【金黄色葡萄球菌检测方法的研究的国内外文献综述5500字】

–PAGE28–金黄色葡萄球菌检测方法的研究的国内外文献综述根据研究，金黄色葡萄球菌的检测手段主要有如下三类:传统培养法，国家标准方法为代表；以抗原抗体反应为基础的免疫学检测方法,酶联免疫吸附法(Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)、免疫胶体金技术(Immunecolloidalgoldtechnique)以及免疫荧光技术(Immunofluorescencetechnique)为代表;以DNA为基础的分子生物学检测方法,核酸分子杂交技术(Nucleicacidmoleculehybridization)、聚合酶链式反应(PolymeraseChainReactio，PCR)、环介导恒温扩增技术(lop-mediatedisothermalamplification，LAMP)等为代表。1.1传统培养法目前在我国检测食品中金黄色葡萄球菌采用的是传统检测方法，主要是根据GB4789.10-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》总共分为四步骤，所需时长为78h。如图1-1所示。图1-1国家标准GB4789.10-2010方法Fig.1-1ThemethodofGB/T4789.10-2010第一步，先后在75％的氯化钠肉汤培养基、血琼脂平板Baird-Parker平板上接种待测样品。第二步，挑取疑似金黄色葡萄球菌的菌落染色后进行镜下形态检查。第三步，进行生化实验比如血浆凝固酶试验等。第四步，利用标准阳性菌株作为检测的对照组进行检测。定量检测方法：在10％氯化钠胰酪胨大豆肉汤上接种稀释好的三个梯度的稀释液，分别在每个梯度都做3管进行平行对比，分别培养数天后用接种环转移到到Baird-Parker平板上生长，最后挑选出生长典型的菌落，并且利用MPN表的特征对照检查出金黄色葡萄球菌REF_Ref9310\n\hREF_Ref9316\n\h[21-23]。以上传统培养法虽然准确度较高，最低检出限可达到零，但是步骤繁琐，检测时间长，随着人们对食品安全的关注度不断提升，传统检测法耗时长、操作复杂且灵敏度低等，已经远远不能满足现代检测工作的需要，所以建立一种准确快捷便利的食品安全检测技术是十分迫切和必要的。1.2免疫学检测方法免疫学方法通过抗原-抗体特异性结合的检测技术，此方法较传统培养法具有较高灵敏度高，较强特异性的优势。但是该类方法也有一定的局限性，比如检测结果容易受到抗体特异性不稳定、抗体吸附能力较弱以及基质背景颜色过深等干扰因素的影响，不能满足种类繁多、组分复杂和目标菌含量低的食品样品的检测要求。（1）酶联免疫技术酶联免疫技术(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay,ELISA)的检测原理是利用能够吸附在固定载体上特异性抗原（或抗体）具有的免疫活性，进行免疫酶标染色显色后，分析有色产物的量从而来确定检测物的含量，由于酶的催化作用提高反应效率，从而间接放大了反应结果达到提高反应的灵敏度的目的REF_Ref9310\n\hREF_Ref9316\n\h[24-26]。ELISA技术在食品分析中的应用有很多，比如检测食品中的营养物质、微生物、农药残留以及重金属污染等。目前，大多数实验是利用ELISA技术检测金黄色葡萄球菌分泌的肠毒素。尽管ELISA技术具有较高的灵敏度和较强的特异度，但是由于抗原、抗体以及联免疫试剂等生物制剂的储存时间要求严格，存贮环境的条件苛刻，如有保存不当会造成该试剂的不稳定性，从而造成检验中的结果偏差。同时，由于反应试剂可能会与结构相似的化合物发生交叉反应，所以该技术不能够用于多种组分的同时检测。（2）免疫胶体金技术免疫胶体金技术(Immune

