新疆盐碱地真菌B2中xanthone类成分的分离鉴定

新疆盐碱地真菌B2中的Xanthone类成分的分离鉴定摘要目的：本课题对新疆盐碱地真菌AspergillussydowiiB2的乙酸乙酯粗提物进行分离纯化，期待发现Xanthone类似物。方法：（1）根据HPLC谱图分析，选择含Xanthones的组分进行硅胶柱层析、ODS柱层析、SephadexLH-20柱层析以及半制备型HPLC方法分离，从而得到单体化合物。通过1H-NMR、13C-NMR进行结构鉴定。（2）通过PPI网络、KEGG富集分析、GO功能分析和分子对接，对分离得到的Xanthones采用网络药理学方法对其抗肿瘤与抗炎的潜在靶点与作用通路进行初步预测分析。（3）利用SRB方法评价Xanthone类化合物的体外抗肿瘤活性。结果：通过结构鉴定获得5个Xanthone类化合物，分别为sterigmatocystin(W-1)、5-methoxysterigmatocystin(W-2)、oxisterigmatocystinD(W-3)、sydowininA(W-4)、sydowininB(W-5)。基于网络药理学方法，从新疆盐碱地B2菌株的乙酸乙酯粗提物中分离得到的Xanthone类化合物1~5与关键核心靶点TP53、EGFR、AKT1的亲和力强。oxisterigmatocystinD对MCF-7的IC50为4.26μg/mL，对HEPG2的IC50为4.55μg/mL，对Hela的IC50为2.87μg/mL抗肿瘤活性显著。结论：通过HPLC分析选择Fr.5~7和Fr.8~11两个组分进行分离纯化，获得5个Xanthone类化合物，采用分子对接方法表明分离得到的Xanthones与TP53、EGFR、AKT1核心靶点亲和力强，SRB法筛选出oxisterigmatocystinD的抗肿瘤活性显著。关键词：聚多曲霉Xanthones网络药理学抗肿瘤

AbstractObjective:ThisprojectconductstheseparationandpurificationofthecrudeethylacetateextractofthefungusAspergillussydowiiB2fromthesaline-alkalilandinXinjiang,withtheexpectationofdiscoveringXanthoneanalogs.Methods:(1)BasedontheHPLCchromatographicanalysis,thefractionscontainingXanthoneswereselectedandsubjectedtosequentialpurificationthroughsilicagelcolumnchromatography,ODScolumnchromatography,SephadexLH-20columnchromatography,andsemi-preparativeHPLC,resultingintheisolationofmonomericcompounds.Structuralelucidationwasperformedusing1H-NMRand13C-NMRspectroscopy.(2)ThepotentialtargetsandactionpathwaysoftheisolatedXanthonesinanti-tumorandanti-inflammatoryactivitieswerepreliminarilypredictedandanalyzedbynetworkpharmacologymethodsthroughPPInetwork,KEGGenrichmentanalysis,GOfunctionalanalysisandmoleculardocking.(3)TheSRBmethodisemployedtoevaluatetheinvitroantitumoractivityofXanthonecompounds.Results:(1)FiveXanthonecompoundswereidentified,namelysterigmatocystin(W-1),5-methoxysterigmatocystin(W-2),oxisterigmatocystinD(W-3),sydowininA(W-4),sydowininB(W-5).(2)Basedonthenetworkpharmacologymethod,alltheXanthonesisolatedfromtheethylacetatecrudeextractoftheB2strainfromXinjiangsaline-alkalilandhavestrongaffinitywiththekeycoretargets.(3)TheIC50valueofoxisterigmatocystinDagainstMCF-7is4.26μg/mL,againstHEPG2is4.55μg/mL,andagainstHelais2.87μg/mL.Theanti-tumoractivityisremarkable.Conclusion:Fr.5-7andFr.8-11wasscreenedbyHPLCanalysisforseparationandpurification,fromwhichsixcompoundswereisolatedandidentifiedasfiveXanthonecompounds.Themoleculardockingmethodwasemployed,whichindicatedthattheisolatedXanthoneshadstrongaffinityforthecoretargetsTP53,EGFR,andAKT1.TheSRBmethodalsorevealedthattheantitumoractivityofoxisterigmatocystinDwassignificant.Keywords:A.sydowii;Xanthone;networkpharmacology;Antitumor.

