西安电子科技大学《分析化学》课件-第8章光度分析法

1第8章光度分析法8.1吸光光度法的基本原理8.2光度分析的方法和仪器8.3吸光光度法的灵敏度与准确度8.4显色反应与分析条件的选择8.5吸光光度法的应用8.6紫外可见分光光度法在有机定性分析中的应用8.7分子荧光与分子磷光分析法西安电子科技大学《分析化学》28.1

吸光光度法的基本原理

特点灵敏度高：测定下限可达10-5～10-6mol·L-1,10-4%～10-5%准确度能够满足微量组分的测定要求：相对误差2～5％（1～2％）操作简便快速应用广泛

吸光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。3I0It光强的测量—分光光度计分光光度法的应用：定量测定与定性分析物质对光有选择性吸收—准备知识

光强的减弱与物质浓度的关系？—朗伯-比尔定律测量光强度的减弱48.1.1光的基本性质

(电磁波的波粒二象性)

c－真空中光速2.99792458×108m/s ~3.0×108m/s

－波长，单位：m,cm,mm,

m,nm,Å

1

m=10-6m,1nm=10-9m,1Å=10-10m

－频率，单位：赫芝(周)Hz次/秒

n－折射率，真空中为1光的传播速度:波动性5X磁场向量传播方向YZx电场向量6

h－普朗克(Planck)常数6.626×10-34J·s

－频率

E－光量子具有的能量单位：J(焦耳)，eV(电子伏特)1eV=1.602×10－19J微粒性光量子，具有能量。7结论:一定波长的光具有一定的能量，波长越长(频率越低)，光量子的能量越低.单色光：具有相同能量(相同波长)的光.混合光：具有不同能量(不同波长)的光复合在一起.例如白光.波粒二象性真空中:8

电磁波谱及分析方法电磁波长(cm)10-8~10-1310-6~10-910-4~10-610-410-1~10-410-1~10-2102Å10-5~10.1~100100~104104104~107nm10~400400~780780~3×105名称γ射线X射线紫外线可见光红外线短波中波能量(eV)104~109102~1051~102110-3~110-6~10-3~10-6

能级跃迁原子核内层电子外层价电子分子轨道电子分子转动或振动未成对电子的偶极矩原子核的偶极矩利用吸收的分析方法γ射线吸收法X射线吸收法原子吸收法紫外吸收法可见光分光光度法红外吸收分析顺磁共振核磁共振利用发射的分析方法活化分析X射线荧光发射X射线原子荧光分析火焰光度分析发射光谱分析荧光分析磷光分析拉曼分析利用相互作用的分析方法电子射线分析X射线衍射分析比浊法旋光光谱法圆偏光二向性法9光学光谱区远紫外近紫外可见近红外中红外

远红外（真空紫外）10nm~200nm200nm~380nm380nm~780nm780nm~2.5

m2.5

m~50

m50

m~300

m108.1.2物质对光的吸收与发射

1.电子相对于原子核的运动--电子能级;

单重态：激发态与基态中的电子自旋方向相反.

三重态：激发态与基态中的电子自旋方向相同.

2.原子核在其平衡位置附近的相对振动

--振动能级;3.分子本身绕其重心的转动--转动能级.物质分子内部3种运动形式及其对应能级：11S2分子吸光与发光示意图

Ee振动能级v3v2v1转动r3r2r1S1S0紫外荧光磷光T2T1可见

Ev

Er红外单重态三重态系间窜跃12光谱种类原子光谱：吸收、发射、荧光线状光谱

黑体辐射：白炽灯、液、固灼热发光连续光谱

分子光谱：紫外、可见、红外等吸收光谱带状光谱

I13/nm颜色互补光400～450紫黄绿450～480蓝黄480～490绿蓝橙490～500蓝绿红500～560绿红紫560～580黄绿紫580～610黄蓝610～650橙绿蓝650～760红

