福建省食用菌行业协会团体标准 灵芝菌种繁育技术规程征求意见稿

ICS65.020B05FORMTEXT     T/FJHX0005—2023FORMTEXT     FORMTEXTTechnicalProceduresforSpawnPropagationofGanodermalucidum（征求意见稿）FORMTEXT2022-FORMTEXT××-FORMTEXT××发布FORMTEXT2023-FORMTEXT××-FORMTEXT××实施FORMTEXT福建省食用菌行业协会发布T/FJHX0005-2023前言 II1范围 12规范性引用文件 13术语和定义 14灵芝菌种繁育技术、关键控制点及技术参数流程图 35灵芝菌种繁育技术要求 36标签、包装、运输、贮存 87档案建立与留样 9附录A（规范性附录）灵芝母种培养基配方 10附录B（规范性附录）灵芝原种和栽培种常用培养基配方与配制 11附录C（规范性附录）灵芝液体菌种常用培养基配方 13参考文献 14前  言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则—第一部分：标准化文件的结构和起草规则》规定起草。请注意本文件中的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本标准由中国医学科学院药用植物研究所提出。本标准福建省食用菌行业协会归口。本标准起草单位:中国医学科学院药用植物研究所、福建仙芝楼生物科技有限公司、福建农林大学。本标准主要起草人：兰进、陈向东、李晔、吴长辉、谢宝贵、刘国辉、金高平。灵芝菌种繁育技术规程范围本标准确立了灵芝菌种繁育技术流程，关键控制点及技术参数，灵芝菌种繁育生产各环节的技术要求，包装、运输和贮存等。本标准适用于灵芝菌种繁育生产。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版权本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB3095环境空气质量标准GB5749生活饮用水卫生标准GB4806.7

食品安全国家标准食品接触用塑料材料及制品GB15168土壤环境质量标准GB/T191包装储运图示标志GB/T83211（所有部分）农药合理使用准则GB/T12728食用菌术语NY5099无公害食品食用菌栽培基质安全技术要求NY/T528食用菌菌种生产技术规程（菌种生产）NY/T1731食用菌菌种良好作业规范（生产场地环境卫生及其他条件）NY/T1742食用菌菌种通用技术要求（菌种质量）NY/T1935食用菌栽培基质质量安全要求《中华人民共和国药典》术语和定义GB/T12728界定的以及下列术语和定义适用于本文件。灵芝Ganodermalucidum广义灵芝指灵芝属的真菌，包括赤芝、紫芝、松衫灵芝、树舌灵芝等不同种类。药典收录可作为药材的仅有赤芝和紫芝。生产中以赤芝为主。狭义的灵芝通常指赤芝，本规程中涉及的灵芝均指赤芝。灵芝隶属于担子菌门Basidiomycota多孔菌科Polyporaceae灵芝属Ganodermae灵芝Ganodermalucidum(W.Curtis.:Fr.)P.Karst.子实体中等至大型，菌盖上具有环状棱纹和辐射状皱纹，柄侧生，与菌盖近垂直，少数偏生呈扇状，紫褐色，有光泽。孢子呈淡褐色至黄褐色，卵形。灵芝菌种spawnofGanodermalucidum经人工培养并可供进一步繁殖或栽培使用的灵芝菌丝体及其生长基质组成的繁殖材料包括母种、原种、栽培种。