前言曲霉属（Aspergillus）能够产生多种天然产物，其次级代谢物极具药学研究及商业价值REF_Ref5320\r\h[1]。聚多曲霉A.sydowii是一种嗜盐的真菌，属于曲霉属物种之一，广泛分布于世界各地不同环境，包括各种土壤和海洋生态系统，且具有强盐度耐受性，。近年来，随着对聚多曲霉研究的不断深入，发现A.sydowii致病性外其他的优良特性。优良特性展现在能产生各种具有药用价值、生物技术及工业重要性的酶，如脂肪酶、α-淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶等REF_Ref5588\r\h\#"［0"[2,REF_Ref5595\r\h\#0]"\#"0］"3]；还展现在其次级代谢物种类丰富，包括生物碱、萜类、苯醚类、蒽醌类等REF_Ref5944\r\h[4,REF_Ref5947\r\h5,REF_Ref5954\r\h6]，这些代谢产物富有抗菌、抗炎、抗氧化、免疫抑制、抗病毒、PTP1B抑制等生物活性REF_Ref6091\r\h[7,REF_Ref6098\r\h8]；聚多曲霉还被用于合成不同类型的纳米粒子，这些纳米粒子在药物制剂、生物技术及工业领域具有潜在应用价值。随着人类对海洋探索度不断提高，以及人类生态环境问题严峻，人们迫切需要来源丰富且各类价值更高的药物或生物技术来改变或优化现存的问题，聚多曲霉能产生丰富的次级代谢产物,具有多种生理活性，在海洋及盐碱地均能存活，其特殊的生长环境可能会导致自身形成一些特殊的生理机制和遗传基因，其次级代谢物包含Xanthone类化合物。Xanthone类化合物具有独特的C6-C1-C6骨架结构，又称为苯并吡喃酮，是特殊的黄酮类化合物REF_Ref6166\r\h[9]；这类化合物均显示出广泛的生物学特性，可以作为抗氧化剂REF_Ref6196\r\h[10]，同时，对植物的病原菌生长具有抑制作用REF_Ref6356\r\h[11]，还有抗肿瘤REF_Ref6414\r\h[12]，抗炎REF_Ref6440\r\h[13]，抗病毒REF_Ref6470\r\h[14]和止咳REF_Ref6496\r\h[15]等。Xanthone类化合物最初从芦荟中分离出来，后从东太平洋的一株青霉菌属MCCC3A00126的粗提物中报道有两种Xanthone类化合物REF_Ref6685\r\h[16]，这两个类似物的基本结构是以sterigmatocystin为基底，进行氧化或取代；sydowininA的类似物在C.halotikeransGXIMD02502中有分离鉴定REF_Ref6718\r\h[17]；还有从一株地柏属真菌的发酵物中分离出了新的dihydroxanthonemethyl，其骨架结构与sydowininsB类似REF_Ref6747\w\h[18]。综合国内外的研究以及预实验，来自新疆盐碱地B2可以产生Xanthones，本课题拟在上述实验基础上通过半制备HPLC、SephadexLH-20、ODS层析柱和200~300目硅胶层析柱分离出Xanthones，从而对该类化合物进行多方面活性的研究。

3结果3.1单体化合物的鉴定图SEQ图\*ARABIC1化合物结构总图将通过半制备高效液相色谱仪制备得到的化合物W-1~5分别通过1H-NMR、13C-NMR现代波谱技术进行结构鉴定。图SEQ图\*ARABIC2化合物W-1结构化合物W-1为淡黄色固体。1H-NMR(600MHz,CDCl3)显示三个苯环氢信号δH7.19(1H,d,J=9.0Hz,H-5),6.70(1H,d,J=9.0Hz,H-4),6.42(1H,s,H-11)，13C-NMR(150MHz,CDCl3)谱显示三个次甲基碳信号δC120.41(C-4)、109.78(C-5)、90.91(C-11)，六个连氧苯环季碳信号δC155.35(C-3)、139.52(C-6)、144.69(C-7)、154.49(C-8)、164.88(C-10)、163.87(C-12),δC181.42(C-1)为酮基碳的碳信号，因此可以判断化合物为C6-C1-C6骨架的Xanthone类化合物。13C-NMR(150MHz,CDCl3)光谱显示δC169.82为酰基碳信号，δC42.74(C-15)、112.65(C-14)为两个手性碳的碳信号，δC98.50(C-17)为连有两个氧原子的次甲基碳信号，1H-NMR(600MHz,CDCl3)显示δH6.40(1H,t,J=4.6Hz,H-17)为连两个氧原子的次甲基氢信号。1H-NMR(600MHz,CDCl3)和13C-NMR(150MHz,CDCl3)谱显示两个甲基信号δC57.79(C-18)、δH4.00(3H,s,CH3-18)和δC57.01(C-19)、δH3.92(3H,s,CH3-19)为两个甲氧基上的活泼氢信号，δC21.26为17位取代酰基的甲基碳信号。将化合物W-1数据与文献REF_Ref6747\w\h[18]数据对照，结果基本一致,故鉴定化合物W-1为oxisterigmatocystinD。