【磷酸化蛋白质组学分离富集策略文献综述4200字】

磷酸化蛋白质组学分离富集策略文献综述目前，磷酸化蛋白组学研究的分离富集策略（图1-3）[41,42]主要包括免疫沉淀法(immunoprecipitation，IP)、化学衍生法(chemicalderivatization)、离子交换色谱法(ionexchangechromatography,IEC)、固定金属离子亲和色谱法(immobilizedmetalionaffinitychromatography,IMAC)和金属氧化物亲和色谱法(metaloxideaffinitychromatography,MOAC)。1.1免疫沉淀法免疫沉淀法是一种常用的基于抗体特异性识别和结合磷酸化肽而达到分离富集目的的方法。目前，特异性抗体包括pTyr100、4G10、pY99等通过共价或非共价作用固定于琼脂糖基底上，对磷酸化肽进行识别、分离、解吸等过程，从而实现对目标磷酸化肽的分离富集[43,44]。尽管酪氨酸(pTyr)磷酸化肽的丰度比丝氨酸(pSer)和苏氨酸(pThr)磷酸化肽低很多[45]，但基于pTyr抗体的强特异性，该方法可以实现其他分离富集方法难以实现的pTyr磷酸化肽高效亲和识别和分离。例如，Rush等人[43]开创性地采用偶联pTyr100抗体的蛋白G琼脂糖直接从细胞蛋白胰蛋白酶酶解液中成功分离出688条pTyr磷酸化肽。然而，受限于抗体识别的特异性，该方法的普适性和选择性较差，且抗体的价格昂贵，因此，在磷酸化蛋白组学研究中，难以得到广泛应用。图1-3磷酸化蛋白组学分离富集策略[41]Figure1-3Separationandenrichmentstrategiesforphosphoproteomics.[41]1.2化学衍生法化学衍生法是采用特定的亲和标记试剂对磷酸基团进行化学修饰，将磷酸化肽转化为可被特定材料高选择性吸附的肽段，从而实现磷酸化肽的选择性分离富集。Zhou等人[46]通过可逆的磷酰胺键将磷酸化肽上的磷酸基转化为巯基后，使用表面修饰碘乙酰的材料对其进行共价偶联，然后，将吸附的磷酸化肽可逆解离，成功实现复杂样品中磷酸化肽的快速高灵敏度鉴定。另外一种化学衍生方法则是基于β-消除-Michael加成反应[47]。丝/苏氨酸磷酸化肽上的磷酸基团容易在碱性条件下，发生β-消除反应生成双键，双键和巯基乙醇发生Michael加成引入巯基后，则可以被亲和树脂吸附，巯基也可进一步修饰上生物素标签，通过生物素-亲和素特异性作用分离磷酸化肽。由此可见，β-消除-Michael加成反应仅适用于丝/苏氨酸磷酸化肽，无法实现酪氨酸磷酸化肽的分离富集。同时，化学衍生法的反应步骤繁琐，且可能的副反应多，限制了其在磷酸化蛋白组学研究中的进一步应用。1.3离子交换色谱法离子交换色谱法是依赖于不同肽段所带的净电荷的差异，使得肽段在离子交换色谱柱上的保留时间不同，从而达到分离目的一种方法，主要包括强阳离子交换色谱法(SCX)和强阴离子交换色谱法(SAX)。在酸性条件下，蛋白质经胰蛋白酶酶解后的肽段，因所带的氨基发生质子化，导致肽段带有+2电荷，而磷酸化肽因为带有负电荷的磷酸基，经过电荷平衡，净电荷为+1电荷。所以，在阳离子交换色谱柱中进行样品分离时，净电荷少的肽段比净电荷多的肽段保留时间短，从而实现非磷酸化肽和磷酸化肽的分离[48]。但是，SCX具有明显的缺陷，对于净电荷为负电荷的多磷酸化肽，阳离子交换柱对其没有保留能力，所以只能鉴定到简单的磷酸化肽。相比而言，SAX法可以克服该问题[49]。然而，在阴离子交换色谱柱上，带有+2电荷的非磷酸化肽和+1电荷的单磷酸化肽不保留，从而导致单磷酸化肽信息的丢失。所以，单一的SCX或者SAX法对磷酸化肽鉴定能力是有限的，一般是将SAX或者SCX联用[50]，或者作为预分离方法，再辅以IMAC或者MOAC法[51,52]，进行磷酸化肽的多维色谱分离和鉴定分析。1.4固定金属离子亲和色谱法固定金属离子亲和色谱法(IMAC)是通过载体固载金属离子后，对磷酸化肽上的磷酸基团形成配位作用而达到分离的一种方法。IMAC的概念最初是由Porath在1975年提出，用于含组氨酸和半胱氨酸的蛋白质的纯化[53]。而应用于磷酸化蛋白质组学则是在1986年，Andersson等人首次将Fe3+-IMAC亲和材料用于磷酸化蛋白的分离富集[54]。IMAC亲和材料一般由载体、螯合剂和金属离子三个部分组成。载体为固相材料，螯合剂为固载金属离子的化合物配体，而金属离子则用于磷酸化肽的选择性富集。因此，对于IMAC亲和材料而言，固相材料、螯合配体种类以及金属离子的种类都能直接影响IMAC材料的富集性能。