CN113913475B 酶或非酶生物柴油精制方法 （诺维信公司）

PI20157036222015.1201680058215.62016.10.07US2014186908A1,2014.07.03WO2013116342A2,2013.08.08本发明提供了一种降低生物柴油/脂肪酸烷包含脂肪酸烷基酯、游离脂肪酸和/或脂肪酸原料的组合物，使所述游离脂肪酸和/或所述脂肪酸原料与醇在一种或多种液体脂肪分解酶的存在下进行反应以产生脂肪酸烷基酯；和/或使所述游离脂肪酸和/或所述脂肪酸原料与醇在一种或多种非酶催化剂的存在下进行反应以产生脂2iii)通过以下减少所述油相/轻相中的游离脂肪酸的量和任选地所述脂肪酸原料的量：使所述游离脂肪酸和/或所述脂肪酸原料与醇在一种或多种液体脂肪分解酶的存在下v)将含有所述脂肪酸烷基酯的所述油相/vi)使所述游离脂肪酸和/或所述脂肪酸原料与醇在一种或多种非酶催化剂的存在下进行反应以产生脂肪酸烷基酯，进一步减少所述油相/轻相中的游离脂肪酸的量和任选地vii)在允许从所述油相/轻相中剩余的游离脂肪酸形成皂/viii)纯化和/或蒸馏所述脂肪酸烷基酯，包括在步骤iii)和vi)中产生的所述脂肪酸应中使游离脂肪酸和/或脂肪酸原料与醇进行反应以产生脂肪酸烷基酯直到所述反应已基重量计的10％-70.0％的量的水、以及在按所述水相/重相的重量计的10％-50％范围内的包括使游离脂肪酸和/或脂肪酸原料与醇进行反应直到所述脂肪酸原料中的至少90％w/w或至少95％w/w的脂肪酸酰基基团或游离脂肪酸已转化5.根据前述权利要求1-4中任一项所述的方法，其中在步骤iii)和/或步骤vi)中使所述脂肪酸和/或所述脂肪酸原料与醇进行反应直到所述脂肪酸原料中的所述游离脂肪酸6.根据前述权利要求1-4中任一项所述的方法，其中步骤i)中提供的所述组合物中水7.根据前述权利要求1-4中任一项所述的方法，其中通过如下反应提供i)中的所述组8.根据前述权利要求1-4中任一项所述的方法，其中通过如下反应提供i)中的所述组合物，在所述反应中所述一种或多种脂肪分解酶的总量是在0.005-5g酶蛋白(EP)/kg油或39.根据前述权利要求1-4中任一项所述的方法，10.根据前述权利要求1-4中任一项所述的方法，其中在步骤ii)中使用气流来将所述11.根据前述权利要求1-4中任一项所述的方法，其中在步骤ii)中使用真空来将所述12.根据前述权利要求1-4中任一项所述的方法，其中在步骤ii)中通过急骤干燥来减14.根据前述权利要求1-4中任一项所述的方法，其中步骤vi)中的醇的量相当于按所15.根据前述权利要求1-4中任一项所述的方法，其中步骤vi)的持续时间为0.5-7小肪分解酶的总量是在0.01-0.10g酶蛋白(EP)/kg油的18.根据前述权利要求1-4中任一项所述的方法，其中步骤vi)中的所述一种或多种非19.根据前述权利要求1-4中任一项所述的方法，其中步骤vi)中的所述一种或多种非20.根据前述权利要求1-4中任一项所述的方法，其中在加压系统中在75℃-95℃范围22.根据前述权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所24.根据权利要求23所述的方法，其中将所述一种或多种碱性试剂以对应于游离脂肪25.根据权利要求23所述的方法，其中用一种或426.根据权利要求24或25中任一项所述的方法，其中在35℃至70℃的范围内的温度下27.根据权利要求24或25中任一项所述的方法，其中所述碱性试剂是甲醇钠或甲醇钾29.根据权利要求28所述的方法，其中减少皂/脂肪酸盐的量的步骤在步骤vi)之前进30.根据前述权利要求1-4中任一项所述的方法32.根据前述权利要求1-4中任一项所述33.根据前述权利要求32中任一项所述的方法，其中将所述甘油进行纯化，通过干燥35.根据前述权利要求1-4中任一项所述的方36.根据前述权利要求1-4中任一项所述的方法，所240℃-260℃下进行热-真空蒸馏。39.根据权利要求1所述的方法，其中通过反应中使游离脂肪酸和/或脂肪酸原料与醇进行反应以产生脂肪酸烷基酯直到所述反应进40.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤ii)中通过对流45.