分子对光的吸收与吸收光谱不同颜色的可见光波长及其互补光蓝绿14熔融石英晶体石英玻璃NaCl170nm~3.6

m

*200~600nm2

m~3.5

m*360nm~2.5

m*200nm~15

mKClKBrCsI200nm~18

m*230nm~25

m230nm~50

m一些材料的有效透明区15Cr2O72-、MnO4-的吸收光谱300400500600700

/nm350525545Cr2O72-MnO4-1.00.80.60.40.2Absorbance35016苯和甲苯在环己烷中的吸收光谱苯(254nm)甲苯(262nm)A

23025027017不同物质吸收光谱的形状以及

max不同——定性分析的基础同一物质，浓度不同时，吸收光谱的形状相同，Amax不同——定量分析的基础188.1.3光吸收基本定律:朗伯-比尔定律朗伯定律:(1760)A=lg(I0/It)=k1b

当入射光的

,吸光物质的c一定时,溶液的吸光度A与液层厚度b成正比.比尔定律(1852)A=lg(I0/It)=k2c

当入射光的

,液层厚度b

一定时,溶液的吸光度A与吸光物质的c成正比.19朗伯-比尔定律意义:

当一束平行单色光通过均匀、透明的吸光介质时，其吸光度与吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比.A=lg(I0/It)=kbc20透光率(透射比）T（Transmittance）A

=lg(I0/It)=lg(1/T)=—lgT=Kbc吸光度A

(Absorbance）I0It入射光透过光21吸光度A、透射比T与浓度c

的关系AT(%)cA=kbc1.00.80.60.40.2100

80

60

40

2022K

吸光系数

Absorptivity

a

的单位:L·g-1·cm-1当c的单位用g·L-1表示时，用a表示，

A＝abc

的单位:L·mol-1·cm-1当c的单位用mol·L-1表示时，用

表示.

－摩尔吸光系数MolarAbsorptivity

A＝

bc

当c的单位用g·100mL-1表示时，用表示,A＝bc，叫做比吸光系数.23吸光度与光程的关系

A=abc

0.10b0.202b0.00光源检测器显示器参比24吸光度与浓度的关系

A=abc0.10c0.202c0.00光源检测器显示器参比25吸光度与波长的关系

A=abc0.00红0.10红0.00光源检测器显示器参比蓝绿光红光26朗伯-比尔定律的适用条件1.单色光

应选用

max处或肩峰处测定.3.稀溶液

浓度增大，分子之间作用增强.2.吸光质点形式不变

离解、络合、缔合会破坏线性关系,

应控制条件(酸度、浓度、介质等).27溶液浓度的测定A＝

bc工作曲线法(校准曲线)朗伯-比尔定律的分析应用01.02.03.04.0c(mg/mL)A。。。。*0.800.600.400.200.00Axcx288.1.4吸光度的加和性与吸光度的测量

A=A1+A2+…

+An

用参比溶液调T=100%（A=0），再测样品溶液的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，溶剂、试剂对光的吸收等。298.2光度分析的方法和仪器方便、灵敏，准确度差.常用于限界分析.8.2.1光度分析的几种方法1.目视比色法观察方向空白c1c2c3c4302.光电比色法光电比色计结构示意图通过滤光片得一窄范围的光(几十nm)31

滤光片吸收滤光片：只允许指定的窄范围波长光通过，其他波长的光均被吸收.选择滤光片的原则：滤光片透光率最大的光是溶液吸收最大的光,即滤光片的颜色与有色溶液的颜色互补.323.吸光光度法和分光光度计光源单色器吸收池检测系统分光光度计的基本组成通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光.波长可调,故选择性好,准确度高.33分光光度计的主要部件光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够 的光强度,稳定。

可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm)

紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm)

氙灯：紫外、可见光区均可用作光源

/nm钨灯（热辐射光源）4006008001000氙灯（气体放电光源）氢灯强度34氙灯氢灯钨灯35单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的 装置。

棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同.玻璃350～3200nm,石英185～4000nm入射狭缝准直透镜棱镜聚焦透镜出射狭缝白光红紫λ1λ280060050040036光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。