早期的IMAC亲和材料一般使用亚氨基二乙酸(IDA)和次氮基三乙酸(NTA)作为螯合配体，在固载上Fe3+和Ga3+等过渡金属离子被固载后，用于选择性富集磷酸化肽[55,56]。尽管该类金属离子虽然对磷酸化肽具有较强亲和力，但其对带有天冬氨酸和谷氨酸等酸性残基的肽段的非特异性配位作用降低了该类IMAC材料对磷酸化肽的选择性[57]。同时，由于IDA和NTA对金属离子的固载能力有限，导致金属离子的固载数量较少，且在富集过程中金属离子容易丢失，直接影响了该类IMAC亲和材料的富集效率，限制了其在磷酸化蛋白质组学中的进一步发展[58]。近年来，为了提高IMAC材料对磷酸化肽的选择性，相比IDA和NTA，对金属离子固载能力更强的新型螯合配体包括磷酸盐(-PO32-)[59]、砷酸盐(-AsO32-)[60]、三磷酸腺苷(ATP)[61]、多巴胺(PDA)[62]和植酸(PA)[63]等被广泛用于制备IMAC材料。同时，具有更高价态的金属离子如Ti4+和Zr4+，表现出对磷酸化肽上的磷酸基团更强的亲和作用[58]。因此，一系列金属离子负载量更大、磷酸化肽结合能力更强的Ti4+和Zr4+-IMAC亲和材料被不断开发应用于磷酸化肽分离富集，已被证明是目前最有效和最具普适性的磷酸化肽分离富集方法。例如，邹汉法课题组[64]基于金属(Ⅳ)磷酸/磷酸盐化学，制备了Ti4+-IMAC聚丙乙烯微球填料，建立了磷酸化肽快速分离富集方法，成功实现HeLa细胞中磷酸化肽的分离富集，并且表现出优于传统Fe3+-IMAC材料的磷酸化肽特异性富集能力。该研究开发的简易磷酸化肽离线分离富集装置(SPE-Ti-IMAC)已成功商业化。此外，包含15种镧系金属元素的稀土金属离子(Gd3+、La3+、Ho3+、Er3+、Ce4+)也被固载于各种磷酸基修饰的载体上，同样展现出优于传统Fe3+-IMAC和MOAC材料的磷酸化肽分离富集性能[65-67]。尽管以上IMAC材料基本可以实现磷酸化肽的分离富集，但是，不同的金属离子对磷酸化肽的亲和力不同，使得单一的IMAC材料难以获得全面的磷酸化肽富集效果，容易造成磷酸化修饰信息的丢失。例如，Ti4+倾向于结合碱性磷酸化肽，而Fe3+对酸性的多磷酸化肽结合能力更强[68]，为此，混合金属离子IMAC或者多种IMAC组合策略被提出，用于提高大规模磷酸化蛋白组学鉴定的覆盖率[68-70]。张养军课题组[69]制备了一种混合镧系金属离子(Tb3+、Tm3+、Ho3+、Lu3+)固载的磁性纳米粒子，成功应用于HeLa细胞裂解液中磷酸化肽的分离富集，洗脱液在单次质谱分析中，可以鉴定到归属于2103种磷酸化蛋白的9048条磷酸化肽，表现出优异的磷酸化肽分离富集性能。而Tsai等人[70]则开发了一种Ga3+-IMAC和Fe3+-IMAC组合的序列分离富集策略，其中，富集能力差的Ga3+-IMAC先用于捕获结合能力强的多磷酸化肽，而Fe3+-IMAC则用于富集剩余的结合力弱的单磷酸化肽，两者的鉴定重叠率小于10%，可以获得比单一IMAC策略更丰富的磷酸化修饰信息，成功实现了人肺癌组织中磷酸化蛋白组学的高覆盖鉴定。1.5金属氧化物亲和色谱法金属氧化物亲和色谱法(MOAC)是另外一种被广泛关注的新型磷酸化蛋白组学分离富集策略。与IMAC策略相比，MOAC材料稳定性更好，制备方法也更简便。目前，已经有多种MOAC材料已经被用于磷酸化肽的分离富集[71]，包括TiO2、ZrO2、Fe3O4、Al2O3、ZnO、Ga2O3、HfO2、CeO2等。其中，TiO2是应用较为成熟的MOAC富集材料。MOAC材料富集磷酸化肽的机理，目前仍不清楚。但是，根据研究结果，通过pH值的切换，TiO2等金属氧化物可以表现为路易斯酸或者路易斯碱：酸性缓冲液中，TiO2表现为路易斯酸，钛原子带正电荷，对阴离子具有静电结合能力；而在碱性缓冲液中，TiO2表现为路易斯碱，可以与阳离子结合。因此，TiO2等金属氧化物对磷酸化肽可以表现出酸性条件结合，碱性条件洗脱的分离富集效果。尽管MOAC材料对磷酸化肽有良好的分离富集效果，但TiO2等金属氧化物对溶液中的带羧基的酸性肽段也具有较强结合力，因此，容易发生非特异性吸附，降低其对磷酸化肽的富集选择性。Larsen等人[72]发现，在富集缓冲液和淋洗液中加入2,5-二羟基苯甲酸(DHB)可以有效减少MOAC材料的非特异性吸附，极大地提高其对磷酸化肽的富集选择性。相比带羧基的酸性肽段，DHB在TiO2上的结合力更强，可以竞争排斥溶液中的非磷酸化肽，而磷酸基团在TiO2上的结合力又强于DHB，所以，磷酸化肽便可以高选择性吸附在TiO2上。在此之后，具有同样作用的竞争吸附剂比如β-羟基丙酸、邻苯二甲酸、乳酸等依次出现。