灵芝母种stockcultureofGanodermalucidum从孢子或组织分离所获得的、引进的原始菌种或者从保藏条件下转管活化扩大培养的菌种，具生长出灵芝子实体能力的菌丝体纯培养物，也称一级种、试管种。灵芝原种pre-culturespawnofGanodermalucidum由灵芝母种转接、扩大培养而成的菌丝体纯培养物，有固、液两种形态，也称二级种。灵芝栽培种plantingspawnofGanodermalucidum由灵芝原种移植、扩大培养而成的直接用于生产灵芝子实体的固体或者液体种，也称三级种。栽培种只能用于栽培，不可再次扩繁菌种。灵芝固体菌种solidspawnofGanodermalucidum用瓶（袋）盛装，以富含木质素、纤维素和淀粉等天然有机物为主要原料，添加适量的有机氮源和无机盐类，具一定水分含量的无菌基质上繁殖而成的灵芝菌丝体纯培养物。灵芝液体菌种liquidspawnofGanodermalucidum根据灵芝所需的营养成分，按一定的配比混合而成的营养液，以液相基质经发酵培养而成的灵芝菌丝体纯培养物。技术规程Technicalprocedures指为实现中药材生产顺利、有序开展，保证中药材生产质量，对中药材生产的基地选址，种子种苗或其他繁殖材料，种植、养殖或野生抚育技术，采收与产地初加工，以及包装、放行与储运等所做的技术规定和要求。是实施中药材规范生产的核心技术要求和实施指南。灵芝菌种繁育技术、关键控制点及技术参数流程图灵芝菌种繁育技术要求菌种繁育要求人员生产所需要的技术人员和检验人员应经过专业培训、掌握灵芝基础知识及灵芝菌种繁育生产技术规程要求。生产厂厂址选择宜选择生态条件良好的道地产区，区域环境空气应符合GB3095规定的二级标准，宜选择在交通运输方便，有水，通电，水质符合GB5749规定的标准，远离牲畜饲养厂、屠宰厂、厕所等环境污染的区域。厂房和车间宜采用钢结构、钢混结构及砖混结构的建筑，上有密闭顶棚，水泥铺设地面，房间要求保温、干燥、有通风设备，并可密闭，光线充足。房间均需安装水电设备。基本设施灵芝菌种生产厂房要求有各自隔离的摊晒场、原材料库、配料分装库。配套有配料区、搅拌区、装袋（瓶）区、灭菌区、冷却区、接种区、培养室、菌种检测室及菌种冷藏库、成品仓库等各环节的设施。冷却区、接种区、培养室应各自独立，方便操作，有条件的应该有离子净化设施。培养室宜选择洁净、通风、控温、遮光的场所。生产全过程推行“二维码”追溯管理。培养室使用前应认真清理，严格消毒和杀虫。生产区布局合理，与生活区严格分开。生产设备应该配备电子台秤或者机械台秤、不同感量的天平；枝丫切片机、木片粉碎机、秸杆粉碎机、混料机及拌料机；手工装料机或者自动化装料机；高压灭菌锅或常压灭菌锅；净化工作台、接种箱、有条件可配备自动化接种装置、摇床、不同体积液体发酵罐。还包括调温设备、除湿设备、培养架、各种培养箱、烘箱、冰箱及冷库。实验室设备应该配备酸度计、电位计、浊度计、电泳仪、分光光度计，有条件的可配备高效液相色谱、PCR仪、酶标仪、DNA测序仪等。应该配备各种离心机，研磨机，匀浆机、恒温水浴锅、微波炉、玻璃仪器烘干器、磁力搅拌器，超声波清洗器、水浴锅、振荡器、真空泵、摇床、液氮罐，有条件的可配备移液器、消解器、微波萃取仪、超临界萃取仪、纯水器、旋转蒸发仪、冷冻干燥机等。化学试剂消毒化学试剂常用的消毒药品有甲醛（HCHO）、高锰酸钾(KMnO4)、乙醇(C2H5OH)、新洁尔灭(C21H38NBr)、升汞(HgCl2)、漂白粉(CaOCl2)、过氧乙酸（CH3COOOH）、臭氧(O3)及各种食用菌消杀用气雾剂。