2025年版《中国药典》细菌内毒素检查法更新

2025年版《中国药典》细菌内毒素检查法更新1细菌内毒素检查法的更新2《中国药典》与《美国药典》

细菌内毒素检查法的主要差异3细菌内毒素检查法应用指导原则的更新4USP〈1085〉GUIDELINESONTHEENDOTOXINSTEST简介目录通则1143细菌内毒素检查法的更新u本次更新，通则1143采用“直接协调”方式转化实施了ICH

Q4B（Annex14）的检测方法；u参考EP10.0和JPXVII调整体例，修改相关内容与ICHQ4B协调一致，使检测法更加国际化；u2025年版《中国药典》于2025年3月25日颁布，自2025年10月1日起施行。2023年8月第一次公示稿2024年4月第二次公示稿修订历程历经三次公示征求意见后确定2024年7月第三次公示稿2024年11月草案审议通过主要修订内容1.修订细菌内毒素检查法的方法分类；2.修订鲎试剂的制备来源描述；3.修订供试品溶液制备的描述；4.修订供试品溶液制备中溶剂、酸碱溶液及缓冲液的要求；5.增加按体表面积给药时的K值和K的定义，并调整M中相应的表述；6.增加预备实验的描述；7.修订鲎试剂灵敏度复核试验的内容和判断的规定；8.凝胶检测技术干扰试验，增加计算溶液C和溶液B的值和修订结果判断描述；9.修订光度检测技术中动态显色法和终点显色法的定义。项目2020年版通则11432025年版通则1143类型方法学分类细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。可采用凝胶检测技术和光度检测技术，共包括以下六种方法：凝胶限度法（方法1）、凝胶定量法（方法2）、动态浊度法（方法3）、终点浊度法

（方法4）、动态显色法（方法5）、终点显色法（方法6）。修订仲裁方法当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度结果为准。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度法结果为准。修订细菌内毒素检查用

水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或小于0.005EU/ml（用于光度法）,

且对内毒素试验无干扰作用。应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶检测技术）或小于

0.005EU/ml（用于光度检测技术）,且对内毒素试验无干扰作用。修订变化对比表修订方法描述，首次明确标示六种方法项目2020年版通则11432025年版通则1143类型方法描述方法

1凝胶法凝胶检测技术（包括方法1和方法2）修订检查法凝胶限度试验凝胶半定量试验凝胶限度法（方法

1）凝胶定量法（方法

2）修订检查法方法

2光度测定法光度测定法分为浊度法和显色基质法。光度检测技术（包括方法

3、4、5、6）修订检查法浊度法浊度检测法修订检查法显色基质法显色检测法修订变化对比表修订方法描述，首次明确标示六种方法项目2020年版通则11432025年版通则1143类型鲎试剂鲎试剂是从鲎的血液中提取出的冻干试剂，可以与细菌内毒素发生凝

集反应。鲎试剂是从鲎的血液变形细胞中提取

制备的冻干试剂，可以与细菌内毒素

发生凝集反应。修订变化对比表修订鲎试剂的制备来源项目2020年版通则11432025年版通则1143类型供试品溶液制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。供试品一般采用溶解和/或稀释等适宜方法制成供试品溶液。修订供试品溶液制备所用溶剂、酸碱溶液及缓冲液应不含内毒素和干扰因子。所用溶剂、酸碱溶液及缓冲液应未检

测出内毒素并且不含干扰因子。修订u

为避免歧义，将供试品溶液的制备中，将“或在水性溶液中浸提”制备供试品溶液的描述删除。这句话有一定的误导性，如有的样品不溶于水，有的客户采用加水之后测试浸提液。u

“不含内毒素”

和“未检测出内毒素”

的区别？变化对比表修订供试品溶液的制备和溶剂、酸碱溶液及缓冲液的要求项目2020年版通则11432025年版通则1143类型内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L=K/M药品、生物制品