colloidal

gold

technique,GICT)属于免疫标记技术中的一种，利用胶体金标记抗原（抗体）从而追踪目标病原菌。胶体金可通过静电作用与抗体以非共价键形式结合，并利用抗原-抗体特异性结合的原理，追踪标记物从而检测病原菌。杜玉萍REF_Ref11720\n\h[27]等人建立了胶体金免疫层析试纸法，并在1小时内完成了金黄色葡萄球菌的检测同时检出限度为1×106cfu/mL。刘晶REF_Ref12056\n\h[28]等人利用胶体金免疫层析技术研发出方便携带的免疫层析测试卡检测金黄色葡萄球菌的肠毒素α和β，检测灵敏度分别为10ng/mL和1ng/mL，整个检测过程在10min内完成，可以满足现场快速检测的要求。胶体金技术的优势在于检测时间短、成本低廉、无需复杂仪器。但利用该方法检测食源性病原菌灵敏度较低，所制备的多克隆抗体特异性无法保证，容易发生交叉反应。（3）免疫荧光技术免疫荧光技术(Immunofluorescencetechnique)又称为荧光抗体法，其原理是利用已被荧光标记的已知抗原（抗体）与目标抗体（抗原）发生免疫结合反应，从而标记待检测的病原体，并且通过荧光分析达到定量检测的目的。免疫荧光技术分为:直接检测法和间接检测法。直接检测法是直接用荧光物质标记已知抗原（抗体）通过结合检测待检病原微生物；而间接检测法是先让已知的抗原（抗体）与待测样品发生反应，通过洗涤后，向两者的结合物中加入荧光染料标记物的二抗。通过测定一抗含量从而间接测出样品含量。1981年，朱广发REF_Ref12448\n\h[29]等人利用免疫胶体金技术同位素标记法完成了金黄色葡萄球菌抗原（抗体）的检测，从而实现了定量检测。KhanREF_Ref13219\n\h[30]等将免疫荧光技术与联免疫技术相结合检测金黄色葡萄球肠毒素，在用荧光微量滴定器检测荧光信号强度，对金黄色葡萄球菌肠毒素的检测精度可以达到100pg/孔。为了提高免疫荧光技术的检测精度，科研人员将免疫荧光技术与其他技术相结合发明了抗体-直接表面滤膜荧光测定、微菌落免疫荧光测定、PCR-荧光测定技术、酶联免疫荧光测定技术等等。法国生物梅里埃公司研发了自动荧光免疫分析系统，通过分析荧光标记酶的含量从而实现定量测定。虽然免疫荧光检测技术容易进行操作，且有较高的灵敏度，但购买仪器所需的昂贵费用，限制了在经济条件较差的基层推广使用。（4）免疫磁性微球技术免疫磁性微球技术（Immunomagnetic

Microspheres,IMMS）或称免疫磁珠（Immunomagnetic

Beads,IMB），是表面结合有单克隆抗体的磁性微球。免疫磁性微球技术是在具有磁性的微颗粒表面偶联上特异性的抗体，利用这些特异性的抗体与目标抗原如致病性微生物、病毒等发生特异性结合，然后在外加的磁场中，这些表面含有目标抗原的磁性粒发生定向移动，与样品混合液相互分离，聚集在某一磁极的内壁，然后再弃去检测样品的液体，撤消磁场，将富集在磁极的磁性微球颗粒进行收集，之后再利用光染料进行染色检验或者进行PCR检验。免疫磁性球技术在食品中致病性微生物如大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等的检测中也有应用。PayamREF_Ref14401\n\h[31]等人检测牛奶中的金黄色葡萄球菌，采用的方法就是免疫磁性分离和酶联免疫吸附相结合的方式，在3h以检测最低限度为105cfu/ml的牛奶样品。刘细霞REF_Ref14698\n\h[32]利用金黄色葡萄球菌所特有的SPA(金黄色葡萄球菌A蛋白)可与IgG(免疫球蛋白G）的Fc片段发生特异性结合，制备金属螯合免疫磁性微球，用于分离金黄色葡萄球菌的SPA蛋白，进行免疫印记分析来检测金黄色葡萄球菌，检测限达到100cfu/ml。虽然免疫磁性微球技术以检测时间短，检测精度高而得到广泛应用，但是由于其需要制备相应的抗体，因此检测成本较高。1.3生物学检测方法随着食源性病原菌的检测进入分子水平，一些病原菌的特有核酸序列不断被研究者破解，形成了以核酸分子杂交技术、聚合酶链式反应（PCR）、环介导等温扩增技术（LAMP）等为代表的分子生物学检测方法，来这些方法可以通过计引物、探针、优化条件来提高检测方法的灵敏度、特异性，从而实现多种病原体的快速检测。（1）核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术(Nucleicacidmoleculehybridization)又称核酸探针技术或者基因探针技术。从1986年我国就有从事核酸分子杂交技术的相关研究，截止目前该研究成果已经应用在检测多种病原微生物上，比如金黄色葡萄球菌的测定、大肠杆菌的测定、沙门氏菌的测定等等。该技术检测微生物的依据是核酸分子杂交，核酸分子杂交技术的原理是DNA片段或者RNA片段作为探针，并且对探针进行放射性同位素的标记或染色标记等可识别的标记方法，利用碱基互补配对原则，使被标记的探针与目标核酸序列片段进行互补，再进一步通过原位杂交技术或者斑点杂交技术与已知核酸序列进行杂交从而判定目标片段与他们的同源程度。陈彬，黄晓蓉REF_Ref14874\n\h[33]等人利用Accuprobe基因探针技术，测样品中的金黄色葡萄球菌，并且检测的灵敏度为10cfu/mL，同时经过增菌操作以后食品中的金黄色葡萄球菌鉴定时间大大缩短了将近一半的时间。彭奕冰，毛恩强REF_Ref14953\n\h[34]等人利用金黄色葡萄球菌特异性热核酸femA基因核酸作为探针对鼠样中金黄色葡萄球菌进行了检测，同时与核酸斑点杂交检测做对比，检测结果的符合率达到100％,说明该方法的检测准确性较高。核酸探针的特异性强，但灵敏度不高；检测不仅需要昂贵的分析设备，而且每检测一种菌就要制备一种探针成本十分高；同时对操作人员的要求十分高，现场操作又较为复杂，不利于现场的快速筛查与检测。（2）聚合酶链式反应(PCR)聚合酶链式反应(Polymerase

Chain

Reaction,PCR)，是Rary

B.