制作培养基的化学试剂常用的葡萄糖(C6H12O6)、蔗糖(C12H22O11)、麦芽糖(C12H22O11)、碳酸钙(CaCO3)、磷酸钾(K3PO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、磷酸氢二钾(K2HPO4)、硝酸钾(KNO3)、硫酸钙(CaSO4)、硫酸镁（MgSO4）、硫酸铵[(NH4)2SO4]、盐酸（HCl）及氢氧化钠（NaOH)等。灵芝菌种生产灵芝菌种生产是通过严格的无菌操作技术大量培养、繁殖灵芝菌种的过程。灵芝菌种一般经过母种、原种、栽培种等三级菌种生产过程。这三级菌种生产，又需经过菌种转接、扩大培养到所需要的数量，方可投入大面积生产。可分为固体菌种生产和液体菌种生产。菌种质量要求使用多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum(Leyss.exFr.)Karst，经过品种审定或鉴定确认。根据用途选用多孢型或少孢型，适合当地气候条件的高产、优质、抗逆性强的品种。扩繁用菌种应来自具有相应资质的菌种生产单位，菌种生产应符合NY/T528的要求，菌种质量应符合NY/T1742规定的要求。原辅料要求原辅料质量安全要求应符合NY5099和NY/T1935的要求。接种要求接种室用臭氧或紫外线消毒0.5h以上；接菌箱宜用专用气雾消毒剂消毒0.5h以上；超净工作台宜用紫外线灯消毒不少于0.5h。接种用具、接种者双手用75％酒精擦洗消毒。或者在有离子净化设施的自动化接种系统。灵芝母种生产推荐按附录A要求进行。配制培养基，装入试管，高压121℃灭菌30min，摆好斜面，冷却后，在无菌条件下接入灵芝母种。一般钩取黄豆大小菌块放入斜面培养基中央即可，一支试管可接15～20支。接种后，将试管置25℃恒温箱或培养室中，温度23℃~28℃，避光培养7d~10d。灵芝母种的生产过程及菌种要求项目要求容器（玻璃试管或者培养皿）完整、无损、洁净棉塞或硅胶塞干燥、洁净，松紧适度，能满足透气和过滤要求培养基灌装量为试管总容量的1/3，培养皿高的1/3菌种外观菌丝体特征菌丝洁白、生长致密、均匀、健壮菌丝生长量长满斜面或平板菌丝体表面均匀、舒展、平整菌落边缘整齐菌丝分泌物无杂菌菌落无斜面背面外观培养基不干缩，无积水、无暗斑、无色素灵芝固体原种的生产推荐按附录B要求。准备各种原辅料，加水搅拌，充分混合，含水量在65％左右，pH6.0~pH6.5。装入菌种瓶（袋）中，稍压平，应使用透气和滤菌的棉塞或无棉盖体，菌种袋封口应使用套环或扎口。高压121℃灭菌1.5h~3h或者100℃灭菌24h~36h，冷凉后，接入母种，一般一支母种试管可接原种6～10瓶，用液体母种时，可直接将培养好的菌液倒入原种瓶。一瓶500mL三角瓶液体菌种，可接12～15瓶原种。接种完毕塞棉塞、无棉盖体，菌种袋封口应使用套环或扎口，即可移入培养室。室温23℃~25℃，空气相对湿度55 %～65 %条件下，避光培养30d~35d。灵芝固体原种的生产过程及菌种要求项目要求培养料符合NY5099和NY/T1935的要求，干燥、无霉变、容器完整、无破损、洁净，装料袋符合GB4806.7棉塞或塑料盖干燥、整洁、松紧适度、能满足透气和过滤要求培养基上表面距瓶口的距离45mm±5mm菌种外观菌丝生长量长满容器或者长到容器的4/5菌丝体特征菌丝体白、生长旺盛、整齐培养物表面菌丝体生长均匀培养基及菌丝体白色，紧贴瓶壁、无干缩菌丝分泌物无或者少量水珠杂菌菌落无子实体原基无灵芝生产种的生产灵芝代料菌种的生产推荐按附录B要求。