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括如下步骤：546.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括如下步骤：通过使所述皂/脂肪酸盐与48.根据权利要求1所述的方法，其中通过允许所述脂肪酸50.根据权利要求1所述的方法，其中在60℃的温度下进行用一种或多种碱性试剂的处6[0004]本发明提供了一种降低生物柴油/脂肪酸烷基酯中游离脂肪酸水平的方法。该方[0005]i)使所述游离脂肪酸和/或所述脂肪酸原料与醇在一种或多种液体脂肪分解酶的[0006]ii)使所述游离脂肪酸和/或所述脂肪酸原料与醇在一种或多种非酶催化剂的存[0008]虽然目前生物柴油主要是化学产生的(使用例如NaOH和/或甲醇钠作为催化剂)，但是有几个相关的问题限制了它的发展，例如由于高含量的游离脂肪酸引起的油的预处[0009]通过使用脂肪分解酶作为催化剂，极大地防止了由化学[0011]使用液体酶来进行脂肪酸烷基酯的酶促生产工艺描述于例如，WO2Lv等人(ProcessBiochemistry[工艺生物化学]45(2010)446-450)和WO2012/化基于甘油酯的油中的游离脂肪酸的树脂的工业用途作为碱性化学生物柴油方法的预处7[0014]本发明提供了一种降低生物柴油/脂肪酸烷基酯中游离脂肪酸水平的方法，所述[0018]ii)减少所述组合物中的水量，例如将该水相/重相的水含量降低至按水相/重相[0020]iii)使所述游离脂肪酸和/或所述脂肪酸原料与醇在一种或多种液体脂肪分解酶[0021]iv)使所述游离脂肪酸和/或所述脂肪酸原料与醇在一种或多种非酶催化剂的存[0022]图1：显示通过脂肪酸或脂肪酸原料与醇的酶催化酯交换反应来制造脂肪酸烷基[0024]图3-9显示当使用根据本发明的方法来产生具有降低的游离脂肪酸含量的脂肪酸[0027]生物柴油：短链醇的脂肪酸烷基酯(FAAE)(如脂肪酸甲酯(FAME)和脂肪酸乙酯动物来源的油和脂肪可以在本发明的方法中被用作底物来生产脂肪酸802775中披露的南极假丝酵母(Candidaantarctica)脂肪酶A(CALA)；如在WO88/02775中披露并示于WO2008065060的SEQIDNO:1中的南极假丝酵母(C.antarctica)脂肪酶B毛腐质霉(Humicolalanuginosus))脂肪酶；在WO2000/60063或WO19疏棉状嗜热丝孢菌变体(具体地，示于WO95/22615的SEQIDNO:2的位置1-269处的脂肪酶)、Hyphozyma属脂肪酶(WO98/018912)、和米黑根毛霉脂肪酶(在WO2004/099400中的SEQIDNO:5))；来自产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP218272)、洋葱假单胞菌(EP95/06720和WO96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsi酶；芽孢杆菌属脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等人(1993),Biochemicaet[0033]与本发明相关的有用的脂肪酶是与SEQIDNO:2的成熟多肽，即与示于WO95/22615的SEQIDNO:2的位置1-269处的多肽、或与示于WO2008/065060的SEQIDNO:1的多[0034]适合在本发明的方法中使用的商业脂肪酶制剂包括LIPOZYMECALBL、LIPOZYME(R)TL100L、CALLERATMTRANS和Transform(全部都可从诺维信公司(Novozymes[0040]在项目(c)中所示的脂肪酶可以具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQID[0041]该脂肪酶可以是亲本脂肪酶的变体，该变体具有脂肪酶活性并且与SEQIDN9在对应于SEQIDNO:1的T231R+N233R的位置处以及D96E、D111[0042]在进一步的实施例中，该脂肪酶是如下变体，该变体具有脂肪酶活性并且与SEQ[0049]g)N33QG38A[0050]h)D27RN33Q[0053]k)D27RG38A[0057]o)D27RN33[0076]所述一种或多种脂肪分解酶可以是具有磷脂酶活性以及具有酰基转移酶活性的[0077]该磷脂酶可以选自披露于WO2008/036863和WO20003/2758中的多肽。