新金分枝杆菌还原酶mnopccr功能研究

图7所示ΔkstdΔkshA转化植物甾醇产物AD的含量为0.435g/L,9-HP的含量为0.148g/L。ΔkstdΔkshAΔmnopccr化植物甾醇产物AD的含量为0.436g/L,9-HP的含量为0.147g/L。根据结果发现，敲除mnopccr后，AD和9-HP的积累量未发生显著变化，说明mnopccr的缺失未能显著影响到甾醇侧链降解的关键步骤。图5.ΔkstdΔkshA转化1g/L植物甾醇的产物产量图6.ΔkstdΔkshAΔmnopccr转化1g/L植物甾醇的产物产量2.3构建过表达mnopccr编码基因质粒过表达质粒以质粒p38为载体，构建p38Mu-mnopccr。首先需要通过PCR从M.neoaurumDSM44074的基因组上扩增mnopccr目的基因，用1%琼脂糖凝胶电泳验证片段大小正确后，经DpnI处理，除去残留的甲基化模板DNA，再用StarPrepDNA纯化或胶回收试剂盒处理，得到所需的目的基因片段。将质粒p38-Mu用限制性内切酶NdeⅠ线性化处理，再用StarPrepDNA纯化或胶回收试剂盒处理，得到线性化的载体。最后利用EZ-Hifi试剂盒将目的基因和线性化载体连接，转入E.coli并验证，得到目的质粒，如图7所示。图7.PCR-mnopccr质粒基因图谱2.4ΔkstdΔkshA中过表达mnopccr的功能分析通过在ΔkstdΔhshA中过表达mnopccr编码基因，得到菌株ΔkstdΔkshA+mnopccr，将菌株ΔkstdΔkshA、ΔkstdΔkshA+mnopccr进行1g/L的植物甾醇转化实验，对其发酵产物液相分析检测，结果如图4所示。根据图4可知结果，ΔkstdΔkshA转化植物甾醇产物AD的纯度67.5%，4-HP的纯度为22.7%。ΔkstdΔkshAΔmnopccr化植物甾醇产物AD的纯度为69.37%，4-HP的含量为23.33%。图8.ΔkstdΔhsd4A+mnopccr转化1g/L植物甾醇的产物产量当ΔkstdΔkshA和ΔkstdΔkshA+mnopccr添加了1g/L的植物甾醇为底物的发酵培养基中培养168h，并对其代谢植物甾醇的产物进行了液相检测分析，ΔkstdΔkshA转化植物甾醇产物AD的含量为0.435g/L,9-HP的含量为0.148g/L，ΔkstdΔkshA+mnopccr植物甾醇产物AD的含量为0.441g/L,9-HP的含量为0.146g/L。根据实验结果可以得出，过表达mnopccr后，4-HP和AD的含量并未发生太大的变化，即过表达mnopccr未显著的改变代谢产物的积累量，敲除kstd和kshA后，甾体降解途径已被部分阻断，但过表达mnopccr未能显著改变代谢产物积累量，可以推测出该酶在DSM44074中可能不直接参与主要的代谢调控，或存在其他替代酶补偿其功能。过表达mnopccr在ΔkstdΔkshA菌株中未显著改变AD和4-HP的积累量，说明mnopccr在不同菌株中的功能存在差异。结论本文章通过与已报道的mnopccr序列进行比对，挖掘到了M.

neoaurum

DSM44074中潜在的功能酶，二者相似度达到96.1%。利用ΔkstdΔhshA作为出发菌株，通过mnopccr编码基因敲除和过表达实验后，可以发现ΔkstdΔkshA转化植物甾醇产物AD的含量为0.435g/L，4-HP的含量为0.148g/L。ΔkstdΔkshAΔmnopccr化植物甾醇产物AD的含量为0.436g/L，4-HP的含量为0.147g/L。ΔkstdΔkshA+mnopccr植物甾醇产物AD的含量为0.441g/L，4-HP的含量为0.146g/L。mnopccr是原始菌株M.neoaurumMJTU2中的双功能还原酶，可以催化3-OPC-CoA和3-OPA，并生成4-HP，但在DSM44074中，敲除或过表达mnopccr后未导致4-HP或AD产量有显著变化，可以推测：mnopccr在不同菌株中的功能可能存在些许差异，或者其他补偿性的代谢途径、mnopccr在DSM44074中可能并非甾体侧链降解的限速酶，作用被其他的还原酶所替代。此结果为后续研究mnopccr的功能及机制奠定了基础，为甾醇药物中间体的高效合成和积累提供了部分理论数据，有助于进一步揭示微生物降解天然甾体的代谢机制。展望目前甾体药物的应用和工业发展已经取得了重大进展。随时间的发展，化学修饰法和微生物转化法联用日渐成熟，近年来，人们以植物甾醇为原料，以微生物的不完全降解甾体来生产甾体的中间体，再加上化学修饰生产甾体药物。该研究就利用植物甾醇为原料合成甾体，本文虽对M.neoaurumDSM44074体内可能存在的，一些相关的酶进行了挖掘，但对于其功能的确认需要进一步的研究，未来需要进一步对mnopccr的体外酶活性和催化机制进行明确，通过更多的基因编辑来优化甾体的代谢途径，获得更多目标产物，开发更高效更环保的甾体生产方法。本实验为甾体药物的生产提供了新的思路，但整体不够全面，未来希望能够更好的、更高效的获取甾体药物。

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