主料与辅料充分混合，加水使含水量为65％左右，pH6.0~pH7.0。根据灭菌方式选用符合GB4806.7卫生要求的耐高压聚乙烯筒袋或者常压聚乙烯塑料袋。塑料袋规格一般长36cm、直径18cm、厚0.06mm~0.08mm。使用机械或人工装袋，培养料松紧度适宜。高压蒸汽灭菌121℃，灭菌2h~3h；常压灭菌温度95℃~100℃，灭菌时间24h~36h。待代料菌袋降温到30℃以下，无菌条件下进行接种，一瓶750mL原种可以接30-40袋。接种后，将菌袋置于20℃~25℃黑暗条件下培养，适当通风，培养35d~45d。成熟菌袋特征：菌袋内长满白色菌丝，手指重压菌袋略有弹性，菌丝体紧密粘结。检测标准与灵芝原种相同。灵芝段木生产种的生产树种选择主要是以壳斗科为主的阔叶树，松、杉、樟、桉等含油脂、芳香刺激性气味及有毒的树种不能用。常用的树种有青冈树、栓皮栎、蒙古栎、水曲柳、榛树、橡树、栗树、枫树、桦树、榉等。应就地取材，结合树种差别、树皮厚薄、材质软硬、树径大小等综合考虑。段木准备和制作伐木：伐木时间宜在10月中旬至翌年1月下旬的树木休眠期至春季萌芽前为好，砍伐树木应比段木接种时间提早1个月左右。木段直径6cm~30cm均可使用，但以6cm~15cm为宜，直径超过20cm的，可从中间劈开使用。截段：树木砍伐15d~30d后，含水量40%左右时截成长度10cm~35cm长的段木。把截好的段木剔去尖角和毛刺，用塑料绳捆扎成捆，装入长度60cm~80cm、直径30cm~35cm，厚度0.06mm~0.08mm的耐高压聚乙烯筒袋或者常压聚乙烯筒袋（应符合GB4806.7）。袋口一端扎紧，装入后可在段木上铺一薄层木屑，扎紧。高压蒸汽灭菌，121℃维持3h~4.5h，常压蒸汽灭菌，100℃保持36h~48h。段木接种与培养接种：待段木袋降温到30℃以下，在无菌条件下接种，一瓶750mL原种可以接15~20袋。培养：培养室（或棚）要求洁净、通风、控温、遮光。将接种后的段木菌袋移入培养室（或棚）中，在20℃~25℃温度下叠层培养80d~100d，培养期间适时通风。成熟菌袋特征：白色菌丝长满整个段木段，指压菌木略有弹性，菌丝体紧密粘结。有少量原基出现。灵芝段木栽培种感官要求项目要求容器（培养袋）完整、无损菌种外观菌丝体特征密集，尖端整齐，束状菌丝明细菌丝生长量长满容器不同部位菌丝体生长均匀培养基及菌丝体紧贴袋壁，无干缩表面分泌物无或有少量黄色水珠杂菌菌落无拮抗现象无脱壁无明显脱壁子实体原基无或有少量灵芝液体菌种生产液体菌种培养基原辅料质量安全要求应符合NY5099和NY/T1935的要求，推荐按附录C要求。三角瓶液体菌种生产采用150ml～500ml三角瓶，培养液添加至刻度的2／3处，封口灭菌。高压蒸汽灭菌，121℃维持0.5h。待培养液降温到30℃以下，无菌条件下进行接种，接种量为取2mm～3mm大小母种10块～12块，一支母种可以接3～5瓶。接种后，置摇床上，培养温度在23℃～26℃，振荡频率（搅拌速度）140r／min～160r／min下振荡培养4d～7d。液体菌种接种后第3天对三角瓶逐个进行纯度检验，及时清理未活或污染的三角瓶。摇瓶液体菌种感官要求项目检测方法要求容器肉眼观察完整、无破损、无裂纹菌液色泽肉眼观察菌丝体呈白色，滤液呈淡黄色菌液形态肉眼观察菌液澄清不浑浊，菌丝体密集菌丝生长量肉眼观察培养基1／2～1／3杂菌肉眼观察无杂菌菌种罐液体菌种生产填装培养基至液体菌种罐2／3处，按照液体菌种罐说明书要求，对液体菌种罐和液体培养液灭菌，待液体培养基冷却至30℃以下时进行接种。