的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L=K/M删除变化对比表修订内毒素限值的确定u

因“生物制品”属于药品的一类，故本次在内毒素限值的确定项下予以删除。项目2020年版通则11432025年版通则1143类型内毒素限值的确定K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以

EU/（kg·h）表示，注射剂

K=5EU/（kg·h），放射性药品注射剂

K=2.5EU/

（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2EU/（kg·h）；K为人每千克体重或每平方米体表面积每小时最大可接受的内毒素剂量，以

EU/（kg·h）表示，注射剂

K=5EU/（kg·h），放射性药品注射剂

K=2.5EU/

（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2EU/（kg·h），按体表面积给药时K=100EU/（m2·h）；增加内毒素限值的确定M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以

ml/（kg·h）、mg/（kg·h）、或

U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按

1.62m2计算。注射时间若不足

1小时，按

1小时计算。供试品每平方米体表面积剂量乘以

0.027

即可转换为每千克体重剂量（M）。M为人用每千克体重或每平方米体表面积每小时的最大供试品剂量，以

ml/（kg·h）、mg/（kg·h）、

U/（kg·h）、ml/（m2·h）等表示，人均体重按

60kg计算。注射时间若

不足

1小时，按

1小时计算。修订变化对比表增加按体表面积给药时的K值和K的定义，并调整M中相应的描述。明确当放射性药品的用药途径为鞘内注射时，K值按

0.2EU/（kg·h）计。项目2020年版通则11432025年版通则1143类型试验内容制成

2λ

、λ

、0.5λ和

0.25λ四

个浓度

的内毒素标准溶液制成至少包含

2λ

、λ

、0.5λ和

0.25λ4个浓度的内毒素标准溶液修订判断试验是否有效当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为

阴性，试验方为有效。当最大浓度

2λ管均为阳性，最低浓度

0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。修订变化对比表修订凝胶法灵敏度复核试验内容和有效性判断不限制凝胶法鲎试剂灵敏度复核试验标准内毒素浓度个数！项目2020年版通则11432025年版通则1143类型试验内容按表

1制备溶液

A、B、C和

D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数

（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。按表

1制备溶液

A、B、C和

D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作，并计算溶液

C和溶液

B

的反应终点浓度的几何平均值。增加判断当系列溶液

B

的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，认为供试品

在该浓度下无干扰作用。当系列溶液

B

的结果在0.5λ~2λ之间（包括

0.5λ和2λ)

时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。修订变化对比表修订凝胶法干扰试验内容和结果判断项目2020年版通则11432025年版通则1143类型动态显色法（方法

5）动态显色法是检测反应混合物的吸光度或透光率达到某一预先设定的检测值所需要的反应时间，或检测

色度增长速度的方法。动态显色法是检测反应混合物的特定波长吸光度或透光率达到某一预先设定的检测值所需要的反应时间，或检

测色度增长速度的方法。修订终点显色法（方法

6）终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在的量化关系

来测定内毒素含量的方法。终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定。修订变化对比表修订光度检测技术中动态显色法和终点显色法的定义应对策略修订相关文件：质量标准、SOP、产品说明书等修订相关文件检查方法名称修订实验记录以及验证方案修订实验记录以及验证方案按修订后的K值和M值，计算L值并与原来计算的L值对比，进行评估是否需要重新进行方法学建立。关键变化2020年版药典更新为2025年版凝胶法和光度法修改为凝胶检测技术和光度检测技术。试验内容和结果判断结果计算和结果判断描述增加按体表面积给药时的K值和K的定义，并调整M中相应的描述项目引用标准更新方法学分类名称变化凝胶检测技术-灵敏度复核试验凝胶检测技术-干扰试验限值计算关键变化和应对策略中国药典与美国药典细菌内毒素检查法主要差异u

USP-NF（2025）

（85）BacterialEndotoxinsTest；u

ChP(2025)通则1143；中国药典与美国药典细菌内毒素检查法主要差异注射用水；细菌内毒素含量：凝胶检测技术小于0.015EU/ml;

