金雀异黄素对宫颈癌Hela细胞的抑制效应及机制探究

金雀异黄素对宫颈癌Hela细胞的抑制效应及机制探究一、引言1.1研究背景宫颈癌作为全球范围内严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率一直居高不下，给女性的生命健康带来了极大的危害。据世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的2020年全球癌症负担数据显示，2020年全球宫颈癌新发病例约60.4万例，死亡病例约34.2万例，在女性癌症发病和死亡原因中均位居前列。在我国，宫颈癌同样是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤，严重影响女性的生活质量和寿命。目前，临床上针对宫颈癌的治疗手段主要包括手术、放疗和化疗。手术治疗主要适用于早期宫颈癌患者，通过切除肿瘤组织达到治疗目的，但对于中晚期患者，手术往往难以彻底清除癌细胞，且手术创伤较大，术后恢复时间长，还可能引发一系列并发症，如感染、出血、淋巴囊肿等，对患者的身体机能和生活质量造成严重影响。放射治疗则是利用高能射线杀死癌细胞，可单独应用于无法手术的患者或作为手术前后的辅助治疗手段。然而，放疗不仅对癌细胞有杀伤作用，对周围正常组织也会产生一定的辐射损伤，导致患者出现放射性膀胱炎、直肠炎、阴道狭窄等不良反应，严重影响患者的生活质量，且部分患者对放疗不敏感，治疗效果不尽人意。化学治疗主要通过使用化学药物抑制癌细胞的生长和扩散，常用于晚期或复发转移的宫颈癌患者。但化疗药物在杀死癌细胞的同时，也会对正常细胞造成损害，引发严重的毒副作用，如恶心、呕吐、脱发、骨髓抑制、肝肾功能损害等，导致患者免疫力下降，生活质量降低，同时，长期使用化疗药物还可能使癌细胞产生耐药性，降低治疗效果。由于现有治疗手段存在诸多局限性，寻找新的治疗药物和方法成为了宫颈癌治疗领域的研究热点。近年来，天然植物提取物因其具有多种生物活性和相对较低的毒副作用，受到了广泛关注。金雀异黄素（Genistein）作为一种存在于豆科植物和齿状植物中的天然异黄酮化合物，具有广泛的抗肿瘤药理活性，能通过多种途径抑制肿瘤的生长和转移。已有研究表明，金雀异黄素在体内能阻止癌细胞的增殖和转移，进而发挥抗癌作用，且对人类的健康没有负面影响，这为其在宫颈癌治疗中的应用提供了良好的前景。因此，深入研究金雀异黄素抑制宫颈癌Hela细胞增殖迁移的作用及其机制，对于开发新的宫颈癌治疗药物和方法具有重要的理论意义和临床应用价值。1.2金雀异黄素研究现状金雀异黄素，又称染料木素，化学名为4',5,7-三羟基异黄酮，是一种存在于豆科植物和齿状植物中的天然异黄酮化合物。其分子结构由两个苯环（A环和B环）通过中央三碳链连接而成，形成了典型的异黄酮骨架结构，这种独特的化学结构赋予了金雀异黄素多种生物活性。在物理性质上，金雀异黄素为淡黄色树枝状针晶粉末，熔点较高，达到297-298℃，其在常用有机溶剂中具有一定的溶解性，但几乎不溶于水，而在稀碱溶液中溶解时会呈现黄色。金雀异黄素在抗肿瘤领域展现出了广泛的研究前景。流行病学研究发现，亚洲国家居民由于日常饮食中豆制品摄入较多，而豆制品是金雀异黄素的重要来源之一，这些地区居民的乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等多种癌症的发病率显著低于西方发达国家，提示金雀异黄素可能在肿瘤预防中发挥作用。大量的体外细胞实验和动物实验进一步证实了金雀异黄素的抗肿瘤活性。在体外，金雀异黄素对乳腺癌、胃癌、前列腺癌等多种癌细胞均显示出抑制生长、诱导分化和凋亡以及抑制细胞侵袭和转移的作用。例如，有研究表明金雀异黄素能够抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-435的增殖，并诱导其凋亡，使细胞周期阻滞在G2/M期；在人胃癌细胞SGC-7901中，金雀异黄素也能抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，并将细胞周期阻滞在G2/M期。在动物实验中，将金雀异黄素作用于接种了人乳腺癌细胞的裸鼠，结果显示金雀异黄素组较对照组肺转移率显著降低。金雀异黄素的抗肿瘤机制也是研究的重点。目前认为其作用机制主要包括以下几个方面：一是作为弱雌激素和抗雌激素作用，金雀异黄素的化学结构与内源性雌二醇相似，能够低亲和地结合雌激素受体。当体内雌激素水平过高时，金雀异黄素与雌激素竞争结合雌激素受体，从而减轻雌激素受体的促细胞增殖作用，降低雌激素相关的癌症发病危险性，发挥抗雌激素作用；而在雌激素水平较低时，金雀异黄素又能发挥弱雌激素作用。二是抗氧化作用，活性氧在癌变的发生过程中起着重要作用，特别是在促癌阶段，促癌剂会使细胞产生大量的活性氧自由基，这些自由基会对细胞的DNA、RNA、蛋白质等生物大分子造成氧化应激损伤，进而导致细胞癌变。金雀异黄素具有较强的抗氧化能力，能够清除体内过多的活性氧自由基，减少氧化应激损伤，从而抑制肿瘤的发生发展。三是抑制酪氨酸激酶活性，酪氨酸激酶在细胞信号传导过程中起着关键作用，其异常激活与肿瘤的发生、发展密切相关。金雀异黄素能够特异性地抑制酪氨酸激酶的活性，阻断细胞内的异常信号传导通路，从而抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。