将培养好的三角瓶液体菌种接入到液体菌种罐中，接种量为培养基总体积的1％～3％，培养温度（25±2）℃，搅拌转速150r／min～160r／min，灌压0.02 MPa～0.04MPa，通风量0.7Nm3／h，培养时间5d～6d。液体菌种转接不得超过3次。检验液体菌种接种后第3天对罐内培养基进行纯度检验。及时清理未活或污染的罐内培养基后，对液体菌种罐高压消毒。储存发酵罐液体菌种生产后应及时使用。如不能及时使用，发酵罐内需持续通无菌空气，保持罐压0.02  MPa～0.03 MPa，常温下贮存时间不超过3 d。发酵罐液体菌种感官要求项目检测方法要求菌液色泽肉眼观察菌丝体呈白色，滤液呈淡黄色菌液形态肉眼观察、手感菌液澄清透明，不浑浊，菌丝体密集、均匀悬浮于液体中，不分层标签、包装、运输、贮存标签灵芝菌种标签应注明：灵芝菌种名称、菌号；接种日期；生产企业名称、地址；使用期限、贮存指南。包装本产品包装按GB/T191-2008的规定执行。禁用物质的包装材料禁止使用。包装前准备应对每批菌种按照标准进行质量检验，清除异物及劣质品。标志应注明灵芝菌种基原、产地、批号、规格、数量、生产企业名称、联系电话、地址等，包装上应有追溯码，以满足防伪查询、溯源查询；小心轻放、防湿、防晒、防潮、防压等图文标志。母种外包装要求采用木盒或有足够强度的纸材制作的纸箱，内部具有缓冲作用的轻质材料填满。原种、栽培种外包装要求采用木箱或有足够强度的纸材制作的纸箱，菌种间具有缓冲作用的轻质材料填满。箱内附产品合格证书和使用说明（包括菌种种性、培养基配方及适用范围）。运输不得与有害、有毒、有污染性的物质混合运输；不得用有害、有毒物质污染过的车辆运输。运输中必须有防震、防晒、防尘、防雨淋、防冻、防杂菌污染的措施。气温30℃以上时，需用0℃～20℃的冷藏车运输。贮存灵芝母种宜在4℃～6℃保存，贮存期不超过6个月。灵芝原种菌丝长满后，若短期不用，宜置于温度不超过20℃、干燥、通风避光、清洁卫生的室内贮存，贮存期不超过30d；在0℃～10℃下贮存，贮存期不超过45d。灵芝栽培种应尽快使用，在避光的室内存放，温度宜不超过25℃、清洁、通风、干燥，空气相对湿度50％，贮存时间30d内。在1℃～6℃下的冷库贮存时，贮存期不超过35d～45d。对于贮存灵芝菌种每隔20d进行一次检查，剔除破损、污染、生产异常的菌种。档案建立与留样记录保存完整、真实的产地环境质量资料，灵芝菌种生产过程、时间、操作人员、贮存及销售记录。留样各级灵芝菌种都应留样备查。贮存温度1℃～4℃。各级菌种各个批次留样数量不得少于5支（瓶、袋），至该批菌种正常生产。

（规范性附录）

灵芝母种培养基配方灵芝母种培养基配方PDA培养基：马铃薯（去皮）200g，琼脂18g～20g，葡萄糖20g，水l000mL。PSA培养基：马铃薯（去皮）200g，琼脂18g～20g，蔗糖20g，水l000mL。改良PDA培养基：马铃薯（去皮）200g，琼脂18g～20g，葡萄糖20g，水l000mL。磷酸二氢钾（KH2PO4）3g，硫酸镁(MgSO4.7H2O)1.5g，维生素B11mg。玉米粉、蔗糖培养基：玉米粉40g,蔗糖10g，琼脂18g～20g，水1000mL。麦麸培养基：麦麸100g，硫酸镁(MgSO4.7H2O)0.5g，磷酸二氢钾（KH2PO4）1.5g，葡萄糖20g，琼脂18g，水l000mL。灵芝母种培养基制作接配方精确称取各种营养物质。