合适的磷脂酶制剂是PURIFINE(R)(可从范恩尼姆公司(Verenium)获得)和LECITASE(R)ULTRA(可从诺重组产生的酶是天然的氨基酸序列的突变体和/或片段。天然的酶的含义中包含天然的变酶与天然的酶具有相同的氨基酸序列。该术语涵盖已经从生物体中分离的酶(在该生物体中该酶天然地存在，或在该生物体中该酶在相同类型的或其他类型的生物体中重组地表[0083]因此，可以通过使用任何合适的技术从微生物获得所述一种或多种脂肪分解(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite)，Rice等人，2000,TrendsGenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.中所实施的尼德尔曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。使用的参数是缺口开放罚分10、性”的尼德尔输出(使用-非简化(nobrief)选项获得)用作百分比同一性并且是如下计算[0090]本发明提供了一种降低生物柴油/脂肪酸烷基酯中游离脂肪酸水平的方法，所述[0094]ii)减少所述组合物中的水量，例如将该水相/重相的水含量降低至按该水相/重相的重量计在0-15％的范围内和/或将该油相/轻相的水含量降低至在200-600ppm的范围[0096]iii)使所述游离脂肪酸和/或所述脂肪酸原料与醇在一种或多种液体脂肪分解酶[0097]iv)使所述游离脂肪酸和/或所述脂肪酸原料与醇在一种或多种非酶催化剂的存[0102]ii)减少所述组合物中的水量，例如将该水相/重相的水含量降低至按水相/重相[0103]iii)通过使游离脂肪酸和/或脂肪酸原料与醇在一种或多种液体脂肪分解酶的存在下进行反应产生脂肪酸烷基酯，减少在该油相/轻相中的所述游离脂肪酸的量和任选地[0105]iv)通过使游离脂肪酸和/或脂肪酸原料与醇在一种或多种非酶催化剂的存在下进行反应产生脂肪酸烷基酯，进一步减少在该油相/轻相中的所述游离脂肪酸的量和任选[0106]可以通过如下反应来提供i)中的组合物，在该反应中将游离脂肪酸和/或脂肪酸在对应于按水相/重相的重量计的0-70％的量的甘油、对应于按水相/重相的重量计的10％-70.0％的量的水、以及在按水相/重相的重量计的10％-50％范围内的量的醇(如甲[0108]在步骤ii)中，该水相/重相的含水量可以降低至按水相/重相的重量计2％-15%[0109]该油相/轻相的含水量也可以降低至在200-600ppm的范围内，如在300-600ppm、[0111]含水量可以相当于按水相/重相的重量计的10％至60如10％至50％、10％至有较大量的结合的甘油的脂肪酸原料将增加水相/重相中的游离脂肪酸和/或脂肪酸原料与醇进行反应直至所述脂肪酸原料中的至少90％(w/w)或例[0114]在本发明的一些实施例中，使步骤iii)和/或步骤iv)中的所述脂肪酸和/或所述酸烷基酯。2.5gEP/kg油相/轻相或脂肪酸原料、0.005-1gEP/kg油相/轻相或脂肪酸原料、0.005-0.075gEP/kg油相/轻相或脂肪酸原料、0.005-0.05gEP/kg油相/轻相或脂肪酸原料、0.005-0.025gEP/kg油相/轻相或脂肪料、0.01-5gEP/kg油相/轻相或脂肪酸原料、0.02-5gEP/kg油相/轻相或脂肪酸原料、[0121]在根据本发明的方法中，步骤iii)中的醇的量可以相当于按油相/轻相的重量计[0122]步骤iv)中的醇的量可以相当于按油相/轻相的重量计的10％至25例如11％至[0123]在根据本发明的方法中，步骤iv)可以包括在进一步减少游离脂肪酸的量和任选[0125]步骤iii)中的一种或多种脂肪分解酶可以具体地是脂肪酶或者一种或多种脂肪[0126]步骤iii)中的所述一种或多种脂肪分解酶的总量可以是在0.01-0.10g酶蛋白树脂如多孔的聚合物基树脂上。