T∕CVMA 338-2026 细粒棘球绦虫物种及基因型PCR鉴定技术规范

中国兽医协会发布I请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。区兽药饲料监察所、新疆农业大学、中农华威制药股份有细粒棘球绦虫（Echinococcusgranulosussensulato）是一个由多个物种和基因型组成的寄生虫复合虫病在高海拔、寒冷、潮湿、高降雨地区棘球蚴感染被犬科动物粪便中虫卵污染的水源或食物而感染。本标准涉及四个主要物种：狭义型细粒棘球绦虫防控部门及兽医诊断实验室提供标准化的技术指导，推动囊1细粒棘球绦虫物种及基因型PCR鉴定技术规范本文件规定了运用限制性片段长度多态性-聚合酶链式反应（RFLP-PCR）和多重聚合酶链式反应（MultiplexPCR）技术鉴定细粒棘球绦虫物种GB/T6682分析实验室用水规格和NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范4缩略语COX1：细胞色素c氧化酶亚基I（CytochromecoxidaCOX2：细胞色素c氧化酶亚基II（CytochromecoxidasesubElp：埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白样蛋白（Ezrin-radixin-moesin-likeproG1/G3：狭义细粒棘球绦虫，细粒棘球绦虫G1基因型/G3基因型（Echinocstricto）G4：细粒棘球绦虫G4基因型（EchinococcusgG5：细粒棘球绦虫G5基因型（EchinococcusgG6/G7：细粒棘球绦虫G6/G7基因型（EchinococcusgranulG8/G10：细粒棘球绦虫G8/G10基因型（EchinococcusgranuND1：NADH脱氢酶亚基I（NADHdePCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）RFLP：限制性片段长度多态性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism）25.2样本收集5.3样本形态学鉴定6.1.32×TaqPCRMix（商品化试剂）。6.1.4限制性内切酶AluI（商品化试剂）。6.1.750×TAE缓冲液（商品化试剂）。6.1.91×TAE缓冲液，配制方法见C.2。6.1.11阳性对照：重组质粒，制）：36.4.1将保存液中的成虫（灭活）、虫卵（灭活）、原头蚴、囊壁各取0.5mg，6.4.7弃去收集管中液体，12000r/min离心2min6.5.2反应程序。PCR反应程序见附录F.2。4使用COX1基因引物对样本DNA进行扩增后，运用限制性内切酶AluI对PCR产物进行酶切AluI限制性内切酶酶切序列位点见表1，酶切具体操作流程及酶切反应体系见附录G.1。AluI3'…TC^GA…5'），7.5.2反应程序。多重PCR反应程序见附录H.2。5若扩增条带为110bp、124bp和426），6样本采集A.1采集注意事项肠，肠壁无杂质，显微镜观察虫体完整，状态A.2囊壁采集b)若包囊完整且充满液体，用一次性剪刀或手术刀，借助镊子切开囊壁，使囊液流出。将排空A.3原头蚴采集A.4成虫采集a)将新鲜小肠纵向剪开，可借助放大镜观察附着在肠壁上的成b)从装有保存液的试管中取出虫体，放入新试管；A.5虫卵采集7呈卵圆形，长32μm~36μm，宽25μm~3虫体为圆形囊状球体，大小均匀，4个吸盘和顶突内陷，保护着数十个小钩包囊囊径小于0.5cm，呈小白点状，有些囊径大于1cm的包囊挤压脏器，里8溶液配制将无水乙醇倒入盛有去离子水的容器中，按7:3体积比充分混C.21×TAE电泳缓冲液取10mL50×TAE电泳缓冲液，加去离子水至490mL，即为500mL的1×TAE电泳缓冲液。