T-SHAAV 028-2025 副猪格拉瑟菌MALDITOF MS快速鉴定方法

ICS65.020.30CCSB44SHAAV法MALDI-TOF-MSRapidIdentificationMethodofGlaesserellaparasuisT/SHAAV028—2025 II 12规范性引用文件 13术语和定义 14缩略语 15原理 16试剂和材料 17仪器与设备 28操作步骤 29结果报告 310生物安全及防污染措施 3附录A（规范性）质谱仪的校准 4附录B（资料性）副猪格拉瑟菌质谱数据库的建立 5T/SHAAV028—2025本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由上海市畜牧兽医学会提出并归口。本文件起草单位：上海市动物疫病预防控制中心、上海市松江区农产品质量安全检测中心、郑州安图生物工程股份有限公司、中元汇吉生物技术股份有限公司。本文件主要起草人：沈莉萍、徐锋、王晓旭、张玉杰、齐新永、王建、赵洪进、金一春、徐平、唐聪圣。本文件首批承诺执行单位名单：中国农业科学院上海兽医研究所、上海市动物疫病预防控制中心、河北省动物疫病预防控制中心、梅里埃诊断产品（上海）有限公司、郑州安图生物工程股份有限公司、中元汇吉生物技术股份有限公司、上海中江举帆科技有限公司。T/SHAAV028—2025副猪格拉瑟菌MALDI-TOFMS快速鉴定方法本文件规定了副猪格拉瑟菌的MALDI-TOFMS鉴定方法。本文件适用于副猪格拉瑟菌病的病原学检测与鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，标注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T33682基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则GB/T34750副猪嗜血杆菌检测方法GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1副猪格拉瑟菌Glaesserellaparasuis副猪格拉瑟菌原属于巴氏杆菌科（Pasteurellaceae嗜血杆菌属（Haemophilus因遗传特征差异被划归至新属，其分类地位现属于巴氏杆菌科（Pasteurellaceae），格拉瑟菌属（Glaesserella），故特说明副猪格拉瑟菌（Glaesserellaparasuis）与副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis）为同一种细菌。4缩略语下列缩略语适用于本文件。CHCA：α-氰-4-羟基肉桂酸(α-Cyano-4-HydroxycinnamicAcid，C10H7NO3）。TSA：胰蛋白胨大豆琼脂（TrypticaseSoyAgar）。MALDI-TOFMS：基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（Matrix-AssistedLaserDesorption/IonizationTimeofFlightMassSpectrometry）。5原理MALDI-TOFMS主要由两部分组成：MALDI（基质辅助激光解析电离离子源）和TOF（飞行时间质量分析器）。MALDI-TOFMS是近年来发展起来的一种新型软电离技术，原理是利用激光照射微生物标本与基质形成的共结晶体，基质吸收激光能量并传递给微生物所含生物分子，同时将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子而使生物分子电离，电离后的生物分子进入真空管，由于在真空管飞行过程没有外力作用，到达真空管顶端离子检测器的时间与其质量有关，即质量越大、飞行速度越慢，到达检测器的时间越长，按照质量/电荷（m/z）比值大小，将采集的数据与微生物指纹图谱库对照鉴定。6试剂和材料T/SHAAV028—20252除非有特殊说明，仅使用色谱级试剂，实验用水应符合GB/T6682的规定。6.1乙腈（Acetonitrile，CH3CN）。6.2无水乙醇（Ethanol，CH3CH2OH）。6.3三氟乙酸（Trifluoroaceticacid，CF3COOH）。6.4α-氰-4-羟基肉桂酸(α-Cyano-4-HydroxycinnamicAcid，C10H7NO3）。6.5TSA固体培养基：按照GB/T34750中A.1的规定执行。6.6标准菌株：大肠埃希氏菌ATCC8739。6.7样品靶板：适用于仪器的一次性或重复使用靶板。6.81μL接种环。6.9CHCA基质液：建议使用质谱仪配套的商品化CHCA基质液；也可参照以下方法配制，将乙腈、无水乙醇、水和三氟乙酸按33:33:33:1体积比例配制溶剂，加入CHCA充分溶解形成过饱和溶液，经10000×g离心1min后于低温冷藏柜中保存，使用时取上清。