MullisREF_Ref15057\n\h[35]等人利用的体外酶促技术达到基因扩增的目的，应用常规PCR技术检测食源性病原菌，相比于传统培养法具有特异性强、简单快速、灵敏度高的特点。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。Khan

MAREF_Ref15136\n\h[30]等人利用常规PCR技术检测受到感染绵羊牛奶中的金黄色葡萄球菌，结果显示了100％的特异性，随着目标DNA洗涤次数的增加，灵敏度也从53％增加到90％。但是常规PCR具有易受食品复杂基质以及环境影响、靶序列或扩增产物导致交叉污染以及不合适的引物设计等缺点导致假阳性或者假阴性。多重PCR(

multiplex

PCR)技术是进一步升级的新技术，近年来越来越多地被应用于食源性病原菌的检当中。许一平，成炜REF_Ref16448\n\h[36]等人利用多重PCR技术从羊奶路和乳制甜品样品中分离出金黄色葡萄球菌和肠毒素。但是多重PCR技术对引物设计的要求非常高，而在对食品微生物进行检测时，会发生引物与非目标序列的非特异性结合，很有可能出现假阴性和假阳性。实时荧光定量PCR(Real-time

PCR)技术顾名思义是利用荧光标记PCR产物从而实现定量测定的一种技术。与传统PCR检测技术相比较，实时荧光定量PCR技术检测所花费时间更短，检测效率更高，交污染风险更小。但是该方法也有一定的局限性，比如PCR产物呈指数增长、发射光谱重叠、假阴性结果增加等。本研究将使用普通PCR技术作为对照组实验。1.4其他检测方法(1)生物传感器:生物传感器的分子识别原件包括生物细胞、抗体、抗原、活性酶等生物活性物质，通过信号转换器和电子测量仪器进行分析。待测样品如果与分子识别原件相结合，并产生生物信号，这些信号会通过生物转换器转换为电信号，使用检测仪是不仅可以检测这些电信号同时还会放大信号，更容易显示结果，从而实现定量测定REF_Ref17249\n\h[37]。生物传感器的优势是操作简单且原件可以重复利用，同时该方法的灵敏度和准确度较高REF_Ref17330\n\h[38-39]。但是，目前该技术的检测所需费用较高，并且该技术还不够成熟仍处在研究阶段，因此不便大加推广此技术(2)基因芯片技术:近几年，基因芯片技术的迅速崛起，说明将基因表达与半导体微电子学等物理学科和激光、化学染料等多领域学科有机结合是今后的发展趋势，也是今后的革命性技术研究方向，要更加深入研究，更加广泛的结合生命科学与信息科学REF_Ref17846\n\h[41-42]。目前基因芯片主要用于食品原料鉴定和食品成分分析等方向的检测，该技术有助于食品卫生监督和食品质量控制工作的有效开展REF_Ref17967\n\h[43-44]。但要该技术还有特异性不高、检测费用较高、样品制作等复杂的问题有待解决，因此限制了推广和应用。(3)电阻抗法:电阻抗法是近年发展起来的一项生物学技术。其原理培养基中的脂类化合物、大分子蛋白质等电惰性物质，然而细菌在培养基上生长代谢时，这些物质会被分解成盐类、水钠等小分子的电活性物质，从而改变了培养基的电阻增加了导电性，通过物理的电阻检测就可以间接的判断培养基物质代谢情况，从而推断出相应生产的细菌REF_Ref18561\n\h[45]。据了解该方法目前可以应用在细菌总数的确定、金黄色葡萄球菌的测定、大肠杆菌的测定等方面这REF_Ref18623\n\h[46-47]。参考文献TongS,DavisJS,EichenbergerE,etal.StaphylococcusaureusInfections:Epidemiology,Pathophysiology,ClinicalManifestations,andManagement[J].ClinicalMicrobiologyReviews,2015,28(3):603-661.东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001,246-247.方太松,王军,王晔茹,吴瑜凡,刘阳泰,王翔,董庆利.我国熟肉制品中金黄色葡萄球菌污染状况Meta分析[J].生物加工过程,2020,1803:386-391.陈琼,董华夏,戴小芳,刘萍,晏涛,郦娟.畜禽肉中金黄色葡萄球菌活菌可视化LAMP检测方法的研究[J].食品工业科技,2020,4120:235-240+245.QuiteriaJ,DCid,SanzR,etal.InfluenceofageofthedonorsheeponthephagocytosisofStaphylococcusaureussubspeciesanaerobiusandSaureusbyneutrophils-ScienceDirect[J].ResearchinVeterinaryScience,1996,61(3):231-233.李琼琼,范一灵,宋明辉,施春雷,杨美成.食源性金黄色葡萄球菌肠毒素及其检测方法[J].食品安全质量检测学报,2016,702:555-560.胡金强,雷俊婷,白艳红,魏向珂,景建洲,高辉,孙新城,董彩文,耿尧,姜春鹏.食品中金黄色葡萄球菌PCR-ELISA检测技术建立[J].食品工业科技,2016,3720:63-67.

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