称取1.0g琼脂糖于100mL1×TAE缓冲液中，加热融化后充分摇匀，待冷至509TTTTTTGGCCATCCTGAGGTTTATGTGTTGATTTTGCCTGGATTTGGTATAATTTTGTTTGAGTATTAGTGCTAATTTTGATGCGTTTGGGTTCTATGGGTTGTTGTTTGCTATGTTTTCTATAGTGTGTTTGGGTAGCAGGGTTTGGGGTCATCATATGTTTACTGTTGGGTTGGATGTGAAGACGGCTGTTTTTTTTAGCTCTGTTACTATGATTATAGGGGTTCCTACTGGTATAAAGGTGTTGTTATATATGTTGTTGAATTCGAGTGTTAATGTTAGTGATCCGGTTTTGTGATGGGTTGTTTATAGTGTTGTTTACGTTTGGGGGAGTTACGGGTATAGTTTTGTCTGCTTGTGTGTTAGATAATTTGCATGATACTTGGTTTGTGGTGGCTCATTTTCATTATGTTATGTCG注：为细粒棘球绦虫（G1/G3基因型）COX1线粒体基因阳性序列（GenB），TGGTCGTCTTAATCATTTGTTTTTTTGTCCTTCTCAACATGGGTCTTTTGTTGGTTGAATTGTGTGGTGTTAATCATACAGTTATGCCTAT），GCTTATTTAGGATCCCAATGCCGAAAAACCGGAAGACTGGGTAGATGAGGCCGACCCAGACGATAGGAAGCCCGATGACTGGGATCAGCCCAAGACCATTGTAGATAAAACAACCGGAAGACTGGAACGAAGAAACGGATGGCGAGTGGACGGCTCCCATGATTCCTGATTATAAGGGTGAATGGAGTCCCAGGATGATACCAAACCCTGCTTACAAGGGAACCACCACAGATTCCTAATCCAGATTACTTTGAGGACGATGAACTCTATGCTCGCACTACATTGGTCTTGACCTCTGGCAGGTGAAGTCTGGGACAATTTTCGACAACTTTATCGTTTCGATGTTTCTGAATGTCAAGCCCACGCTGAGCACTGGCAAAAAC注：为细粒棘球绦虫（G4基因型）CAL核基因阳性序列（GenBankAccessionN），GTTGGGTTGGATGTTAAGACGGCTGTTTTTTTTAGTTCTGTTACTATGATTATACTGGTATAAAGGTTTTTACTTGGTTGTATATGTTGTTAAATTCGAATGTTAATAAGAGT注：为细粒棘球绦虫（G4基因型）COX1线粒体基因阳性序列（GenBankAcces），CTGCAGAGGTTTGCCGATTTGTTGAAGTTAGTAATTAAGTTTAAGAATTTTTCGTAGGTATGTTGGTTTATTTGGTGTTTTGTTGTTGATAGTTTTGGTTGTGGTGTATTCGTTTATTTATGGTAGATATTATAGAGTTAGTTATAGTATGCTTTCTGTGTTATGATTTTTAGCTGCTTATTTCTAGGTATTCCTTGTTGTGTACTGGTTGGGGTAGTTACAATAGTTATTCTTTTTTGAGGTTCGATGTGCTTTTGGATCTGTTAGGTTTGAGGCTTGTTTTATGTGTGTGGTTATTTTTTGT注：为细粒棘球绦虫（G6/G7基因型）ND1），AGGTCTTTCCAGATCCTGAGTTGAGCAGACTAACCGCTTCGTTGTCTCCTCCACTTTT注：为细粒棘球绦虫（G8/G10基因型）ELP线粒体基因阳性序列（GenBankAccess），利用超微量分光光度计测定阳性重组质粒浓度，并按下面公式将浓度换算成拷贝数，DNA拷贝/μL=[6.02×1023×DNA浓度(ng/μL)×10-9]/(DNA碱基数×660)。作为阳性对照时，选取浓度为104拷贝/μL。PCR引物的名称与序列见表E.1。表E.1PCR引物序列EgCOX1-RPCR反应PCR反应体系见表F.1。表F.1PCR反应体系体积(μL）2×TaqPCRMix11