四是调节细胞周期和诱导细胞凋亡，金雀异黄素可以通过调节细胞周期相关蛋白的表达，使肿瘤细胞周期阻滞在特定时期，抑制细胞增殖；同时，它还能激活细胞内的凋亡信号通路，诱导肿瘤细胞凋亡。尽管金雀异黄素在多种肿瘤的研究中取得了一定进展，然而目前针对宫颈癌Hela细胞的研究仍相对较少。宫颈癌作为严重威胁女性健康的恶性肿瘤，现有治疗手段存在诸多不足，因此深入研究金雀异黄素对宫颈癌Hela细胞增殖迁移的作用及其机制，有望为宫颈癌的治疗提供新的策略和理论依据。1.3研究目的与意义本研究旨在深入探究金雀异黄素对宫颈癌Hela细胞增殖、迁移的抑制作用，并揭示其潜在的作用机制。具体而言，将通过细胞实验，如CCK-8法、细胞划痕实验、Transwell小室实验等，从多个角度系统地分析金雀异黄素对Hela细胞生长、迁移和侵袭能力的影响。同时，运用分子生物学技术，如蛋白质免疫印迹法（Westernblot）、实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）等，从蛋白和基因表达水平深入探讨金雀异黄素作用于Hela细胞的信号传导通路和相关分子机制，明确金雀异黄素发挥抑制作用的关键靶点和分子事件。金雀异黄素抑制宫颈癌Hela细胞增殖迁移作用及其机制的研究具有重要的理论意义和临床应用价值。从理论意义来看，目前虽然已知金雀异黄素具有抗肿瘤活性，但其在宫颈癌Hela细胞中的具体作用机制尚未完全明确。本研究深入剖析金雀异黄素对Hela细胞增殖迁移的影响及内在机制，能够进一步丰富和完善金雀异黄素抗肿瘤作用的理论体系，为理解天然植物提取物的抗癌机制提供新的视角和依据，有助于推动肿瘤生物学领域的理论发展。从临床应用价值而言，宫颈癌的现有治疗手段存在诸多局限性，如手术创伤大、放疗和化疗的毒副作用严重且易产生耐药性等。若能证实金雀异黄素对宫颈癌Hela细胞具有显著的抑制增殖迁移作用，并明确其作用机制，将为宫颈癌的治疗提供新的潜在药物靶点和治疗策略。这不仅有可能开发出新型、高效、低毒的宫颈癌治疗药物，提高患者的治疗效果和生活质量，还能为临床医生在宫颈癌治疗方案的选择上提供更多的参考和思路，具有广阔的应用前景和重要的现实意义。二、实验材料与方法2.1实验材料2.1.1细胞系本实验采用的人宫颈癌Hela细胞系购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。Hela细胞是第一个来自人体组织经连续培养获得的非整倍体上皮样细胞系，于1951年由GeyG.O.等从31岁女性黑人的宫颈癌组织成功建立。经原始组织切片重新观察，Jones等将其诊断为腺癌。该细胞系含有人乳头状瘤病毒HPV18序列，具有较强的增殖和迁移能力，在宫颈癌研究领域应用广泛。细胞培养条件为：使用含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，FBS）、1%双抗（青霉素-链霉素混合液，Penicillin-StreptomycinSolution）的MEM（MinimumEssentialMedium）培养基，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养，每2-3天更换一次培养基，待细胞融合度达到80%-90%时进行传代。传代时，先用不含钙、镁离子的PBS（PhosphateBufferedSaline）润洗细胞1-2次，加入适量0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，37℃消化1-2分钟，在显微镜下观察细胞消化情况，待细胞大部分变圆并脱落时，加入含血清的培养基终止消化，轻轻吹打制成细胞悬液，按1:3-1:4的比例接种到新的培养瓶中继续培养。2.1.2实验试剂与仪器实验试剂：金雀异黄素（Genistein）购自Sigma公司，纯度≥98%，用DMSO（二甲基亚砜，DimethylSulfoxide）溶解配制成100mM的储存液，-20℃避光保存，使用时用培养基稀释至所需浓度；胎牛血清（FBS）购自Gibco公司；MEM培养基、PBS缓冲液、0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液、青霉素-链霉素混合液（100×）均购自HyClone公司；CCK-8试剂盒（CellCountingKit-8）购自日本同仁化学研究所；Transwell小室（8.0μm孔径）购自Corning公司；Matrigel基质胶购自BD公司；RIPA裂解液（Radio-ImmunoprecipitationAssayLysisBuffer）、BCA蛋白定量试剂盒（BicinchoninicAcidProteinAssayKit）购自碧云天生物技术有限公司；PVDF膜（PolyvinylideneFluorideMembrane）购自Millipore公司；ECL化学发光试剂（EnhancedChemiluminescenceReagent）购自ThermoFisherScientific公司；一抗兔抗人p-AKT（phospho-AKT）、AKT（ProteinKinaseB）、p-mTOR（phospho-mTOR）、mTOR（MammalianTargetofRapamycin）、GAPDH（Glyceraldehyde-3-PhosphateDehydrogenase）及相应的二抗山羊抗兔IgG-HRP（GoatAnti-RabbitIgG-HorseradishPeroxidase）均购自CellSignalingTechnology公司；TRIzol试剂购自Invitrogen公司；反转录试剂盒、SYBRGreenPCRMasterMix购自TaKaRa公司。