分子克隆常用工具酶

分子克隆常用工具酶演示文稿第1页，共71页。

每一单链具有5’-3’极性两条单链间以氢键连接两条单链，极性相反，反向平行以中心为轴，向右盘旋StructureandfeaturesDNA的基本结构植物基因工程第2页，共71页。植物基因工程第3页，共71页。Replication植物基因工程第4页，共71页。分子克隆操作过程：

克隆目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成重组DNA→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。植物基因工程第5页，共71页。工具酶是指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。要把不同基因的DNA线形分子片段准确地切出来，需要各种限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）；要把不同片段连接起来，需要DNA连接酶（ligase）；要合成基因或其中的一个片段，需要DNA聚合酶（polymerase）等。因此，酶是DNA重组技术中必不可少的工具。植物基因工程第6页，共71页。核酸水解酶类核酸合成酶类核酸修饰酶类核酸内切酶核酸外切酶DNA聚合酶RNA聚合酶DNA连接酶磷酸酶核苷酸激酶核苷酸转移酶甲基化酶植物基因工程第7页，共71页。限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶用于核酸操作的常用工具酶植物基因工程第8页，共71页。工具酶名称

主要功能限制性内切核酸酶Restrictionendonucleases在DNA分子内部的特异性的碱基序列内部进行切割DNA连接酶DNAligase将两条以上的线性DNA分子或片段催化形成磷酸二酯键连接成一个整体DNA聚合酶IDNApolymeraseI通过向3‘端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单链裂口，即5’→3‘DNA聚合酶活性与3'→5'及5'→3'-外切酶活性多核苷酸激酶DNApolymerasekinease催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的5'-OH末端上反转录酶Reversetranscriptase以RNA分子为模板合成互补的cDNA链DNA末端转移酶DNAterminaltransferase将同聚物尾巴加到线性双链或单链DNA分子的3'-OH末端或DNA的3'-末端标记dNTP降解酶S1nucleaseS1降解单链DNA或RNA，产生带5'磷酸的单核苷酸或寡聚核苷酸，同时也可切割双链核酸分子的单链TaqDNA聚合酶TaqDNApolymerase能在高温（72℃）下的单链DNA为模板，从5'→3'方向合成新生的互补链常用的工具酶性质及功能植物基因工程第9页，共71页。第一节分子克隆最常用两个工具酶“分子剪刀”

⒈限制性核酸内切酶——在DNA上核苷酸的特定连接处以特定的方式把DNA双链切开。如EcoRI,HpaI“分子胶”⒉DNA连接酶——促使具有互补粘性末端或平头末端的载体和供体DNA片段连接，形成重组DNA分子。植物基因工程第10页，共71页。限制性内切酶

Restrictionenzymes“分子剪刀”

⒈限制性核酸内切酶——在DNA上核苷酸的特定连接处以特定的方式把DNA双链切开。如EcoRI,HpaI植物基因工程第11页，共71页。限制性内切酶是一种能识别DNA上特定碱基组成的序列并在这些序列位点上切断DNA分子水解磷酸二酯键的一种内切核酸酶。植物基因工程第12页，共71页。一、限制性核酸内切酶的分类植物基因工程第13页，共71页。二、限制性核酸内切酶的命名原则HindⅢ代表从流感噬血杆菌(Haemophilusinfluenzae)d株中分离到的第3个限制酶。植物基因工程第14页，共71页。

一般分子量为60kd，单链多肽，最适pH为6～8 NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，巯基有保护作用 对热不稳定，通常贮存于–20℃环境。为避免反复冻溶使酶失活，商品酶均含有50％甘油，使用时添加相应的缓冲液稀释，降低反应液中甘油的浓度。三、限制性核酸内切酶学特性植物基因工程第15页，共71页。每一种酶都有各自特异识别位点它对底物要求有特异的序列，通常的识别序列是4bp～6bp，有些则为7bp～8bp，甚或多于8bp。多数限制酶的识别序列为回文结构，在识别序列内或其附近水解DNA链中的磷酸二酯键。植物基因工程第16页，共71页。植物基因工程第17页，共71页。植物基因工程第18页，共71页。不同限制性内切酶切割的三种结果植物基因工程第19页，共71页。植物基因工程第20页，共71页。植物基因工程第21页，共71页。5`---GGATCC---3`3`---CCTAGG---5`5`---GGATCC---3`3`---CCTAGG---5`5`---AGATCT---3`3`---TCTAGA---5`5`---AGATCT---3`3`---TCTAGA---5`BglIIBamHⅠ同尾酶植物基因工程第22页，共71页。植物基因工程第23页，共71页。①温度：一般37℃ ②盐离子浓度：Na＋，Mg2＋ ③缓冲体系：具有稳定pH环境的Tris-HCl缓冲体系DTT用于保持酶