光度检测技术小于0.005EU/ml。注射用水或其他程序产生的水；细菌内毒素含量没有具体要求。只有文字描述，没有计算公式中国药典鲎（美洲鲎或东方鲎）凝胶检测技术、浊度检测技术和显色检测技术42美国药典凝胶检测技术和光度检测技术2没有说明鲎种类4CE=antilg(Σlgc/2)细菌内毒素检查用水凝胶定量法结果计算公式鲎试剂凝胶检测技术干扰试验供试品平行管数检测技术凝胶检测技术结果

“+、—”复测管数指导原则9251细菌内毒素检查法应用指导原则的更新u修订指导原则9251细菌内毒素检查法应用指导原则（修订草案

两次）；u指导原则相关要求为推荐性技术要求；第一次公示稿2024年7月历经二次公示征求意见后确定2024年11月修订历程第二次公示稿草案审议通过2024年4月修订内容限值设定u新增眼科用药内毒素限值制定方法（参照USP1085）u新增原辅料和药包材的限值制定要求，建立综合性制定规范修订内容供试品前处理技术u补充常见干扰因素及排除措施（参照USP1085）u细化难溶性样品的前处理技术要求及操作规范u新增药包材样品前处理标准化流程修订内容质量控制新增项u明确塑料材质试管使用前需进行相容性验证的要求u补充不合格结果处理的技术建议（参照USP1085）u增加微量加样（<0.1ml）内毒素试验的特殊注意事项u系统阐述低内毒素回收现象的成因及应对方案u明确重组C因子法作为细菌内毒素检查法的补充检测方法u增加关于鲎试剂质量标准的合规性要求修订内容方法学协同更新与通则1143保持一致u同步更新方法学名称表述u统一β-葡聚糖名称内容u细菌内毒素限值的设定；u细菌内毒素检查方法的选择；u供试品的前处理方法；u产品细菌内毒素检查法的建立；u其他。（2）100ml及以上标示装量的注射液，细菌内毒素限值不得超过0.50EU/ml。（3）制定具有多种规格注射剂的细菌内毒素限值，限值的单位应与产品临床用法用按公式L=K/M计算（1）联合用药、体弱患者（儿科用药、营养不良用药和恶病质用药等），适当严格。细菌内毒素检查法应用指导原则1.细菌内毒素限值的设定细菌内毒素限值的设定考虑量（M）的标示单位一致。（4

）注射或植入眼内的药物产品，

其细菌内毒素限

值一般不得超过2.0EU/剂。眼科冲洗产品的内毒素

限值一般不得超过0.50EU/ml。（5

）制定原辅料和药包材的细菌内毒素限值时，

应根据制剂内毒素控制的要求，

基于风险评估，采用具体问题具体分析的原则。应根据其在制剂中的用量，结合生产工艺，

评估各组分对制剂引入细菌内毒素污染的潜在风险，合理分配并设定每一种成分和药包材的内毒素限值

。以确保即使每种成分和药包材细菌内毒素污染达到其限值，

按照批准的生产工艺生产的制剂细菌内毒素检查结果仍符合规定。细菌内毒素检查法应用指导原则1.细菌内毒素限值的设定考虑细菌内毒素检查法应用指导原则2.细菌内毒素检查方法的选择细菌内毒素检查法（通则

1143

）包括凝胶检测技术和光度检测技术共6种细菌内毒素检查方法。

供试品检测时可以选用其中任何一种方法进行细菌内毒素检查。“药典规定如不同方法的结果有争议时，以凝胶法的限度试验结果为准，这并不是说限度试验优于其他方法，只是由于凝胶法的限度试验发展历史最长、最为经典，所以被确定为仲裁方法，实际上6种方法具有相同的地位。”《中国药典分析检测技术指南》2017年版