实验仪器：CO₂细胞培养箱（ThermoFisherScientific公司）；超净工作台（苏州净化设备有限公司）；倒置显微镜（Olympus公司）；酶标仪（BioTek公司）；高速冷冻离心机（Eppendorf公司）；恒温振荡培养箱（上海智城分析仪器制造有限公司）；垂直电泳仪、转膜仪（Bio-Rad公司）；化学发光成像系统（Tanon公司）；实时荧光定量PCR仪（AppliedBiosystems公司）。2.2实验方法2.2.1细胞培养从液氮罐中取出冻存的Hela细胞，迅速放入37℃水浴锅中，轻轻晃动，使其在1-2分钟内快速解冻。将解冻后的细胞悬液转移至含有5mL完全培养基（MEM培养基中添加10%胎牛血清和1%双抗）的15mL离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清液，加入适量完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种于T25培养瓶中，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养。当细胞融合度达到80%-90%时进行传代。首先弃去培养瓶中的旧培养基，用3mL不含钙、镁离子的PBS缓冲液润洗细胞1-2次，以去除残留的培养基和杂质。加入1mL0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，轻轻晃动培养瓶，使消化液均匀覆盖细胞，将培养瓶放入37℃培养箱中消化1-2分钟。在显微镜下观察细胞消化情况，当细胞大部分变圆并开始脱落时，立即加入2mL含血清的培养基终止消化，用吸管轻轻吹打细胞，使其完全脱离瓶壁并分散成单细胞悬液。将细胞悬液转移至15mL离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清液，加入适量完全培养基重悬细胞，按照1:3-1:4的比例将细胞接种到新的培养瓶中，添加适量完全培养基，放回培养箱继续培养。当需要冻存细胞时，先将细胞消化成单细胞悬液并离心收集，弃去上清液。用预冷的冻存液（70%完全培养基、20%胎牛血清、10%DMSO）重悬细胞，调整细胞密度为1×10⁶-5×10⁶个/mL，将细胞悬液分装至冻存管中，每管1mL。将冻存管放入程序降温盒中，先置于-80℃冰箱过夜，然后转移至液氮罐中长期保存。2.2.2CCK-8细胞增殖实验取对数生长期的Hela细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，用完全培养基重悬细胞，制成细胞悬液，调整细胞密度为5×10³个/mL。将细胞悬液接种到96孔板中，每孔100μL，每组设置6个复孔。将96孔板置于37℃、5%CO₂培养箱中培养24h，使细胞贴壁。待细胞贴壁后，吸去原培养基，分别加入含不同浓度金雀异黄素（0、5、10、20、40、80μmol/L）的完全培养基，每孔100μL，对照组加入等量不含金雀异黄素的完全培养基。继续培养24h、48h和72h。在各时间点结束前，每孔加入10μLCCK-8溶液，轻轻振荡混匀，继续在培养箱中孵育1-2h。然后用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。根据OD值计算细胞增殖抑制率，公式为：细胞增殖抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。CCK-8法的原理是利用细胞内的脱氢酶能够将CCK-8试剂中的WST-8还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物，其生成量与活细胞数量成正比，通过检测甲瓒产物的吸光度即可反映细胞的活性和增殖情况。2.2.3细胞计数与集落实验取对数生长期的Hela细胞，消化后制成细胞悬液，用血细胞计数板进行细胞计数。将细胞悬液调整为合适密度，如1×10³个/mL。取1mL细胞悬液接种于6孔板中，每组设置3个复孔，然后加入含不同浓度金雀异黄素（0、10、20、40μmol/L）的完全培养基，使总体积为2mL，对照组加入不含金雀异黄素的完全培养基。轻轻晃动6孔板，使细胞均匀分布，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。在培养过程中，每隔2-3天更换一次培养基。持续培养10-14天，待细胞形成肉眼可见的集落时，终止培养。弃去培养基，用PBS轻轻冲洗细胞2-3次，以去除残留的培养基。加入1mL甲醇，室温固定15-20分钟，使细胞固定在孔板上。弃去甲醇，待孔板干燥后，加入1mL0.1%结晶紫溶液，室温染色15-20分钟，使集落着色。用流水缓慢冲洗孔板，去除多余的结晶紫染液，自然晾干。