096698.87288.2303.62、有效成分噻呋酰胺质量分数分析方法确认2.1分析方法介绍2.1.1方法提要试样用甲醇溶解，以甲醇+水为流动相，使用以ODS-C18（5µm）为填料的不锈钢柱和可变波长紫外检测器，在波长204nm下，对16%井冈•噻呋酰胺悬浮剂中的有效成分噻呋酰胺进行反相高效液相色谱分离和测定，外标法定量。2.1.2试剂、溶液及标准品甲醇，色谱纯，赛默飞世尔公司；实验室用水，哇哈哈纯净水；噻呋酰胺标样，含量99.0%，国家农药质量监督检验中心（沈阳）；2.1.3仪器及参数Agilent1260高效液相色谱仪，美国安捷伦仪器公司；SECURA125-1CN电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；KQ-300E超声波清洗机,昆山超声仪器有限公司；色谱柱:250mm×4.6mm（i.d.）不锈钢柱，内装HypersiODSC18填充物，粒径5μm；流动相：甲醇:水=75:25（V/V）；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：5µL检测波长：204nm保留时间：噻呋酰胺约5.0min；2.1.4有效成分噻呋酰胺质量分数的测定步骤2.1.4.1标样溶液与试样溶液的配制标样溶液：准确称取噻呋酰胺标样约0.02g（精确至0.0002g）置于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，超声波振荡使试样溶解，冷却至室温，摇匀、过滤，备用。试样溶液：准确称取约含噻呋酰胺0.02g试样（精确至0.0002g）置于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，超声波振荡使试样溶解，冷却至室温，摇匀、过滤，备用。2.1.4.2有效成分质量分数的测定2.1.5计算将测得的两针试样溶液以及前后两针标样溶液中有效成分噻呋酰胺的峰面积分别进行平均。试样中有效成分噻呋酰胺的质量分数（%）按下列公式计算：式中A1——标样溶液中有效成分噻呋酰胺峰面积的平均值；A2——试样溶液中有效成分噻呋酰胺峰面积的平均值；——噻呋酰胺标样的质量分数，%；m2——试样的质量，g；m1——噻呋酰胺标样标样的质量，g；2.1.6允许差两次平行测定结果之相对差，应不大于5%，取其算数平均值，作为测定结果。2.2有效成分噻呋酰胺质量分数分析方法确认及评价2.2.1方法特异性本试验采用HPLC-DAD的紫外吸收光谱鉴别噻呋酰胺，采用峰纯度分析法来判断某色谱组分的分离情况，当戊唑醇色谱峰峰纯度大于990，即可认为该有效成分处无其他物质干扰，所测该组份为纯组分，符合定量分析的要求。用色谱工作站采集标样溶液和试样溶液中有效成分噻呋酰胺（RT约4.5min）在190-400nm范围内的紫外吸收光谱图。16%井冈•噻呋酰胺悬浮剂的有效组分紫外吸收光谱图与标样溶液中各对应组分的紫外吸收光谱图一致，最大紫外光谱吸收值无差异。结果表明，该16%井冈•噻呋酰胺悬浮剂的有效成分是噻呋酰胺。同时对各有效成分的色谱峰进行光纯度分析，用匹配值与固定阈值990进行比较，均满足大于990，满足定量分析要求。表6有效成分定量测定方法特异性测试结果有效成分有效成分保留时间（min）匹配值测试结果噻呋酰胺试样溶液4.55999.12通过标样溶液4.58999.39通过图5噻呋酰胺标样峰纯度图6噻呋酰胺标样紫外特异性图7试样中噻呋酰胺峰纯度图8试样中噻呋酰胺紫外特异性2.2.2线性相关性测定采用已知含量的噻呋酰胺标样分别配制成5个已知浓度的梯度标样溶液（其中包含分析方法2.1.4中的浓度），以噻呋酰胺浓度（mg/L）为横坐标，以噻呋酰胺峰面积为纵坐标，绘制噻呋酰胺含量测定线性关系图，并进行线性回归获取线性方程和相关系数。测定结果列于表7噻呋酰胺含量测定方法确认-线性试验结果，线性方程为：Y=12.738X+8.4895，线性范围内相关系数R为：0.9999，大于0.99，表明该分析方法线性关系良好。表7噻呋酰胺含量测定方法确认-线性试验结果标样溶液序号标样质量（mg）标样溶液浓度(mg/L)峰面积峰面积平均值相关系数r线性-10.0160158.42015.42020.50.99992025.6线性-20.0177175.22244.42248.62252.8线性-30.0202200.02551.22555.02558.8线性-40.0222219.82816.52806.62796.7线性-50.0248245.53130.53135.83141.1线性方程为：Y=12.744X+7.2625图9噻呋酰胺含量测定线性关系图2.2.3精密度试验对同一16%井冈·噻呋酰胺悬浮剂试样，按照上述分析方法，连续进行5次平行测定，分别计算有效成分含量、平均值及相对标准偏差。若相对标准偏差小于2（1-0.5logC）×0.67（C为样品中的有效成分含量），说明该分析方法精密度良好。精密度试验结果列于表8噻呋酰胺定量测定方法确认-精密度试验结果中，结果表明两种有效成分色谱定量分析方法精密度均能满足定量分析要求。表8噻呋酰胺定量分析方法确认-精密度试验结果序号试样

质量

(g)

峰面积峰面积平均值标样质量(g)

峰面积峰面积平均值含量，%

平均值，%RSD(%)10.62912511.62514.20.01982540.82543.43.083.080.622516.82546.020.65122588.42584.32543.52542.23.062580.22540.830.61622486.52483.62538.62540.23.112480.72541.840.66062644.62641.22536.42536.33.092637.82530.250.69782764.32769.42532.62534.03.072774.52535.4可接受RSD(%)1.132.2.4准确度试验（添加回收率）按照配方比例要求，将除原药以外的所有助剂按制剂同样比例混匀，作为制剂空白。然后，在一定量的制剂空白中添加噻呋酰胺标样，合成5个组成与16%井冈·噻呋酰胺悬浮剂相似的模拟试样，作为准确度试验样品溶液，标样溶液采用线