光度检测技术光度检测技术（包括浊度法和显色法）可定量检测内毒素的含量，

能较为准确评估产品在生产过程中污染的相对

风险，定量检测的数据不仅有利于追

踪产品质量趋势，还能起到风险预警的作用，达到数据完整性的要求。凝胶检测技术凝胶检测技术的优点是操作简便，供试品在排除干扰作用后均可使用凝胶检测技术进行检验。干扰试验是确定供试品能否使用凝胶检测技术的决定因素。细菌内毒素检查法应用指导原则2.细菌内毒素检查方法的选择对于部分使用凝胶检测技术无法排除干扰的样品，可以尝试使用光度检测技术建立细菌内毒素检测方法。凝胶检测技术定性0.5~0.015EU/ml60分钟肉眼观察，人的主观判断为准，容易误判；只能查看一次，不能重复手工记录，存在篡改或丢弃数据风险光度检测技术定量0.005EU/ml一般30-60分钟；快速采集最快5分钟软件自动计算，结果准确；原始数据保存，可随时分析结果电子数据，原始数据不可修改和删除检测结果检测灵敏度反应时间查看结果数据记录凝胶检测技术与光度检测技术比较自动化实时保存的电子数据系统自动分析，随时可查系统可记录设备的使用状态系统提供审计追踪记录；可溯源到何人、何时、做了什么实验操作数据记录检测结果设备状态使用记录检测过程符合ALCOA+原则光度检测技术如何提高数据可靠性帮助公司确保数据可归属、清晰、同步、原始和准确保证患者安全符合合规要求全自动细菌内毒素检测解决方案全自动细菌内毒素检测系统的特点•消除技术人员在制备标准曲线和样品上可能造成的差异-

有效减少技术员操作实验的时间、提高效率-

有效减少误差和重测率•

全自动流程-技术人员仅需要添加样品、试剂和用具到平台上-系统自动稀释、加样到反应板并把反应板置于酶标仪中-

检测结果自动判断并可把稀释方案附在检测报告上高效率

满足数据可靠性要求全自动细菌内毒素检测系统的优点样品配制自动化高性价比节约资源节省空间高通量细菌内毒素检查法应用指导原则3.供试品的前处理方法u除另有规定外，一般应使用内毒素检查用水溶解样品进行细菌内毒素检查。u

难溶性或溶解度较低的样品可依据样品特性，

选择适宜的方法进行前处理，

前处理包括样品的溶解和干扰的排除。u

供试品前处理所用试剂的内毒素含量应对试验

无影响。u

采用包合技术的新型制剂如微球、

脂质体等供试品，应采取适宜方法将包合体破坏

，使包裹在内部的细菌内毒素完全释放，再进行检测。处理类别具体方法适用条件验证要求样品溶解①调节pH②加热③超声④添加助溶剂⑤有机溶剂溶解等难溶性或溶解度较低的样品在供试品中预先添加内毒素标准品，同步处理后进行干扰试验，确认方法不破坏/干扰内毒素。干扰排除①检查用水稀释②酸碱缓冲液稀释③超滤④萃取等溶解后需排除干扰的样品细菌内毒素检查法应用指导原则3.供试品的前处理方法样品前处理方法与验证流程名称处理方法大豆磷脂（供注射用）取本品，用助溶剂（按聚山梨酯802.5g与无水乙醇2.7ml的配比，充分混合后制备得到）溶解并制成0.1g/ml的溶液，再用内毒素检查用水至少稀释20倍后，依法检查（通则1143)。蛋黄卵磷脂（供注射用）角鲨烯取本品，用含0.25％聚山梨酯80(II）的检查用水将供试品制成试验所需浓度的溶液。丙交酯乙交酯共聚物(5050)取本品适量，以二甲基亚砜充分溶解，进一步使用细菌内毒素检查用水稀释至实验所需浓度（该溶液中二甲基亚砜浓度应小于0.