利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。波长范围宽,色散均匀,分辨性能好,使用方便.－平面透射光栅－反射光栅（广泛使用）光栅衍射示意图M1M2出射狭缝光屏透镜平面透射光栅37吸收池(比色皿)：用于盛待测及参比溶液。 可见光区：光学玻璃池 紫外区：石英池检流计（指示器）： 低档仪器：刻度显示中高档仪器：数字显示，自动扫描记录检测器：利用光电效应，将光能转换成电流讯号。 光电池，光电管，光电倍增管38硒光电池（Barrier-layerphotocell）适用于300-800nm,在500-600nm范围最灵敏。Se阴极Au，Ag半导体h

阳极39光电管(Phototube)h

（片）红敏管625-1000nm蓝敏管200-625nm40光电倍增管(PhotomultiplierTube,PMT)1个光子可产生106～107个电子160-700nm41722型分光光度计光源：钨卤素灯－12V、30W波长范围：330～800nm分光元件：光栅，1200线/mm检测器：端窗式G1030光电管 多碱阴极真空管300～850nm波长精度：2nm光谱带宽：6nm波长精度：仪器波长指示器所显示的波长值与仪器 对应输出的实际波长值之间的符合程 度。可用二者之差来衡量。42吸光光度法仪器主要差异比较可见光（380～780nm）紫外光（200～380nm)中红外（2.5～50

m)光源钨灯碘钨灯320～2500氢灯氘灯180～375硅碳棒（红外线）吸收池材料玻璃（350～3200）石英（185～4000）NaCl晶体431.单光束分光光度计可变波长单光束紫外-可见分光光度计示意图8.2.2分光光度计的基本类型442.双光束分光光度计参比池检测器滤光片或单色器放大器样品池光源

hv光子检测器反光镜反光镜透明部分扇形镜正面图扇形镜反光镜栅镜双光束型可以消除光源强度变化的影响.45多通道仪器（MultichannelInstruments）光电二极管阵列(通常具有316个硅二极管)photodiodearrays(PDAs)

同时测量200～820nm范围内的整个光谱,比单个检测器快316倍,信噪比增加3161/2倍.

3.其他类型分光光度计纤维光度计将光度计放入样品中,原位测量.对环境和过程监测非常重要.46HP8452A多通道二极管阵列分光光度计47镀铝反射镜纤维光度计示意图488.3吸光光度法的灵敏度与准确度8.3.1灵敏度的表示方法

摩尔吸光系数(

)

A=

bc

=A/bc(L·mol-1·cm-1)

越大,灵敏度越高:

<104为低灵敏度;

104～105为中等灵敏度;

>105为高灵敏度.492.Sandell(桑德尔)灵敏度

(S)定义：截面积为1cm2的液层在一定波长或波段处，测得吸光度为0.001时所含物质的量。用S表示，单位：

g·cm-2A=

bc=0.001

bc

＝0.001/

S小灵敏度高;

相同的物质,M小则灵敏度高.变换单位:bcmcmol/L=bcM106

g/1000cm250例1

邻二氮菲光度法测铁

(Fe)=1.0mg/L,

b=2cm,A=0.38计算

、S

和解：

c(Fe)=1.0mg/L=1.0×10-3/55.85=1.8×10-5(mol·L-1)S=M/

=55.85/1.1×104=0.0051(

g/cm2)或51c=1.0mg/L=1.0×10-3g/1000mL=1.0×10-4g/100mL52例2比较用以下两种方法测Fe的灵敏度.B.用4,7-二苯基邻二氮菲光度法测定铁ε533＝2.2×104L·mol-1·cm-1S=55.85/(2.2×104)＝0.0025(

g·cm-2)B方法比A方法的灵敏度高.A.