7仪器与设备7.1基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪。7.2二级生物安全柜。7.3二氧化碳培养箱或培养装置：36℃±1℃,5%CO2。7.4微量可调移液器：0.5μL~2μL、10μL~100μL、20μL~200μL、100μL~1000μL。7.5离心机：最大离心力≥16000×g。7.6旋涡震荡器。7.7低温冷藏柜：2℃~8℃。8操作步骤8.1样品的采集8.1.1样品应于猪死亡后2h内进行采集。8.1.2使用无菌器械切取病死猪的心脏、肺脏等组织样品，每个组织样品至少采集总体积的1/4，包含眼观正常部位和可疑病变部位，单独置于无菌容器内。8.1.3使用无菌注射器抽取胸腹水、心包积液及关节积液等体液样品，每个体液样品采集1mL~2mL，少于1mL的全部采集。8.1.4所有样品于低温冷藏柜保存，24h内送达实验室。8.2分离培养8.2.1组织样品：使用烧灼至适当温度的手术刀片对可疑病变部位的组织表面烧烙灭菌，于烧烙处无菌剪取组织块涂布在TSA固体培养基上，使用无菌接种环分区划线接种，置于二氧化碳培养箱或培养装置中培养24h~48h。8.2.2体液样品：吸取50μL加至TSA固体培养基，使用无菌接种环分区划线接种，置于二氧化碳培养箱或培养装置中培养24h~48h。8.3点靶8.3.1挑取培养24h~48h可疑单菌落2~3个，分别点在靶板不同的样品孔内，涂抹均匀。同时挑取大肠埃希氏菌ATCC8739单菌落进行点靶，用于质谱仪的校准。8.3.2用微量可调移液器吸取1μLCHCA基质液覆盖在样品表面，室温下晾干。8.4检测8.4.1进样：将制备好的靶板置于质谱仪的板架并装入仪器中，待真空度稳定后即可进行检测。8.4.2校准：每次样品检测前对质谱仪进行校准，详见附录A，使校准后对大肠埃希氏菌ATCC8739鉴定结果的置信水平达到99.9%或分值在2.00～3.00。8.4.3数据采集：运行仪器对数据进行采集和分析，并生成质谱图。T/SHAAV028—202538.4.4数据匹配：质谱图通过导入微生物指纹图谱库进行数据匹配。指纹图谱库可使用仪器自带数据库、互联网大数据库或根据要求自行建立的数据库进行比对，自行建立数据库可参考附录B。8.4.5鉴定结果：MALDI-TOFMS的质谱数据经数据库匹配得出鉴定结果，并得出相应的置信水平或分值。8.5结果判读8.5.1置信水平在90%及以上或分值在2.00～3.00，标记为绿色，表示鉴定结果的可信度高。8.5.2置信水平在80%~90%之间或分值在1.70～1.99，标记为黄色，表示鉴定结果为可信或可能。8.5.3置信水平在60%~80%之间，表示鉴定结果为可能。8.5.4标记为红色或无鉴定结果，表示鉴定结果不可信或无匹配数据。9结果报告9.1鉴定结果符合8.5.1的，报告为副猪格拉瑟菌阳性。9.2鉴定结果符合8.5.2的，需纯化培养后复检。复检结果仍符合8.5.1或8.5.2的，报告为副猪格拉瑟菌阳性；复检结果不符合8.5.1或8.5.2的，按9.3执行。9.3鉴定结果符合8.5.3的，建议按GB/T34750中的方法进行确认后报告。9.4鉴定结果符合8.5.4的，报告为副猪格拉瑟菌阴性。10生物安全及防污染措施所有样品、细菌培养物相关的实验材料的操作及废弃物处置均应按照GB19489规定的要求执行。4T/SHAAV028—2025(规范性)质谱仪的校准A.1菌株使用大肠埃希氏菌ATCC8739血平板24h~48h培养物，代次不超过5代。A.2根据表A.1中大肠埃希氏菌ATCC8739的13个特征峰值建立校准的参照表。表A.1大肠埃希氏菌ATCC8739的特征峰值序号1234567峰值4365.405096.805381.406241.406255.406316.206411.60序号89峰值6856.107158.807274.507872.109742.0012227.30A.3根据仪器说明书进行操作，核对校准结果，最多允许5个质谱峰的缺失，各峰值的偏差不大于3Da。大肠埃希氏菌ATCC8739的参考质谱图见图A.1。图A.1大肠埃希氏菌ATCC8739的参考质谱图T/SHAAV028—2025附录B(资料性)副猪格拉瑟菌质谱数据库的建立B.1菌株15株不同血清型的标准菌株。B.2参考质谱的建立根据仪器说明书进行操作，建库时需做双份样，同时须考虑不同的培养基、培养温度、培养环境、操作者等可能的影响因素。副猪格拉瑟菌质谱数据库可参照表B.1的相关参数。表B.1副猪格拉瑟菌参考质谱的相关参数序号峰值相对丰序号峰值相对丰序号峰值相对丰序号峰值相对丰12037.63573.99.0214742.03.0317148.622.322061.53653.78.3225024.84.6327308.132140.46.03746.6235083.065.9337745.63.442155.86.54154.72.8245527.23.6347761.75.4525