稳定性和活性 ④反应体积和甘油浓度：商品化的限制性内切核酸酶均加50％甘油作为保护剂，一般在-20℃保存。酶切反应时，加酶的体积一般不超过总反应的10％，否则甘油浓度过高，影响酶切反应⑤反应时间：通常为1h；进行大量DNA酶切反应时一般让酶解过夜⑥DNA纯度和结构DNA样品中所含的蛋白质、有机溶剂、RNA等杂质会影响酶切反应的速度和完全程度酶切的底物一般为双链DNA，DNA的甲基化位置会影响酶切反应。四、影响酶切反应的条件*植物基因工程第24页，共71页。II型限制性核酸内切酶酶解反应体系植物基因工程第25页，共71页。“星”活性Staractivity

“星”活性：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端ppH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性所谓的现象。

在名称右上角加一个星号(*)表示,如EcoRⅠ*：AATT；EcoRⅠ：GAATTC必须采用规范的实验步骤,应用推荐的反应条件。 植物基因工程第26页，共71页。位点偏爱（sitepreference）某些限制性内切酶对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。植物基因工程第27页，共71页。第二节DNA连接酶DNALigase植物基因工程第28页，共71页。定义：催化DNA上裂口两侧(相邻)核苷酸裸露的3＇羟基和5＇磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使断开的DNA裂口连接起来功能：具有修复单链或双链的能力,在DNA重组、复制和损伤后的修复中都起关键作用。一、DNA连接酶性质植物基因工程第29页，共71页。植物基因工程第30页，共71页。T4DNAligaseE.coliDNAligase来源T4噬菌体大肠杆菌分子量6000075000辅助因子ATPNAD+底物双链DNA分子的粘、平端RNA-DNA杂合体，RNA链缺口、双链DNA分子中的单链缺口同源互补粘端双链分子中的单链缺口应用范围广泛、效率高窄两种DNA连接酶比较二、常用连接酶植物基因工程第31页，共71页。连接反应的温度是影响转化效率的最重要参数。多数内切酶产生的粘性末端的Tm值在15℃以下，然而保持连接酶活性的最佳反应温度却是37℃ 但在该温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的，因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适温度的折衷，所以连接反应一般采用16℃过夜。三、DNA连接酶的反应条件植物基因工程第32页，共71页。DNA浓度：外源片段浓度比载体DNA浓度高5-10倍由于平末端的连接效率比粘性末端要低得多，故在平末端连接反应中，T4DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要求较高。防止环化：碱性磷酸酶预先处理质粒载体时间：过夜最好植物基因工程第33页，共71页。1）粘性末端DNA片段的连接植物基因工程第34页，共71页。直接用T4DNA连接酶连接：效率不高，较少采用。同聚物加尾连接平末端DNA片段：先用末端核苷酸转移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴后再用DNA连接酶进行连接用衔接物连接平末端DNA分子：目的是在平末端分子上构建限制性核酸内切酶酶切位点，经酶切后产生特异的粘性末端，从而与具有互补末端的DNA连接2)平末端DNA片段的连接植物基因工程第35页，共71页。应用互补同聚物加尾法连接DNA片段植物基因工程第36页，共71页。用衔接物分子连接平末端的DNA片段衔接物：指用化学方法合成的一段由若干个核苷酸组成的、具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段植物基因工程第37页，共71页。四、重组DNA实验的一般程序选用一种对载体DNA只具唯一限制识别位点的限制酶（如EcoRI）作位点特异的切割，形成全长的具粘性末端的线性DNA分子再将外源DNA片段也用同一种酶作相同的消化。混合，加入DNA连接酶。由于具有相同的（如EcoRI）粘性末端，能退火形成双链结合体。其中单链缺口经DNA连接酶封闭之后，便产生稳定的杂种DNA分子。植物基因工程第38页，共71页。第二节其他分子克隆工具酶植物基因工程第39页，共71页。一、DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶IK1enow片段T4DNA聚合酶TaqDNA聚合酶逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶RNA聚合酶依赖于DNA的DNA聚合酶植物基因工程第40页，共71页。用途：DNA缺口平移中标记DNA探针大肠杆菌DNA聚合酶I

以一条DNA为模板通过聚合作用把脱氧核苷酸加到双链DNA分子的3’-OH端而合成新的DNA.植物基因工程第41页，共71页。基本用途植物基因工程第42页，共71页。

大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenowfragment)

大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理,获得N端三分之二的大肽段,即Klenow酶。Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性，但失去了5’→3’的核酸外切酶活性。植物基因工程第43页，共71页。植物基因工程第44页，共71页。植物基因工程第45页，共71页。有3’→5’的核酸外切酶活性和5’→3’的DNA聚合酶活性。在无dNTP时，可以从任何3’-OH端外切

T4DNA聚合酶(T4phageDNApolymerase)植物基因工程第46页，共71页。基本用途植物基因工程第47页，共71页。植物基因工程第48页，共71页。TaqDNA聚合酶是从栖热水生菌(Thermusaquaticus)中分离纯化的依赖DNA的DNA聚合酶，最适温度75℃-80℃需要Mg2+(10mmol／L)，在低浓度Mn2+(2mmol/L)中有低活性，Ca2+使其完全失活，一价阳离子高至0.1moI／L对活性无影响，而最适浓度NaCl为40mmol/L，KCl为60mmol/L最适pH7.8(Tris-HCl)，与大肠杆菌DNA聚合酶相比，其最大特性是耐高温和无核酸酶活性TaqDNA聚合酶植物基因工程第49页，共71页。催化RNA体外合成反应依赖DNA的RNA聚合酶不依赖DNA的RNA聚合酶