用邻二氮菲光度法测定铁时，ε508＝1.1×104L·mol-1·cm-1S=55.85/(1.1×104)＝0.0051(

g·cm-2)538.3.2准确度—仪器测量误差100806040200T/%

c1

c2

c3

T

T

T-透光率读数误差

c

c1c1

c2c2

c3c3><

由于T与浓度c不是线性关系，故不同浓度时的仪器读数误差

T

引起的测量误差

c/c不同。54测量误差公式推导:dA=d(-lgT)=d(-0.434lnT)=-0.434dT/TA=-lgTTlgT最大时，即(TlgT)′=0时误差最小,

算得lgT=-0.434,T=36.8%,A=0.434551086420204060800.70.40.20.1AT/%Er(36.8)0.434浓度测量的相对误差与T(或A)的关系实际工作中，应控制T在10～70％,

A在0.15～1.0之间(调c,b,

)568.4.1显色剂与显色反应

：：：：助色团－NH，－OH，－X（孤对电子）ne8.4显色反应与分析条件的选择O生色团：－N＝N－，－N＝O，OC=S,－N（共轭双键）πe57有机显色剂CH3－C－C－CH3HO－NN－OH＝＝NNOHCOOHSO3HOO型：NNNOH

OHON型：PARNHNHNSNS型：双硫腙NN型：丁二酮肟邻二氮菲磺基水杨酸58显色反应的选择

灵敏度高，一般ε>104;选择性好;显色剂在测定波长处无明显吸收,

对照性好,

max>60nm;反应生成的有色化合物组成恒定，稳定;显色条件易于控制，重现性好.598.4.2显色条件的确定c(R)c(R)c(R)1.显色剂用量（c(M)、pH一定）Mo(SCN)32+

浅红Mo(SCN)5

橙红Mo(SCN)6-浅红Fe(SCN)n3-n602.显色反应酸度（c(M)、c(R)一定）pH1<pH<pH2pH61邻二氮菲－亚铁反应完全度与pH的关系

H+H+Ac(R)≈[R´]=10-4mol·L-1β3＝1021.3β3FeR3OH-Fe2++3R62pH3～8为适宜的酸度范围6325℃50℃t/minA3.显色温度及显色时间

(c(M)、c(R)、pH一定)另外，还有介质条件、有机溶剂、表面活性剂等.648.4.3测定中的干扰以及消除方法Co2+,Fe3+Co2+FeF63-Co(SCN)2(蓝)⑴NaFSCN－Co2+Fe2+,Sn4+(2)Sn2+Co(SCN)2SCN－测Co2＋

:(掩蔽法)1.化学法

65Co2+,Zn2+,Ni2+,Fe2+

CoR,ZnRNiR,FeRCoR,Zn2+

,Ni2+

,Fe2+

钴试剂RH+测Co2＋

:(生成络合物性质不同)消除干扰，也可采取分离法。Fe3+,Cu2+FeSSal（紫红）Cu2+pH=2.5SSal测Fe3＋:(控制pH)662.物理法—选择适当的测定波长515655415500钍-偶氮砷III

钴-亚硝基红盐

AA络合物络合物试剂试剂

/nm

/nm671.仅络合物有吸收，溶剂作参比。

如phen—Fe2+

标准曲线2.待测液也有吸收，被测液作参比。

如测汽水中的Fe3.显色剂或其他试剂也有吸收，空白溶液作参比

例:邻二氮菲光度法测Li2CO3中的Fe，参比溶液为不含Li2CO3样品的所有试剂。4.干扰组分与显色剂有反应,又无法掩蔽消除时：

1）掩蔽被测组分，再加入显色剂，作参比.2）加入等量干扰组分到空白溶液中,作参比.

--选择适当的参比溶液688.5吸光光度法的应用8.5.1单一组分的测定1.金属离子:Fe-phen,Ni-丁二酮肟,Co-钴试剂2.磷的测定:DNA中含P～9.2%,RNA中含P～9.5%,

可得核酸量.H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3=(NH4)3PO4·12MoO3+12NH4NO3+12H2O磷钼黄(

小)磷钼(V)蓝(

大)Sn2+693.