制备：马铃薯等块茎去皮后切块洗净，加水，文火煮沸30min后过滤取汁；玉米粉称重后加水1000mL，加热到70℃左右，保持60min，过滤取汁；麦麸称重后加水，文火煮沸30min后过滤取汁，最后补足水量至1000mL。酸碱度调整：灵芝一般要求pH5.5～6，用稀碱1mol/LNaOH、稀酸1mol/LHCl来调整酸碱度至适度为止。将称好的琼脂，加入上述配好的液体培养基中，边加热边搅拌，待琼脂完全熔化后，过滤，趁热进行分装。斜面培养基，装量为试管长度的四分之一。培养基分装好后均要加上棉塞或者胶塞。棉塞外包扎牛皮纸。装入高压灭菌锅灭菌，温度达121℃，保持30min。灭菌后，取出培养基按要求摆成斜面，放在25℃～28℃条件下，空白培养ld～2d，检查无污染，方可使用。

（规范性附录）

灵芝原种和栽培种常用培养基配方与配制培养基基质挑选新鲜、未受潮、无霉烂、不变质的原料，在使用之前先晾晒4d~6d。原种和代料栽培种栽培种培养基的配方基本相同，制作方法相似。几种常见的培养基配方及制法：木屑培养基阔叶树木屑78％，玉米粉18％，蔗糖1％，石膏粉1％，黄豆粉l.5％，硫酸镁0.5％。阔叶树木屑74％，麸皮25％，蔗糖0.8％，硫酸铵0.2％。阔叶树木屑80％，蔗糖1％，麸皮（或米糠）18％，石膏粉1％（或碳酸钙1％）。或加一定比例的尿素、碳酸钙、磷酸二氢钾。阔叶树木屑78％，麸皮（或米糠）13％，玉米粉7％，石膏粉1％，尿素1%。阔叶树木屑40％，棉子壳38％，麸皮15％，玉米粉3％，豆饼粉2％，蔗糖1％，石膏1％。a至b用于灵芝原种生产，c至e可以用作灵芝原种，也可以用于栽培种生产。制法：按配方称取原料，先将糖等辅料溶于水，其它原料混合搅拌，再加入糖水搅拌均匀，使料含水量达60％～65％。谷粒培养基是指以小麦、大麦、燕麦、高粱、米渣等为主料制作培养基。小麦（或燕麦、高粱、稻谷粒）98％，碳酸钙2％，也可用2％石膏替代碳酸钙。玉米粒100％，另加0.1％多菌灵（用于浸泡玉米粒）。小麦90%，石膏粉2％（或碳酸钙2％），木屑8％。玉米粒70％，阔叶树木屑25％，麸皮4.4％，石膏粉0.6％。稻谷粒50％，棉子壳40%，麸皮8％，石膏粉2％。a至d配方用于灵芝原种生产，e用于灵芝栽培生产。制法：选用无病虫害的小麦粒（大麦、燕麦、稻谷、玉米等），用清水浸泡8h～12h，玉米粒需用0.1％多菌灵液浸泡8h～12h，稍滤干，加石膏粉或碳酸钙等辅料，调至含水量60％～65％，pH值7即可。棉籽壳培养基，是指以棉籽壳等为主料制作培养基。棉籽壳98％，蔗糖1％，石膏粉1％。棉籽壳83％，麸皮15％，蔗糖1％，石膏粉1％。棉籽壳68％，木屑15％，麸皮13％，玉米粉2％，石膏粉1％，蔗糖1％。多用于灵芝栽培种生产，制法：按配方称取主料和辅料，先将棉籽壳加适量水拌匀，堆闷3h～4h，使其吸水，然后和辅料混匀，含水量60％～65％，PH值6～7。蔗糖渣培养基以蔗糖渣等为主料制作培养基。甘蔗渣80％，麸皮（或米糠）13％，玉米粉5％，石膏粉1％，过磷酸钙1％（或碳酸钙1％），含水量65％。甘蔗渣60％，阔叶树木屑25％，麸皮（或玉米粉）15％，含水量65％。适用于灵芝栽培种生产，制法：按配方称料，先将甘蔗渣加适量水拌匀，堆闷3h～4h，然后加辅料，搅拌均匀。玉米芯培养基以玉米芯为主料制作培养基。玉米芯78％，麸皮或米糠20%，石膏1％，蔗糖1％，含水量65％。玉米芯55％，阔叶树木屑30％，麸皮13％，石膏1％，蔗糖1％，含水量65％。适用于灵芝栽培生产，制法：将玉米芯粉碎成黄豆粒大小的颗粒，置pH10～11的石灰水中浸泡10h～12h，捞出，用水冲洗达中性，沥至