RNA聚合酶植物基因工程第50页，共71页。反转录酶(reversetranscriptase)

反转录酶具有5′→3′的DNA聚合酶活性，以RNA为模板聚合cDNA链,同时又具有3′

→5′和5′

→3′的RNA外切核酸酶活性。AMV和MLV。主要用途：转录mRNA成为cDNA制备基因片段植物基因工程第51页，共71页。双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链植物基因工程第52页，共71页。DNA和RNA的修饰酶核酸酶SI碱性磷酸酶磷酸激酶末端脱氧核苷酸转移酶甲基化酶植物基因工程第53页，共71页。1）单链核酸酶SI功能：

降解ssDNA或ssRNA形成5’-磷酸末端的单或寡核苷酸片段。植物基因工程第54页，共71页。应用：分析DNA：RNA杂交体结构（S1mapping）。确定内含子部位。切除DNA片段上的单链末端，形成平末端.

切开cDNA合成过程中形成的发夹环在限制酶位点上产生小缺失植物基因工程第55页，共71页。植物基因工程第56页，共71页。Rnase

和

DNaseRNase-FreeDNase是一种DNaseI（核酸内切酶），可以降解双链或单链DNA。RNaseH：特异性地水解杂交到DNA链上的RNA磷酸二酯键，故能分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链。该酶不能消化单链或双链DNA。RNaseA：广泛应用的核酸内切酶。对RNA有水解作用，但对DNA则不起作用。Rnase酶非常稳定，常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活。DEPC处理。植物基因工程第57页，共71页。碱性磷酸酶

功能：催化去除DNA、RNA上的5’端磷酸基团,从DNA片段上除去5’磷酸以防自身连接。用途：在DNA连接之前常用它处理克隆载体以防止载体自身连接。植物基因工程第58页，共71页。植物基因工程第59页，共71页。磷酸激酶T4-多核苷酸磷酸激酶植物基因工程第60页，共71页。植物基因工程第61页，共71页。末端脱氧核苷酸转移酶

功能：在一定条件下，催化将一个一个的脱氧核苷酸，沿着5’到3’加到DNA链的3’-OH末端。该过程不需要DNA模板，对双链、单链DNA都适用。经常用于人工粘性末端的构建。末端脱氧核苷酰转移酶(TDT)植物基因工程第62页，共71页。甲基化酶

原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA不被相应的限制酶所切割。Dam甲基化酶可在GAmTC序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基。受其影响的酶有BccllII、MbbooII等。Dcm甲基化酶识别CCmAGG或CCmTGG序列，在第二个胞嘧啶C的C5位置上引入甲基。受其影响的酶有EccooRIIII等植物基因工程第63页，共71页。基因工程中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段DNA聚合酶I大片段具有完整DNA聚合酶I的5

3

聚合、35

外切活性，而无53

外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基植物基因工程第64页，共71页。思考题：载体构建的工具酶主要有那些类型？限制性核酸内切酶、同裂酶、同尾酶、宿主的限制与修饰。核酸内切酶命名原则、操作注意事项及产生星活性的原因、影响其酶活性的因素。T4DNA连接酶的性质及用途.Klenow酶的基本性质及用途。其他工具酶的用途。植物基因工程第65页，共71页。练习题第66页，共71页。1.一种DNA分子经三种限制酶完全酶切后得如下结果：

EcoRI5kbEcoRI/HindIII1、2、3、4kb

HindIII3kb、7kbEcoRI/PstI2、3、5kb

PstI10kbHindIII/PstI1、3、6kb

将各限制酶位点绘制在DNA分子上。

2.

另一DNA分子经相同处理后得如下结果，将各限制酶位点标在DNA分子上。

EcoRI1、3、6kbEcoRI/HindIII1、3kb

HindIII4、6kbEcoRI/PstI1、3、5kb

PstI2、8kbHindIII/PstI2、6kb

3.下图中的一段DNA分子上有两个限制酶PstI和EcoRI识别位点，两位点相距10bp，现有一研究生要分析EcoRI右侧500bp区域内的功能，他需要在这一区域内获得各种缺失突变体以确定某功能区，他应如何设计此实验？假定EcoRI—PstI间的10bp除去后并不影响任何结果分析，但PstI位点左侧的DNA不能除去

第67页，共71页。10bp500bp

PstIEcoRI4.假如PstI位点为另一限制酶HindIII，实验又该如何设计？

5.现有一研究者打算将一EcoRIDNA片段克隆到一个DNA分子的BamHI位点以便DNA扩增，但扩增后的DNA分子又可用BamHI限制酶将插入的片段回收，如何设计此实验。

6.一研究生要将一质粒（pI）上的BamHI-HindIII片段取代另一质粒（pII）上的BamHI-XbaI片段，所获重组质粒（pIII）上的插入片段要求能用BamHI-HindIII进行回收，问如何设计此实验？10bp500bp

HindIIIEcoRI第68页，共7