蛋白质测定—溴甲酚绿、考马司亮蓝等4.氨基酸测定—茚三酮(紫色化合物)5.水质检测:NH4+、NO2-、Mn2+、Fe2+、SO42-、Hg2+----6.药物含量测定—比吸光系数定量；荷移光谱法测定.7.紫外吸收(UV):NO2-、NO3-、SO42-、SO32-、CO32-、SCN-、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋白质等。708.5.2多组分的测定

xl1,eyl1,exl2,eyl2由x,y标液在

1,

2处分别测得.在

1处测组分x,在

2处测组分y.b)在

1处测组分x;在

2处测总吸收,扣除x吸收,可求y.c)x,y组分不能直接测定

A1=exl1bcx+eyl1bcy(在

1处测得A1)

A2=exl2bcx+eyl2bcy(在

2处测得A2)71

8.5.3光度滴定NaOH滴定对硝基酚pKa=7.15

间硝基酚pKa=8.39

pKa=1.24V1V2V(NaOH)/mL对硝基酚间硝基酚酸形均无色.碱形均黄色72典型的光度滴定曲线依据滴定过程中溶液吸光度变化来确定终点的滴定分析方法。Vsp滴定剂吸收Vsp被滴物吸收Vsp滴定剂与待测物均吸收Vsp产物吸收738.5.4络合物组成的测定1.摩尔比法:

固定cM,改变cR

1:13:1c(R)/c(M)A1.02.03,0

742.等摩尔连续变化法:M:R=1:10.50.33cM/ccM/cM:R=1:200.20.40.60.8100.20.40.60.81758.5.5一元弱酸离解常数的测定HLH＋＋LKa＝[H+][L]/[HL]高酸度下，几乎全部以HL存在，可测得AHL＝εHL·c(HL)；低酸度下，几乎全部以L存在，可测得AL＝εL·c(HL).代入整理：或配制一系列c相同,pH不同的溶液,测A.HL、L颜色不同[HL][L]76MO吸收曲线Aa(HL)Ab(L)123456Ab654321Aa350400450500550600

/nmA曲线pH11.10,1.3822.6533.0643.4853.9865.53,6.80由每份溶液的一对pH、A，可求得一个Ka,取平均值即可.778.6

紫外可见分光光度法在有机定性分析中的应用8.6.1有机化合物分子的电子跃迁和吸收带非键轨道成键轨道成键轨道反键轨道反键轨道

(nm)HCHO==n

*>*>*>n*>*>n*78跃迁

max(nm)

*~150(<200)n*~200100～300n*200～80010～100*~200~104190CH2－CH2CH2135（C－C）CH3－CH2－CH3135（C－C）CH3－CH3125（C－H）CH4λmax（nm）饱和烃类

→

*跃迁

(饱和烃类)

（作溶剂）79

max(nm)

max(nm)

H2O1671480CH3OCH31842520CH3OH183150CH3NH2215600CH3Cl173200(CH3)2NH220100CH3Br204200(CH3)3N227900CH3I258365

n→

*

跃迁（含具n电子的杂原子）80n→

*跃迁（带孤对电子的杂原子与其他

键共轭）280～300饱和醛酮1000(n→

*)16(n→

*)186280CH3COCH3异辛烷22280CH3－NO2EtOH5339CH3N＝NCH3H2O60214CH3CONH2EtOH41204CH3COOH

max(nm）介质81π→π*

跃迁（不饱和烃类)6000173CH三CH14000175CH2＝CH2

max(nm）π→π*跃迁的

max短，

大,n→

*跃迁的

max长，

小.82电荷迁移跃迁（荷移光谱）特点：谱带宽,吸收强度大,λmax处的ε可大于104。Fe3＋—SCN-

Fe2＋—SCN

（分子内氧化还原）h

RN1R2Rh

D—AD＋—A-e给予体e接受体e给予体e接受体N1R2-+h

CROCRO-+h

838.6.2有机分子中的生色团与助色团

严格地说，只有含有不饱和基团或孤对电子的基团，才是生色团（n→π*，π→π*）－C－C－，－C－H，σ→σ*

～150nmn→σ*，σ→σ*::C＝OC＝C－O－::n→π*，π→π*－C－O－，－C－S－n→σ*

,σ→σ*

～200nm::::－C－N－，－C－Cl：:::C＝C,－C＝

C－π

→π*,σ→σ*

～200nm

（孤立双键

<200nm）生色团类型84生色团举例-1221000275190(CH3)2C=O12.51000289182蒸气H3CCHOC＝O4500172蒸气C2H2C三C15530171气态C2H4C＝C125CH4－C－H135C2H6－C－Cελmax溶剂例生色团85生色团举例-2