表SEQ表\*ARABIC1化合物W-1的1H-NMR(600MHz)和13C-NMR(150MHz)数据No.δH,mult(J,Hz)δCNo.δH,mult,(J,Hz)δC1---181.42s12---163.87s2---109.72s13---106.39s3---155.35s146.50,d,(5.9Hz)112.65d46.70,d(9.0Hz)120.41d154.37,q(6.4Hz)42.74d57.19,d(9.0Hz)109.78d162.61,m36.68t6---139.52s176.40,t(4.6Hz)98.50d7---144.69s184.00,s57.79q8---154.49s193.92,s57.01q9---106.67s20---120.41s10---164.88s212.12,s21.26q116.42,s90.91d图SEQ图\*ARABIC3化合物W-2结构图SEQ图\*ARABIC4化合物W-3结构化合物W-2：淡黄色固体；ESI-MS分子离子峰m/z355.1[M+H]+,提示分子式为C19H14O7。1H-NMR(600MHz,CDCl3)显示δH12.61(1H,s)为3-羟基的活泼氢信号，对比化合物W-2与W-1氢谱，结果显示W-2多了两个不饱和氢信号δH6.50(1H,)、δHJ=2.6Hz,少了酰甲基氢信号和半缩醛氢信号。通过文献REF_Ref7263\w\h[20]比对波谱数据，判断W-2为5-methoxysterigmatocystin。化合物W-3：淡黄色固体ESI-MS分子离子峰m/z325.1[M+H]+,提示分子式为C18H12O6。1HNMR(600MHz,CDCl3)显示δH13.22(1H,s)为3-羟基的活泼氢信号δH4.81(1H,dt,J=7.1,2.2Hz,H-17)和δH5.45(1H,t,J=2.6Hz,H-16)为不饱和键上的氢，对比W-3和W-2的氢谱，发现W-3少了一个甲氧基氢信号，多了一个苯环不饱和氢信号δH6.83(1H提示不同在于6号位没有取代基。通过文献REF_Ref7263\w\h[20]比对波谱数据，鉴定化合物W-3为sterigmatocystin。表SEQ表\*ARABIC2化合物W-2和W-3的1H-NMR(600MHz)数据No.(W-2)δH,mult,(J,Hz)No.(W-3)δH,mult,(J,Hz)312.61,s313.22,s46.69,d(9.0Hz)46.76,dd(8.3,1.0Hz)57.19,d(9.0Hz)57.50,t(9.0Hz)116.44,s66.83,m146.83,d(7.1Hz)116.44,s154.86,dt(7.2,2.3Hz)141.68,s165.51,t(2.6Hz)156.50,m176.50,dd(2.8,2.0Hz)165.45,t(2.6Hz)184.00,s174.81,dt(7.1,2.2Hz)193.93,s183.99,s图SEQ图\*ARABIC5化合物W-4结构化合物W-4：黄色无定型粉末ESI-MS分子离子峰m/z301.1[M+H]+,提示分子式为C16H12O6。1HNMR(600MHz,CDCl3)显示δH12.12(1H,brs)为1-羟基的活泼氢信号1HNMR(600MHz,CDCl3)显示单取代苯环上的五个氢信号：三个邻近氢信号δH7.76(1H,t,J=7.9Hz,H-6δH7.53δHδHs,H-4)和δHs,H-2)，说明该苯环上两个单取代氢处于间位而其他四个位置都被取代1HNMR(600MHz,CDCl3)显示δH4.72(2H,s,CH2-11)为亚甲基上的两个氢信号δH4.03(3H,s,CH3-12)为甲氧基上甲基的三个氢信号。对比上述波谱数据与文献REF_Ref7394\w\h[21]数据,故鉴定化合物W-4为sydowininA。图SEQ图\*ARABIC6化合物W-5结构化合物W-5：黄色无定型粉末ESI-MS分子离子峰m/z317.2[M+H]+,提示分子式为C16H12O7。1HNMR(600MHz,CDCl3)显示δH12.01(1H,brs)为1-羟基的活泼氢信号1HNMR(600MHz,CDCl3)显示单取代苯环上的四个氢信号：两个邻近质子偶合δH7.74(1H,d,J=9.0Hz,H-6)和δH7.49对比W-4，多了羟基取代，受强偶极-偶极相互作用，形成极宽的单峰，易与基线融合，难以在氢谱上看到取代基的活泼氢，两个单质子偶合δHs,H-4)和δHs,H-2)，说明该苯环上两个单取代氢处于间位而其他四个位置都被取代，δH4.76(2H,s,CH2-11)为亚甲基上的两个氢信号δH4.08(3H,s,OMe-12)为甲氧基上甲基的三个氢信号,上述波普数据与文献REF_Ref7456\w\h[22]数据对照基本一致,故鉴定化合物W-5为sydowininB。