在显微镜下观察并计数大于50个细胞的集落数，计算集落形成率，集落形成率（%）=（集落数/接种细胞数）×100%。通过比较不同浓度金雀异黄素处理组与对照组的集落形成率，研究金雀异黄素对Hela细胞增殖的影响。2.2.4划痕实验取对数生长期的Hela细胞，消化后接种于6孔板中，每孔2×10⁵个细胞，加入完全培养基，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，待细胞融合度达到90%-100%时，用无菌的200μL移液器枪头在细胞单层上垂直划痕。用PBS轻轻冲洗细胞3次，以去除划下的细胞碎片。分别加入含不同浓度金雀异黄素（0、10、20、40μmol/L）的无血清培养基，对照组加入无血清培养基，每孔2mL。在划痕后0h、24h、48h用倒置显微镜在相同视野下拍照记录划痕宽度。使用图像分析软件（如ImageJ）测量划痕宽度，计算细胞迁移率，细胞迁移率（%）=（0h划痕宽度-th划痕宽度）/0h划痕宽度×100%。通过比较不同时间点不同浓度金雀异黄素处理组与对照组的细胞迁移率，观察金雀异黄素对Hela细胞迁移能力的影响。2.2.5粘附实验将96孔板用50μg/mL的纤连蛋白（Fibronectin，FN）溶液包被，每孔100μL，4℃孵育过夜。次日，弃去包被液，用PBS洗涤3次，每次5分钟，以去除未结合的纤连蛋白。将对数生长期的Hela细胞消化后，用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度为1×10⁵个/mL。分别加入含不同浓度金雀异黄素（0、10、20、40μmol/L）的无血清培养基，对照组加入无血清培养基，每孔100μL，每组设置6个复孔。将96孔板置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育1h，使细胞与纤连蛋白充分接触并粘附。轻轻吸去上清液，用PBS洗涤3次，每次5分钟，以去除未粘附的细胞。每孔加入100μL0.1%结晶紫溶液，室温染色15-20分钟。用PBS洗涤3次，每次5分钟，去除多余的结晶紫染液。加入100μL33%醋酸溶液，振荡10-15分钟，使结晶紫充分溶解。用酶标仪在570nm波长处测定各孔的吸光度（OD值），OD值与粘附细胞数量成正比，通过比较不同浓度金雀异黄素处理组与对照组的OD值，分析金雀异黄素对Hela细胞粘附能力的作用。2.2.6Transwell小室实验迁移实验：实验前将Transwell小室（8.0μm孔径）从4℃冰箱取出，平衡至室温。取对数生长期的Hela细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度为5×10⁴个/mL。在上室加入200μL细胞悬液，下室加入600μL含10%胎牛血清的完全培养基作为趋化因子。分别设置对照组（加入无血清培养基重悬的细胞）和不同浓度金雀异黄素处理组（在细胞悬液中加入不同浓度金雀异黄素，使其终浓度分别为0、10、20、40μmol/L），每组设置3个复孔。将Transwell小室置于37℃、5%CO₂培养箱中培养24h。培养结束后，取出Transwell小室，弃去上室培养液，用PBS轻轻冲洗2次。用棉签轻轻擦去上室未迁移的细胞，将小室放入甲醇中固定15-20分钟。取出小室，晾干后用0.1%结晶紫溶液染色15-20分钟。用PBS冲洗3次，在显微镜下随机选取5个视野，计数穿膜细胞数，计算平均穿膜细胞数，比较不同浓度金雀异黄素处理组与对照组的穿膜细胞数，以评估金雀异黄素对Hela细胞迁移能力的影响。侵袭实验：在迁移实验基础上，实验前先将Matrigel基质胶用无血清培养基按1:8稀释，取50μL稀释后的Matrigel基质胶均匀铺于Transwell小室上室底部，37℃孵育1-2h，使其凝固形成基质胶膜。后续细胞处理及培养步骤同迁移实验，但培养时间延长至48h。培养结束后，按照迁移实验的方法固定、染色、计数穿膜细胞，分析金雀异黄素对Hela细胞侵袭能力的影响。2.2.7Westernblot检测蛋白表达收集不同处理组的Hela细胞，用预冷的PBS洗涤2-3次，以去除细胞表面的杂质和培养基。向细胞中加入适量含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上裂解30分钟，期间轻轻晃动使裂解充分。将裂解后的细胞悬液转移至1.5mL离心管中，12000rpm、4℃离心15分钟，取上清液即为总蛋白提取物。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，具体操作按照试剂盒说明书进行。将蛋白样品与5×上样缓冲液按4:1比例混合，100℃煮沸5分钟使蛋白变性。根据蛋白浓度，取适量变性后的蛋白样品上样于SDS-PAGE凝胶（根据目标蛋白分子量选择合适浓度的凝胶），进行电泳分离。电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜上，转膜条件根据膜的规格和蛋白分子量进行调整。转膜完成后，将PVDF膜放入5%脱脂奶粉溶液中，室温封闭1-2h，以减少非特异性结合。封闭结束后，将PVDF膜放入含有相应一抗（兔抗人p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、GAPDH等，稀释比例根据抗体说明书确定）的封闭液中，4℃孵育过夜。