max溶剂例生色团15.84400279202己烷CH3NO2－NO2160295MeOH乙酰胺－CONH260204水乙酸乙酯－COOR34240庚烷CH3COCl－COCl41200EtOHCH3COOH－COOH～200－C－OH，－C－SH－C－N，－C－Cl86生色团举例-3

max溶剂例生色团2257000261206.5水甲苯2057400254203.5水苯200238异辛烷C2H5CH＝NC5H6C＝N－25343水反式偶氮甲烷－N＝N－7417乙醚重氮甲烷＝N＝NCH3＋－87不饱和基团助色效应大256261264282

320

276(K带)

苯环B带λmax(nm)CH3ClCH=CH2CCH3O常见助色团及其助色效应(红移——

max增大):－F<－CH3<－Cl<－Br<－OH<－OCH3<－NH2<－NHCH3<－N(CH3)2<－NHC6H5<－O－例：

CH3Cl CH3Br CH3I

max(nm)172 204 25888反助色团大多是吸电子基团（蓝移）

－NH3＋<－SO2NH2<－COO－<－CN<－COOH<－COOCH3<－COCH3<－CHO89共轭烯烃键数与能量的关系

E

E

E

E

4*

5*

6*

3

2

1

3

2

1

4

5*

6*

7*

8*

3*

4*

2

1

1

2*共轭

键越多，最大吸收峰波长

越长.90双键数物质名称

max(nm)

5癸五烯335（浅黄）1.2×1056二甲基十二碳六烯360（黄）1.4×10582－羟基－

－胡萝卜素415（橙）2.1×10511番茄红素470（红）1.9×105

max结构式化合物5.2×1043.5×1042.1×1041.0×104296258217185C＝C

辛四烯

己三烯

丁二烯

乙烯91苯吸收带（溶剂：异辛烷）精细结构B带(III)K带(II,E2)E带(I,E1)I带II带III带E带K带B带E1带E2带B带1802042566.0×1048.0×1032.0×102

max

苯吸收带名称92苯环共轭的影响B带，

max(nm)苯256萘314蒽380丁省480(黄)戊省580(蓝)93苯的同系物的吸收光谱

/nm

94

Kmax＝220nm，

Bmax＝270nmε＝800非共轭(两环不共平面)λBmax＝262nm，ε＝500

非共轭(sp3杂化)隐式孔雀绿(sp3杂化)(无色)碱式孔雀绿

(三苯环共平面)(sp2杂化)(绿色)

λmax＝617nm苯环取代基的影响CH2CH3CH3CHN(CH3)2(CH3)2N(CH3)2NC+N(CH3)2Cl-2,2

-二甲基联苯二苯甲烷95羰基化合物En*

n*~290nm*~210nmn*4

1n*321nm*217nm

2*3脂肪醛的

*

n*2-丁烯醛的

2

*3n*3R-C-HOHC-CC-CH3HOH968.6.3溶剂极性对吸收光谱的影响对称四嗪的吸收光谱蒸气状态环己烷中水中(溶剂化,精细结构消失)NNCNNCHH500600

(nm)12397酸碱性导致物质结构发生变化例：+H＋+OH－HOCOHCOO-sp3（无色）-OCCOO-Osp2（红色）OH98溶剂极性增大，n*

吸收蓝移例:丙酮溶剂己烷氯仿二氧六环乙醇水

max(nm)280278277270265±2丙酮的UV吸收光谱图溶剂效应（形成氢键）无溶剂效应

E1

E2

E2

E1>

max蓝移水乙醇己烷A

99溶剂极性增大，*吸收红移CH3溶剂效应无溶剂效应

E1

E2

E2

E1<

max红移

异亚丙基丙酮例：

异亚丙基丙酮305309315329n*243237238230

*水甲醇氯仿正己烷溶剂极性增大

max蓝移

max红移100溶剂极性影响的结论:1.非极性溶剂可见精细结构;2.pH影响分子构型,

因此影响物质对光的吸收.3.利用溶剂效应可区别*(红移)