和IMAC材料类似，不同的金属氧化物对磷酸化肽的富集效果也不一样，例如，TiO2对多磷酸化肽具有良好的选择性，而ZrO2则偏向于富集多磷酸化肽[73]。镧系金属氧化物(La2O3、Gd2O3、CeO2)同样被证明对磷酸化肽具有良好的分离富集性能[74-76]，但是，值得注意的是，CeO2在富集磷酸化肽的同时，对磷脂键具有催化裂解作用[77]。因此，单一的MOAC策略同样难以获得满意的磷酸化肽分离富集效果。邓春晖课题组[78]制备了一种新型双金属氧化物石墨烯磁性复合材料((magG/(Ti−Sn)O4))，用于从鼠脑裂解液中富集磷酸化肽，该研究证明，双金属元素的引入对磷酸化肽的富集性能有极大提升，其富集效果要优于单一金属氧化物磁性材料(TiO2或者SnO2)以及简单的物理混合。Choi等人[79]提出了串联MOAC的互补策略，利用Fe3O4先富集多磷酸化肽，然后利用TiO2捕获溶液中剩余的单磷酸化肽，实现了的磷酸化肽的全面富集，提高了磷酸化蛋白质组学鉴定的覆盖率。参考文献[1]BaakJPA,JanssenEAM,SoreideK,etal.Genomicsandproteomics—thewayforward[J].AnnalsofOncology,2005,16:ii30-ii44.[2]SauerS,LangeBMH,GobomJ,etal.Miniaturizationinfunctionalgenomicsandproteomics[J].NatureReviewsGenetics,2005,6(6):465-476.[3]AggarwalK,LeeHK.Functionalgenomicsandproteomicsasafoundationforsystemsbiology[J].BriefingsinFunctionalGenomics,2003,2(3):175-184.[4]PandeyA,MannM.Proteomicstostudygenesandgenomes[J].Nature,2000,405(6788):837-846.[5]CoxJ,MannM.IsProteomicstheNewGenomics?[J].Cell,2007,130(3):395-398.[6]SmithLM,KelleherNL,LinialM,etal.Proteoform:asingletermdescribingproteincomplexity[J].NatureMethods,2013,10(3):186-187.[7]AebersoldR,AgarJN,AmsterIJ,etal.Howmanyhumanproteoformsarethere?[J].NatureChemicalBiology,2018,14(3):206-214.[8]JiangY,SunA,ZhaoY,etal.Proteomicsidentifiesnewtherapeutictargetsofearly-stagehepatocellularcarcinoma[J].Nature,2019,567(7747):257-261.[9]ShimogawaMM,SaadaEA,VashishtAA,etal.Cellsurfaceproteomicsprovidesinsightintostage-specificremodelingofthehost-parasiteinterfaceintrypanosomabrucei[J].Molecular&CellularProteomics,2015,14(7):1977-1988.[10]PicottiP,BodenmillerB,MuellerLN,etal.FulldynamicrangeproteomeanalysisofS.cerevisiaebytargetedproteomics[J].Cell,2009,138(4):795-806.[11]HortinGL,SviridovD.Thedynamicrangeproblemintheanalysisoftheplasmaproteome[J].JournalofProteomics,2010,73(3):629-636.[12]MoradianA,KalliA,SweredoskiMJ,etal.Thetop-down,middle-down,andbottom-upmassspectrometryapproachesforcharacterizationofhistonevariantsandtheirpost-translationalmodifications[J].Proteomics,2014,14(4-5):489-497.