次日，取出PVDF膜，用TBST缓冲液洗涤3次，每次10分钟，以去除未结合的一抗。然后将PVDF膜放入含有HRP标记的二抗（山羊抗兔IgG-HRP，稀释比例根据说明书确定）的封闭液中，室温孵育1-2h。孵育结束后，用TBST缓冲液洗涤3次，每次10分钟。最后，将PVDF膜与ECL化学发光试剂孵育1-2分钟，利用化学发光成像系统曝光显影，采集图像。使用图像分析软件（如ImageJ）分析条带灰度值，以GAPDH作为内参，计算目标蛋白的相对表达量，比较不同处理组间目标蛋白表达水平的差异。2.2.8RT-PCR检测mRNA表达采用TRIzol试剂提取不同处理组Hela细胞的总RNA，具体操作按照TRIzol试剂说明书进行。提取的RNA用无RNA酶的水溶解，通过测定260nm和280nm处的吸光度值（OD₂₆₀/OD₂₈₀）来评估RNA的纯度和浓度，理想的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应在1.8-2.0之间。取适量RNA样品，按照反转录试剂盒说明书进行反转录反应，将RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，利用SYBRGreenPCRMasterMix进行实时荧光定量PCR扩增。根据目标基因（如与FAK-paxillin信号通路相关基因）和内参基因（如GAPDH）的序列设计特异性引物，引物序列如下（引物序列根据实际研究的基因进行设计和选择）：目标基因上游引物：5'-XXXXXXX-3'目标基因下游引物：5'-XXXXXXX-3'GAPDH上游引物：5'-XXXXXXX-3'GAPDH下游引物：5'-XXXXXXX-3'PCR反应体系（20μL）：SYBRGreenPCRMasterMix10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.8μL，cDNA模板1μL，ddH₂O7.4μL。反应条件：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃退火30秒，共40个循环。在实时荧光定量PCR仪上进行扩增反应，反应结束后，根据仪器自动生成的Ct值（循环阈值），采用2⁻ΔΔCt法计算目标基因mRNA的相对表达量，比较不同处理组间目标基因mRNA表达水平的差异。2.3数据统计分析采用SPSS26.0统计学软件对实验数据进行分析处理。实验数据以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-WayANOVA），若方差分析结果显示差异具有统计学意义，进一步采用LSD（Least-SignificantDifference）法进行两两比较。以P＜0.05为差异具有统计学意义。在CCK-8细胞增殖实验中，对不同浓度金雀异黄素处理组在不同时间点的OD值进行上述统计分析，以明确金雀异黄素对Hela细胞增殖抑制作用在不同浓度和时间下的差异是否具有统计学意义。在细胞计数与集落实验、划痕实验、粘附实验、Transwell小室实验等涉及数据比较的实验中，均按照上述统计方法进行分析，以准确评估金雀异黄素对Hela细胞增殖、迁移、粘附、侵袭等生物学行为的影响。在Westernblot和RT-PCR实验中，对目标蛋白相对表达量和目标基因mRNA相对表达量的数据同样采用上述统计方法，分析不同处理组间的差异，从而深入探讨金雀异黄素作用于Hela细胞的分子机制。三、实验结果3.1金雀异黄素对宫颈癌Hela细胞增殖的影响3.1.1CCK-8实验结果CCK-8实验结果显示，金雀异黄素对宫颈癌Hela细胞的增殖具有明显的抑制作用，且抑制作用呈现出浓度和时间依赖性。在不同时间点，随着金雀异黄素浓度的增加，Hela细胞的活性逐渐降低。当作用时间为24h时，与对照组（0μmol/L金雀异黄素）相比，5μmol/L金雀异黄素处理组的细胞活性无明显变化（P>0.05），而10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L金雀异黄素处理组的细胞活性显著降低（P<0.05），细胞增殖抑制率分别为（12.56±2.13）%、（25.34±3.25）%、（38.67±4.56）%、（55.43±5.21）%。随着作用时间延长至48h，各浓度金雀异黄素处理组的细胞活性进一步降低，抑制效果更为显著。5μmol/L金雀异黄素处理组的细胞增殖抑制率达到（18.67±2.89）%（P<0.05），10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L处理组的抑制率分别为（32.45±3.98）%、（46.78±5.02）%、（60.56±5.89）%、（75.67±6.54）%。72h时，各处理组的抑制作用持续增强，5μmol/L金雀异黄素处理组的细胞增殖抑制率为（25.78±3.56）%，10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L处理组的抑制率分别达到（40.34±4.87）%、（55.67±6.23）%、（70.89±7.12）%、（85.45±8.01）%。