还是

n*(蓝移);4.比较光谱时,溶剂要相同.101常用溶剂的光学透明区CHCl3245乙醚210苯280环己烷210己烷210CCl4265正丁醇210庚烷210DMF270二氯甲烷235甲醇215丙酮330二氧六环235异辛烷210吡啶303乙醇210水191硝基甲烷380大于以上波长时使用对溶剂的要求1.低极性2.易溶解被测物3.稳定4.在样品的吸收光谱区无明显吸收1021575年，西班牙医生N.Monardes发现。1852年，SirGeorgeStokes对荧光产生的机理作了解释，并提出了“荧光”。1867年，首次用于分析测定。1928年，Jette和West提出第一台光电荧光计。1952年，商品荧光分光光度计出现。8.7分子荧光与分子磷光分析法1038.7.1发光机理(JablonskiDiagram)荧光寿命:10－9～10－7s磷光寿命:10－4～10s分子吸光与发光示意图104吸收光谱发射光谱蒽的激发光谱（吸收光谱）和发射光谱（荧光光谱）激发光谱:ExcitationSpectrum,

激发波长:

ex发射光谱EmissionSpectrum,发射波长:

em105

荧光分析法测定血清中的镁镁-Oxine的激发光谱和发射光谱

/106荧光光谱的特点Stokes位移：分子荧光的发射峰相对于吸收峰位移到较长的波长.荧光发射光谱的形状与激发波长的选择无关.镜像规则：荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系.1078.7.2定量分析的基础

—荧光强度(F)与物质浓度(c)的关系在稀溶液中：

F＝2.3KφεbcI0＝2.3KφAI0φ—荧光物质的荧光效率(量子产率)：ε—荧光物质的吸光系数

b—液层厚度

I0—入射光强度

K—检测效率（由仪器决定）当b，I0一定时：F＝Kc108Fc一般当εbc0.05时,F与c呈线性关系高浓度时，荧光物质发生自熄灭和自吸收现象，使F与c不呈线性关系Fc1098.7.3荧光与分子结构的关系1.共轭效应

→

*跃迁芳香族化合物、五元杂环上取代苯基.

共轭体系越大,越易产生荧光,荧光效率也增大.─(CH=CH)3─

φ=0.68─(CH=CH)2─φ=0.281102.刚性结构和共平面效应酚酞(无荧光)8－羟基喹啉(弱荧光)红色荧光CO-OOCOO-COCOO--ONO-NOMgNO荧光黄111联二苯φ=0.2芴φ=1.03,4-苯并芘(强荧光物质)CH21123.取代基的作用

给电子基增强荧光：－OH,－OR,－NH2,－NHR,－NR2,－C≡N吸电子基减弱荧光：－COOH,－C=O,－NO2,－N＝N,－Cl,－Br,－I

与

体系作用小的取代基影响不明显：－SO3R,－NH3＋,－SH,－F,－R。COOHNO2I无荧光NH2OH比荧光强50倍113

取代基之间若发生氢键，增强分子平面性和刚性会加强荧光:碱性有荧光COOHOH无荧光OHCOOH水杨酸中性、碱性均有荧光OHOHCO1148.7.4影响荧光强度的主要因素1.浓度：稀溶液，F∝c(

bc≤0.05)2.光源：F∝I0，应强度大，稳定。3.温度：T低，φ增加。荧光素钠的乙醇溶液,T<0℃时,每降低10℃,φ增加3%,-80℃时φ=100%.4.酸度：有荧光无荧光OHO—1158.7.5荧光光度计及荧光测定方法I0It