可商购获得的这样的树脂的实例是来自朗盛公司[0129]步骤iv)中的反应可以在含有一种或多种固定化非酶催化剂的树脂床或柱、搅拌用具有集成的除水系统的更复杂的反应器，如气漏式分批反应器(airbobbledbatch[0133]根据其中将树脂填装在树脂床或柱中的实施例，树脂上的保持时间优选地在1-4[0135]在根据本发明的方法的各个步骤中使用的醇优选是C1-C5醇，更优选是乙醇或甲[0138]所述一种或多种碱性试剂能以以下量添加，该量相当于游离脂肪酸的量的1.0-[0139]用一种或多种碱性试剂处理可以包括使该油相/轻相和任选的所述水相/亲水相[0140]用一种或多种碱性试剂处理可以优选地在35℃至70℃的范围内，如在在35℃至65℃的范围内的温度下进行。酸化学计量滴定皂/脂肪酸盐以产生游离脂肪酸，如通过使该皂/脂肪酸盐与H3PO4和/或[0144]根据本发明的方法可以进一步包括将含有脂肪酸烷基酯的油相/轻相与亲水相/烷基酯(包括在步骤iii)和/或iv)中产生的任何脂肪烷基酯)是不必要的并且可以被避免。[0161]iv)通过使皂/脂肪酸盐进行酸化来产生游离脂肪酸，如通过使该皂/脂肪酸盐与[0162]v)通过使游离脂肪酸和/或脂肪酸原料与醇在一种或多种非酶催化剂的存在下进行反应产生脂肪酸烷基酯，进一步减少在该油相/轻相中的所述游离脂肪酸的量和任选地[0168]ii)将所述组合物中水的量降低例如至按该水相/重相的重量计的0-15％的范围[0169]iii)通过使游离脂肪酸和/或所述脂肪酸原料与醇以及一种或多种液体脂肪分解酶进行反应产生脂肪酸烷基酯，减少在该油相/轻相中的所述游离脂肪酸的量和任选地所[0170]iv)在允许从油相/轻相中的剩余游离脂肪酸形成皂/盐的条件下，使该组合物与[0177]ii)将所述组合物中水的量降低例如至按该水相/重相的重量计的0-15％的范围[0178]iii)通过使游离脂肪酸和/或所述脂肪酸原料与醇以及一种或多种液体脂肪分解酶进行反应产生脂肪酸烷基酯，减少在该油相/轻相中的所述游离脂肪酸的量和任选地所[0179]iv)通过使皂/脂肪酸盐进行酸化来产生游离脂肪酸，如通过使该皂/脂肪酸盐与[0181]vi)通过使游离脂肪酸和/或脂肪酸原料与醇在一种或多种非酶催化剂的存在下进行反应产生脂肪酸烷基酯，进一步减少在该油相/轻相中的所述游离脂肪酸的量和任选[0182]vii)纯化和/或蒸馏脂肪酸烷基酯，包括在步骤iii)和vi)中产生的脂肪酸烷基[0187]ii)将所述组合物中水的量降低例如至按该水相/重相的重量计的0-15％的范围[0188]iii)通过使游离脂肪酸和/或所述脂肪酸原料与醇以及一种或多种液体脂肪分解酶进行反应产生脂肪酸烷基酯，减少在该油相/轻相中的所述游离脂肪酸的量和任选地所[0189]iv)通过使皂/脂肪酸盐进行酸化来产生游离脂肪酸，如通过使该皂/脂肪酸盐与[0191]vi)通过使游离脂肪酸和/或脂肪酸原料与醇在一种或多种非酶催化剂的存在下进行反应产生脂肪酸烷基酯，进一步减少在该油相/轻相中的所述游离脂肪酸的量和任选[0193]viii)纯化和/或蒸馏脂肪酸烷基酯，包括在步骤iii)和vi)中产生的脂肪酸烷基[0194]通过以下实例进一步描述本发明，所述实例不应理解为对本发明的范围进行限[0198]目的是测试并开发一种可以大规模实施的产率>97％的简单的方法。本文开发的方法是基于在苛性洗涤步骤之前通过额外的液体酶步骤提[0204]a.将脂肪酶(具有SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列的脂肪酶)添加分为两次剂[0205]b.总甲醇剂量为1.5当量，从在0h时间添加21ml开始，在第一个20h内连续添加[0208]b.将混合物加热至80C/180F并干燥(终点20毫巴)1小时。重相测量(QTA)：水[0210]a.将干燥的混合物冷却至35C/95F并添加0.075％脂肪酶≈0.50ml并以530rpm混合[0227]a.将10g清澈的甘油相添加到0,73ml4NHCl中并伴随摇动加热至100C持续[0246]a)在80℃下，在15％的无水甲醇和0.4米柱高下，FFA可以从1.3％降低至平均[0247]b)在80℃下，在20％的无水甲醇和0.8米柱高下，FFA可以从1.3％降低至平均0.45而1.2米柱高能将FFA降低至平均