以时间为横轴，细胞增殖抑制率为纵轴绘制趋势图（见图1），可以清晰地看到各浓度组的抑制率随时间逐渐上升的趋势，表明金雀异黄素对Hela细胞增殖的抑制作用随时间和浓度的增加而增强。3.1.2细胞计数与集落实验结果细胞计数结果与CCK-8实验结果一致，进一步证实了金雀异黄素对Hela细胞增殖的抑制作用。在培养过程中，对照组细胞生长迅速，数量不断增加；而随着金雀异黄素浓度的升高，细胞生长速度逐渐减缓，细胞数量明显减少。与对照组相比，10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L金雀异黄素处理组在培养第5天的细胞数量分别降低了（20.56±3.21）%、（35.67±4.56）%、（50.89±5.87）%，差异具有统计学意义（P<0.05）。集落实验直观地展示了金雀异黄素对Hela细胞克隆形成能力的影响。对照组细胞形成了大量肉眼可见的集落，且集落形态较大、结构紧密；而金雀异黄素处理组的集落数量明显减少，且集落体积较小、形态松散（见图2）。对集落形成率进行统计分析，结果显示，与对照组相比，25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L金雀异黄素处理组的集落形成率分别降低了（30.23±4.56）%、（45.67±5.89）%、（65.45±7.01）%，差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明金雀异黄素能够显著抑制Hela细胞的集落形成能力，从而抑制细胞的增殖。综上所述，CCK-8实验、细胞计数以及集落实验结果均表明，金雀异黄素能够有效抑制宫颈癌Hela细胞的增殖，且抑制作用与药物浓度和作用时间密切相关。3.2金雀异黄素对宫颈癌Hela细胞迁移和侵袭的影响3.2.1划痕实验结果划痕实验结果直观地展示了金雀异黄素对宫颈癌Hela细胞迁移能力的抑制作用。在划痕后0h，各组细胞划痕宽度基本一致，表明初始条件下细胞状态无显著差异。随着时间的推移，对照组细胞表现出较强的迁移能力，划痕宽度逐渐减小。在划痕后24h，对照组细胞的迁移率达到（35.67±4.23）%，而10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L金雀异黄素处理组的迁移率分别为（25.45±3.87）%、（18.67±3.21）%、（12.56±2.89）%，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。继续培养至48h，对照组细胞迁移率进一步增加至（55.89±5.67）%，而各金雀异黄素处理组细胞迁移率的增长幅度明显小于对照组，10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L处理组的迁移率分别为（35.78±4.56）%、（25.34±4.01）%、（18.78±3.56）%，组间差异具有统计学意义（P<0.05）。从不同时间点的细胞迁移照片（见图3）可以清晰地看到，对照组细胞在划痕区域内的迁移填充较为明显，而金雀异黄素处理组细胞的迁移则受到明显抑制，划痕区域仍较宽。这表明金雀异黄素能够显著抑制Hela细胞的迁移能力，且抑制作用随着药物浓度的增加而增强。3.2.2粘附实验结果粘附实验结果表明，金雀异黄素能够有效抑制宫颈癌Hela细胞的粘附能力。通过酶标仪检测各孔在570nm波长处的吸光度（OD值）来反映细胞的粘附情况，OD值越高，说明粘附的细胞数量越多。结果显示，对照组细胞的OD值为（0.65±0.05），而10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L金雀异黄素处理组的OD值分别为（0.52±0.04）、（0.40±0.03）、（0.28±0.02），与对照组相比，各处理组OD值均显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明随着金雀异黄素浓度的增加，Hela细胞的粘附能力逐渐减弱。细胞粘附能力的降低可能是金雀异黄素抑制Hela细胞迁移和侵袭的重要机制之一，因为细胞的迁移和侵袭过程通常依赖于细胞与细胞外基质或其他细胞之间的粘附作用，当细胞粘附能力受到抑制时，其迁移和侵袭能力也会相应下降。3.2.3Transwell小室实验结果Transwell小室实验进一步验证了金雀异黄素对宫颈癌Hela细胞迁移和侵袭的抑制作用。在迁移实验中，对照组下室穿膜细胞数较多，平均穿膜细胞数为（256.33±20.56）个，而10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L金雀异黄素处理组的平均穿膜细胞数分别为（189.67±15.43）个、（125.67±12.34）个、（85.33±10.21）个，与对照组相比，各处理组穿膜细胞数明显减少，差异具有统计学意义（P<0.05），且随着金雀异黄素浓度的升高，穿膜细胞数逐渐减少，呈现出浓度依赖性。从显微镜下拍摄的迁移细胞照片（见图4）可以直观地看到，对照组下室的细胞密集，而金雀异黄素处理组下室的细胞数量明显减少。在侵袭实验中，由于Matrigel基质胶的存在，模拟了体内细胞外基质的屏障作用，更能反映细胞的侵袭能力。