3.2网络药理学分析结果3.2.1化合物靶点和疾病靶点检索结果检索数据库获得分离的Xanthones化合物作用靶点461个，获得炎症相关靶点176个和抗肿瘤相关靶点762个，将上述数据通过韦恩图交集分别得到69个抗肿瘤和36个抗炎作用靶点，见REF_Ref17038\h图8和REF_Ref17061\h图9。图SEQ图\*ARABIC7化合物-抗肿瘤靶点veen图和化合物-抗炎靶点-veen图3.2.2PPI网络分析图将筛选出的69个抗肿瘤和36个抗炎作用靶点输入STRING数据库进行PPI网络分析，得到PPI网络，见REF_Ref5342\h图10和REF_Ref5355\h图11。利用Cytoscape软件分析网络图，以抗炎degree≥24.056和抗肿瘤degree≥35.881为筛选条件，共选出18个抗炎关键靶点和35个抗肿瘤关键靶点。图SEQ图\*ARABIC8抗肿瘤-蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络图SEQ图\*ARABIC9抗炎-蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络表SEQ表\*ARABIC3抗炎关键靶点名称Degree名称DegreeIFNG34IL1831IL1B34PTGS231IL634ALB30TNF34EGFR29IL1033TP5328TGFB132IL1327MMP932HMOX127NFKB131MMP326ICAM131PPARG25表SEQ表\*ARABIC4抗肿瘤关键靶点名称Degree名称DegreeTP5365IL1B45EGFR62IGF1R45AKT160MMP944BCL258CDKN1A44ESR156KDR42STAT355CDK241CCND155KIT41JUN55MAPK140MTOR54PPARG40HIF1A53PTGS240ATM53SOX239SRC49PTPN1139IL649PGR38PIK3CA48PIK3R138NFKB147MMP237TNF47MAP2K137TGFB146AR36JAK2463.2.3KEGG通路和GO通路分析图化合物W-1~5抗肿瘤的KEGG富集分析：根据-logP(10)＞16为筛选条件，选择差异的前16个数据绘制KEGG富集气泡图，主要涉及Pancreaticcancer、Endocrineresistance、EGFRtyrosinekinaseinhibitorresistance、AGE-RGAEsignalingpathwayindiabeticcomplications、Colorectalcancer、PD-L1expressionandPD-1checkpointpathwayincancer等通路。图SEQ图\*ARABIC10抗肿瘤KEGG富集气泡图从上述实验结果可以看到，抗肿瘤的KEGG富集分析中，Kaposisarcoma-associatedherpesvirusinfection、Endocrineresistance、Proteoglycansincancer、Chemicalcarcinogensis-receptoractication这些通路更可能与W-1~5治疗癌症有关。化合物W-1~5抗肿瘤的GO功能分析：根据-lgP的数值从大到小排序，选取biologicalprocess、molecularfunction、cellularcomponent这3个过程中各具有差异的前10个，绘制GO功能分析图。biologicalprocess过程主要涉及glanddevelopment、regulationofmetabolicprocess、positiveregulationofmiRNAmetabolicprocess、regulationofmiRNAtranscription、positiveregulationofmiRNAtranscription等；cellularcomponent过程主要涉及transcriptionregulationcomplex、euchromatin、cellleadingedge、unclearenvelope、cell-celljunction等；molecularfunction过程主要涉及transcriptiontactorbinding、proteinkinasebinding、kinasebinding、DNA-bindingtranscriptionfactorbinding、proteinkinaseactivity等。图SEQ图\*ARABIC11抗肿瘤GO功能富集分析抗肿瘤GO功能分析中BP功能，glanddevelopment、regulationofmetabolicprocess、positiveregulationofmiRNAmetabolicprocess、regulationofmiRNAtranscription可能与化合物W-1~5发挥抗肿瘤活性有关。化合物W-1~5抗炎的KEGG富集分析：根据-lgP≥12为筛选条件，选择差异的前15个数据绘制KEGG富集气泡图，主要涉及Africantrypanosomiasis、Malaria、Inflammatoryboweldisease、Rheumatoidarthritis、IL-17signalingpathway等通路。