1%)。丙交酯乙交酯共聚物(7525)丙交酯乙交酯共聚物(8515)胆固醇取本品，加无水乙醇溶解至20mg/ml（必要时加热到60℃加快溶解），用

0.5mg/ml聚氧乙烯（35)蓖麻油水溶液稀释成10mg/ml，再用1.0mg/ml聚氧乙烯（35)蓖麻油水溶液稀释。非水溶性固体或液体的检测供试品溶液的制备u2025年版《中国药典》使用助溶剂、有机溶剂溶解样品名称处理方法活性炭（供注射用）活性炭所含内毒素本底值--称取约75mg活性炭加入5mlBET水配置成活性炭浓度为1.5%（1.5g/100ml）的混合液，漩涡混合9分钟，然后1500转离心5分钟，离心

后取上清液用0.22um无热原滤膜过滤，取续滤液检测。活性炭对细菌内毒素吸附力--取细菌内毒素国家标准品1支，按使用说明书配制成浓度为200EU/ml，20EU/ml的标准内毒素溶液备用，称取约75mg活性炭两份，分别加入5ml浓度为200EU/ml和20EU/ml的标准内毒素溶液配置成活性炭浓度为1.5%（1.5g/100ml）的混合液，漩涡混合9分钟，然后1500转离心5分钟，离心后

取上清液用0.22um无热原滤膜过滤，取续滤液检测。芝麻油取本品，加入细菌内毒素检查用水将供试品制成所需浓度的溶液，涡旋混合3分钟，离心，取水层，依法检查（通则1143)。蓖麻油非水溶性固体或液体的检测供试品溶液的制备u2025年版《中国药典》使用水浸提的样品或非水溶性固体或液体的检测供试品溶液的制备-存在问题和解决措施水稀释，溶液变浑浊、混悬液甚至凝固（凝固则无法进行下一步操作）直接稀释、离心或过滤处理非水溶剂溶解在样品溶解前，添加标准内毒素溶液到样品中，再溶解。样品溶解后再取出，加入内毒素标准品（不添加辅剂）中。样品溶解后再取出，添加标准内毒素溶液。u存在问题供试品溶液已经找到制

备的方法，而且通过了

干扰验证，但是往往做添加内毒素回收试验失

败了！u添加内毒素回收试验失败可能原因分析u

吸附；u

包裹；u

聚合；u

沉淀；添加内毒素回收试验u添加标准内毒素方法非水溶性固体或液体的检测在溶剂中添加标准内毒素溶液，再溶解样品。细菌内毒素检查法应用指导原则3.供试品的前处理方法u

容器类药包材一般采用加入标示容量的内毒素检查用水浸泡容器内腔的方法进行供试液制备；u

非容器类的药包材•

应将药包材置于无热原玻璃器皿内。•

采用其他器皿，

应选用无热原并经验证对试验无干扰的器具

，一般加入不超过40mL

的细菌内毒素检查用水进行供试液制备，

其中针对体积较大或者较小的药包材，

可以相应的增加或者减少提取液的体积，

同时在内毒素限量值方面做出相应的调整。细菌内毒素检查法应用指导原则3.供试品的前处理方法u无菌供应的药包材，应采用37℃±1℃,提取不少于1h的条件制备供试液，需经过验证。如采用其他方法制备供试液，需经过验证。u

对于非无菌供应的包装无菌药品的药包材，

应按照所包装制剂推荐的灭菌条件进行供试液制备。干扰因素干扰机制排除措施pH值影响鲎试剂的酶活性用含盐酸、氢氧化钠的BET水稀释或在Tris缓冲液中稀释来调节产品的pH值渗透压影响鲎试剂的酶活性一般采用BET水稀释即可螯合剂影响酶试剂的酶活性、LPS聚集用添加含镁离子的缓冲液的