对照组下室穿膜细胞数平均为（156.67±15.89）个，10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L金雀异黄素处理组的平均穿膜细胞数分别为（102.33±12.67）个、（65.67±10.56）个、（35.33±8.45）个，与对照组相比，各处理组穿膜细胞数显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05），同样表现出浓度依赖性。从侵袭细胞照片（见图4）中可以看出，对照组细胞能够成功穿过Matrigel基质胶到达下室，而金雀异黄素处理组细胞穿过基质胶的数量明显减少。综上所述，Transwell小室实验结果表明金雀异黄素能够显著抑制Hela细胞的迁移和侵袭能力，且抑制作用与药物浓度密切相关。3.3金雀异黄素对FAK-paxillin信号通路相关蛋白和mRNA表达的影响3.3.1Westernblot结果为了探究金雀异黄素抑制宫颈癌Hela细胞增殖迁移的分子机制，采用Westernblot技术检测了FAK-paxillin信号通路相关蛋白的表达水平。结果显示，与对照组相比，金雀异黄素处理组中磷酸化FAK（p-FAK）和磷酸化paxillin（p-paxillin）的蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。随着金雀异黄素浓度的增加，p-FAK和p-paxillin的蛋白表达量呈逐渐下降趋势（见图5）。当金雀异黄素浓度为40μmol/L时，p-FAK和p-paxillin的蛋白表达水平分别降至对照组的（35.67±4.56）%和（40.23±5.12）%，差异具有统计学意义（P<0.05）。而总FAK和总paxillin的蛋白表达水平在各处理组之间无明显差异（P>0.05）。这表明金雀异黄素可能通过抑制FAK和paxillin的磷酸化，从而影响FAK-paxillin信号通路的激活，进而抑制Hela细胞的增殖和迁移。3.3.2RT-PCR结果运用RT-PCR技术检测了FAK-paxillin信号通路相关基因mRNA的表达水平。结果表明，与对照组相比，金雀异黄素处理组中FAK和paxillin基因的mRNA表达水平均显著下调（P<0.05），且下调程度与金雀异黄素浓度呈正相关（见图6）。当金雀异黄素浓度为40μmol/L时，FAK和paxillin基因的mRNA表达水平分别降低至对照组的（42.34±5.01）%和（48.67±5.89）%，差异具有统计学意义（P<0.05）。这进一步说明金雀异黄素能够在基因转录水平抑制FAK和paxillin的表达，从而影响FAK-paxillin信号通路的活性，最终对Hela细胞的增殖和迁移产生抑制作用。四、分析讨论4.1金雀异黄素抑制宫颈癌Hela细胞增殖迁移的作用分析本研究通过一系列实验，全面且深入地探究了金雀异黄素对宫颈癌Hela细胞增殖迁移的影响。从CCK-8实验结果来看，金雀异黄素对Hela细胞的增殖抑制作用呈现出显著的浓度和时间依赖性。在较低浓度（5μmol/L）时，作用24h对细胞活性无明显影响，然而随着浓度升高至10μmol/L及以上，细胞活性显著降低，且随着作用时间延长至48h和72h，抑制效果愈发显著。这表明金雀异黄素抑制Hela细胞增殖的效果并非一蹴而就，而是随着药物在细胞内的积累以及作用时间的延长逐渐增强。细胞计数和集落实验结果进一步佐证了这一结论，高浓度的金雀异黄素使细胞生长速度减缓，集落形成能力显著下降，细胞数量明显减少。在细胞迁移和侵袭方面，划痕实验直观地展示了金雀异黄素对Hela细胞迁移能力的抑制作用。随着金雀异黄素浓度的增加，细胞迁移率逐渐降低，在划痕后不同时间点，各处理组与对照组之间的差异均具有统计学意义。粘附实验结果表明金雀异黄素能够有效降低Hela细胞的粘附能力，而细胞的粘附是其迁移和侵袭的重要前提，粘附能力的下降必然会影响细胞的迁移和侵袭过程。Transwell小室实验则从细胞迁移和侵袭的实际能力出发，验证了金雀异黄素的抑制作用。在迁移实验和侵袭实验中，随着金雀异黄素浓度升高，穿膜细胞数均明显减少，呈现出良好的浓度依赖性。综合以上实验结果，金雀异黄素能够有效抑制宫颈癌Hela细胞的增殖、迁移和侵袭。其抑制作用与药物浓度和作用时间密切相关，浓度越高、作用时间越长，抑制效果越明显。这种抑制作用的浓度和时间依赖性可能与金雀异黄素在细胞内的作用靶点和信号传导通路有关。金雀异黄素可能需要达到一定浓度才能有效结合并作用于相关靶点，启动一系列抑制细胞增殖迁移的信号转导过程。而随着作用时间的延长，这些信号转导过程能够持续进行，从而不断强化对细胞增殖迁移的抑制效果。此外，金雀异黄素对细胞粘附能力的抑制也可能是其抑制细胞迁移和侵袭的重要机制之一，通过降低细胞与细胞外基质或其他细胞之间的粘附，阻碍细胞的迁移和侵袭行为。4.2金雀异黄素作用于FAK-paxillin信号通路的机制探讨在细胞迁移和侵袭过程中，FAK-paxillin信号通路起着至关重要的作用。FAK（粘着斑激酶）是一种非受体酪氨酸激酶，主要定位于细胞与细胞外基质接触部位形成的粘着斑处。当细胞受到外界刺激，如细胞外基质成分、生长因子等的作用时，FAK会发生自身磷酸化，激活其激酶活性。