[13]ChenB,BrownKA,LinZ,etal.Top-downproteomics:readyforprimetime?[J].AnalyticalChemistry,2018,90(1):110-127.[14]ZhangY,FonslowBR,ShanB,etal.Proteinanalysisbyshotgun/bottom-upproteomics[J].ChemicalReviews,2013,113(4):2343-2394.[15]WuC,TranJC,ZamdborgL,etal.Aproteasefor'middle-down'proteomics[J].NatureMethods,2012,9(8):822-824.[16]DeribeYL,PawsonT,DikicI.Post-translationalmodificationsinsignalintegration[J].NatureStructural&MolecularBiology,2010,17(6):666-672.[17]GallegoM,VirshupDM.Post-translationalmodificationsregulatethetickingofthecircadianclock[J].NatureReviewsMolecularCellBiology,2007,8(2):139-148.[18]VucicD,DixitVM,WertzIE.Ubiquitylationinapoptosis:apost-translationalmodificationattheedgeoflifeanddeath[J].NatureReviewsMolecularCellBiology,2011,12(7):439-452.[19]KruegerKE,SrivastavaS.Posttranslationalproteinmodifications:currentimplicationsforcancerdetection,prevention,andtherapeutics[J].Molecular&CellularProteomics,2006,5(10):1799-1810.[20]PagelO,LorochS,SickmannA,etal.Currentstrategiesandfindingsinclinicallyrelevantpost-translationalmodification-specificproteomics[J].ExpertReviewofProteomics,2015,12(3):235-253.[21]CohenP.Theoriginsofproteinphosphorylation[J].NatureCellBiology,2002,4(5):E127-E130.[22]KarinM,HunterT.Transcriptionalcontrolbyproteinphosphorylation:signaltransmissionfromthecellsurfacetothenucleus[J].CurrentBiology,1995,5(7):747-757.[23]BourretRB,BorkovichKA,SimonMI.Signaltransductionpathwaysinvolvingproteinphosphorylationinprokaryotes[J].AnnualReviewofBiochemistry,1991,60(1):401-441.[24]HumphreySJ,JamesDE,MannM.Proteinphosphorylation:amajorswitchmechanismformetabolicregulation[J].TrendsinEndocrinology&Metabolism,2015,26(12):676-687.[25]SharmaK,D’SouzaRochelle

CJ,TyanovaS,etal.UltradeephumanphosphoproteomerevealsadistinctregulatorynatureofTyrandSer/Thr-basedsignaling[J].CellReports,2014,8(5):1583-1594.[26]IrishJM,HovlandR,KrutzikPO,etal.Singlecellprofilingofpotentiatedphospho-proteinnetworksincancercells[J].Cell,2004,118(2):217-228.[27]SantiniE,ValjentE,FisoneG.