BET水稀释β-葡聚糖影响鲎试剂的酶活性使用试剂生产商提供的β-葡聚糖阻滞剂非特异性蛋白质干扰

（例如丝氨酸蛋白酶）影响鲎试剂的酶活性稀释并结合加热细菌内毒素检查法应用指导原则3.供试品的前处理方法干扰因素干扰机制排除措施重金属影响鲎试剂的酶活性、LPS聚集用含1mmol/L整合剂乙二胺四乙酸（EDTA）的水稀释蛋白质影响鲎试剂的酶活性、LPS聚集用BET水或0.9%氯化钠溶液稀释，或稀释结合加热去污剂（表面活性剂）影响鲎试剂的酶活性、LPS聚集用BET水稀释钙阳离子影响鲎试剂的酶活性用含1mmol/L螯合剂EDTA的水稀释细菌内毒素检查法应用指导原则3.供试品的前处理方法细菌内毒素检查法应用指导原则4.产品细菌内毒素检查法的建立u

建立品种的细菌内毒素检查法时，

为验证样品和不同生产厂家鲎试剂反应的一致性，应使用两个生产厂家的鲎试剂对至少三批样品进行干扰试验。u

建立产品细菌内毒素检查法时，

若无法排除供试品对细菌内毒素检查的干扰作用，

或只能使用最高灵敏度鲎试剂（如凝胶检测技术为

0.03EU/ml，光度法为

0.001EU/ml）才能排除干扰，

则该品种不宜建立细菌内毒素检查项。细菌内毒素检查法应用指导原则5.其他u

塑料材质可能会引起干扰，

使用前应进行验证。u

采用凝胶检测技术检验时，

如果计算出的MVD值不是整数，可以使用小于MVD的整数进行试验。

当出现阳性结果时，为判断产品是否合格，需采用计算的MVD重新测试。u

当遇到不符合规定结果时，

应进行全面的回顾调查，确定试验的有效性。

为了获得超标供试品的细菌内毒素污染水平，凝胶检测和光度检测中均可以采用超过MVD的稀释倍数进行检验。细菌内毒素检查法应用指导原则5.其他u

供试品和鲎试剂的加样量一般为0.1ml，也可采用其他加样量进行内毒素检测，如采用小于0.1ml加样量开展凝胶试验，

或采用其他加样量进

行动态显色法试验。•动态显色法加样体积、预设OD值、所用微孔板等，

应参照试剂生产商的相关说明使用。•如采用的加样量较小时，

实验的准确性更容易受试验操作、环境污染、试管孔径（如凝胶试验因所用的试管孔径较小而受表面张力影响，

使鲎试剂与样品的反应混合物流动较慢，

易被误判为凝胶形成，

应注意观察）等外界条件的影响，

因此对试验操作有较高要求。结果如有争议时，可采用加样量为

的凝胶限度试验进行仲裁•

0.1ml

。造成结果有争议的主要原因u样品•

干扰情况：样品存在抑制/增强作用；•

样品细菌内毒素含量：处于临界值（在限值的50%~200%）或分布不均匀。u鲎试剂：凝胶检测技术鲎试剂灵敏度误差，可能导致结果差异；抗干扰能力差异（假阳性或假阴性）u操作差异：移液不准、计时错误、振动导致假阴性或污染引入内毒素。u实验条件差异：环境温度、孵育温度、使用的耗材等。u方法学差异•

方法学不同：凝胶检测技术、光度检测技术•

样品处理方法不同：稀释倍数、制备方法如何避免争议情况的发生u

设置比药典更严格的内控限值，设置至少2~4倍安全系数u

选用光度检测技术对产品的内毒素进行定量的、直观的检测和问题分析。u

定量的检测结果也有助于提前预防该情况的发生。细菌内毒素检查法应用指导原则5.其他u

低内毒素回收，也称为内毒素掩蔽，

是指无法使用细菌内毒素检查法正常检测到样品中的加标内毒素的现象。u判断低内毒素回收的方法是将已知浓度的标准内毒素添加到未稀释的样品中，随着时间的推移，

标准内毒素的回收率无法达到≥50％。u低内毒素回收会导致样品中的内毒素污染水平可能被低估或未被检测出。u

该现象无法通过稀释来排除

，需要时，

应在建立样品（如蛋白类生物制品）内毒素检测方法时进行研究。细菌内毒素检查法应用指导原则5.其他u

对于存在