图SEQ图\*ARABIC12抗炎KEGG富集气泡图抗炎KEGG富集分析中，Africantrypanosomiasis、Malaria、Inflammatoryboweldiease等可能与化合物W-1~5治疗炎症有关。化合物W-1~5抗炎的GO功能分析：根据-lgP的数值从大到小排序，选取biologicalprocess过程具有差异的前10个、molecularfunction和cellularcomponent这2个过程中全部具有差异的通路，获得GO功能BP-CC-MF富集分析图。BiologicalProcess过程主要涉及regulationofinflammatory、regulationofsmoothmusclecellproliferation、cellularresponsetolipopolysaccharide、positiveregulationofsmoothmusclecellproliferation等；CellularComponent过程主要涉及membraneraft、membranemicrodomain、collagen-containingextracellularmatrix等；MolecularFunction过程主要涉及cytokineactivity、cytokinereceptorbinding、receptorligandactivity、signalingreceptoractivatoractivity等。图SEQ图\*ARABIC13抗炎GO功能富集分析抗炎GO功能分析中，regulationofinflammatory、regulationofsmoothmusclecellproliferation、cellularresponsetolipopolysaccharide可能与化合物W-1~5治疗炎症有关。3.2.4分子对接化合物W-1~5的结合能均＜-5.0kcal·mol-1，表明化合物W-1~5和3个关键核心靶点(TP53、EGFR、AKT1)间均有良好结合能力；结合能＜-8.0kcal·mol-1的5组，分别是Sterigmatocystin-EGFR、5-methoxysterigmatocystin-EGFR、oxisterigmatocystinD-EGFR、sydowininA-EGFR和sydowininB-EGFR，这5组数据表明W-1~5与TP53、EGFR、AKT1之间的结合性强；sydowininA-TP53、Sterigmatocystin-EGFR、sydowininB-AKT1、oxisterigmatocystinD-EGFR的分子对接构象见REF_Ref19349\h图16。对接结果充分表明，化合物W-1~5均可自发地结合这3种关键核心蛋白，从而发挥良好的抗肿瘤活性。表SEQ表\*ARABIC5化合物W-1~5与抗肿瘤关键核心靶点结合能化合物靶点PDBID结合能/kcal·mol-1SterigmatocystinTP536shz-6.878EGFR6tfv-9.186AKT17myx-6.6155-methoxysterigmatocystinTP536shz-6.576EGFR6tfv-9.089AKT17myx-6.817oxisterigmatocystinDTP536shz-6.613EGFR6tfv-8.659AKT17myx-6.550sydowininATP536shz-6.197EGFR6tfv-8.303AKT17myx-5.864sydowininBTP536shz-6.077EGFR6tfv-8.314AKT17myx-6.052图SEQ图\*ARABIC14部分化合物与关键核心靶点的分子对接3.3生物活性的测定通过SRB法对Xanthone类化合物W-1~5进行抗肿瘤活性测定,实验结果如表所示，仅W-3表现出强抑制肿瘤细胞活性，W-3对MCF-7的IC50为4.26μg/mL，对HEPG2的IC50为4.54μg/mL，对Hela的IC50为2.87μg/mL，其他化合物无抗肿瘤活性。表SEQ表\*ARABIC6Xanthones对不同肿瘤细胞的毒性CompoundsIC50(μg/mL)MCF-7HEPG2HelaW-14.264.552.87W-2＞100＞100＞100W-3＞100＞100＞100W-4＞100＞100＞100W-5＞100＞100＞100

4讨论网络药理学可以应对传统药理学在药物研发中的局限性，核心在于系统性和整体性地解析化合物与生物系统的相互作用，包括但不限于Human。由于天然药物成分复杂，网络药理学构建的PPI网络，量化关键靶点和通路，使得其作用机制研究更深入和透彻，并可以在分子基础上进行预测分析，为新药研发和提高研发成功率做出理论指导。本课题进行了抗肿瘤和抗炎通路的网络药理学研究，在进行KEGG富集分析中，-lgP值越大，表明该通路中富集越