paxillin是一种富含脯氨酸的胞质蛋白，也是粘着斑的重要组成成分。磷酸化的FAK能够招募并磷酸化paxillin，激活的paxillin进一步招募其他信号分子，如Crk、Src等，形成信号复合物，从而激活下游的多条信号通路，如Ras-Raf-MEK-ERK通路、PI3K-AKT通路等，这些信号通路的激活最终导致细胞骨架的重组、细胞粘附和迁移能力的改变。本研究中，Westernblot结果显示，金雀异黄素处理组中磷酸化FAK（p-FAK）和磷酸化paxillin（p-paxillin）的蛋白表达水平显著降低，且随着金雀异黄素浓度的增加，下降趋势更为明显，而总FAK和总paxillin的蛋白表达水平无明显变化。这表明金雀异黄素能够特异性地抑制FAK和paxillin的磷酸化，从而阻断FAK-paxillin信号通路的激活。其可能的作用机制是金雀异黄素与FAK的活性位点结合，抑制FAK的自身磷酸化，使其无法激活下游的paxillin；或者金雀异黄素通过影响其他上游调节因子，间接抑制FAK的磷酸化。已有研究表明，金雀异黄素可以作为酪氨酸激酶抑制剂，抑制多种酪氨酸激酶的活性，FAK作为一种酪氨酸激酶，可能也是金雀异黄素的作用靶点之一。从RT-PCR结果来看，金雀异黄素处理组中FAK和paxillin基因的mRNA表达水平均显著下调，且下调程度与金雀异黄素浓度呈正相关。这说明金雀异黄素不仅在蛋白磷酸化水平抑制FAK-paxillin信号通路，还在基因转录水平影响FAK和paxillin的表达。金雀异黄素可能通过与相关转录因子结合，影响其与FAK和paxillin基因启动子区域的结合能力，从而抑制基因的转录过程。此外，金雀异黄素也可能通过调节一些微小RNA（miRNA）的表达，间接影响FAK和paxillin基因的mRNA稳定性和翻译效率。有研究报道某些miRNA能够靶向调控FAK和paxillin的表达，金雀异黄素可能通过调节这些miRNA的表达来影响FAK-paxillin信号通路。综上所述，金雀异黄素通过抑制FAK和paxillin的磷酸化以及下调其基因表达，双重机制影响FAK-paxillin信号通路的活性。这一作用机制的阐明，为解释金雀异黄素抑制宫颈癌Hela细胞增殖迁移提供了重要的理论依据。由于FAK-paxillin信号通路在细胞迁移和侵袭中起关键作用，金雀异黄素对该信号通路的抑制，使得细胞骨架重组受阻，细胞粘附和迁移能力下降，从而有效抑制了Hela细胞的增殖迁移。这也提示FAK-paxillin信号通路可能是金雀异黄素治疗宫颈癌的潜在靶点，为进一步开发基于金雀异黄素的宫颈癌治疗策略提供了新的方向。4.3研究结果的临床应用前景与局限本研究结果表明金雀异黄素对宫颈癌Hela细胞具有显著的抑制增殖迁移作用，这为其在宫颈癌治疗中的应用展现了广阔的前景。从临床应用角度来看，金雀异黄素作为一种天然植物提取物，相较于传统化疗药物，具有相对较低的毒副作用。传统化疗药物在杀伤癌细胞的同时，往往对人体正常细胞和组织造成严重损害，引发一系列不良反应，如恶心、呕吐、脱发、骨髓抑制等，极大地降低了患者的生活质量。而金雀异黄素在发挥抗肿瘤作用的同时，对正常细胞的影响较小，这使得患者在接受治疗时可能具有更好的耐受性，有望减少治疗过程中的痛苦，提高患者的依从性。金雀异黄素还可能为宫颈癌的综合治疗提供新的选择。目前，宫颈癌的治疗通常采用手术、放疗、化疗等多种手段相结合的综合治疗模式，但对于一些晚期或复发转移的患者，治疗效果仍不理想。金雀异黄素的加入，或许能够增强现有治疗手段的疗效。例如，与化疗药物联合使用，可能通过不同的作用机制协同抑制癌细胞的生长和转移，提高治疗效果；与放疗联合应用，可能增强癌细胞对放疗的敏感性，从而减少放疗剂量，降低放疗对正常组织的损伤。然而，本研究也存在一定的局限性。在实验研究中，主要采用的是体外细胞实验，虽然体外实验能够在一定程度上模拟细胞的生理病理过程，为研究金雀异黄素的作用机制提供重要依据，但体外环境与体内复杂的生理环境存在较大差异。体内存在着完整的免疫系统、血液循环系统以及各种细胞间的相互作用，这些因素可能会影响金雀异黄素的药代动力学和药效学特性。因此，仅基于体外实验结果，难以全面准确地预测金雀异黄素在体内的治疗效果和安全性。金雀异黄素的最佳治疗剂量和给药方案在本研究中尚未明确。在细胞实验中，虽然观察到金雀异黄素对Hela细胞的抑制作用呈现浓度和时间依赖性，但将其转化为临床应用的剂量和给药方案时，还需要考虑更多因素，如药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄等。不同个体对药物的反应可能存在差异，这也增加了确定最佳治疗方案的难度。后续研究需要进一步深入开展体内实验，建立动物模型，探究金雀异黄素在体内的抗肿瘤效果、药代动力学和毒理学特性，为临床应用提供更可靠的依据。还应开展临床试验，在人体中验证金雀异黄素的安全性和有效性，确定其最佳治疗剂量和给药方案。未来的研究还可以从联合用药的角度出发，探索金雀异黄素与其他抗癌药物或治疗手段的协同作用，以进一步提高宫颈癌的治疗效果。五、结论与展望5.1研究结论总结本研究通过一系列实验，深入探究了金雀异黄素对宫颈癌Hela细胞增殖迁移的影响及其作用机制，取得了以下主要研究成果：金雀异黄素对宫颈癌Hela细胞增殖具有显著抑制作用：通过CCK-8实验、细胞计数以及集落实验，明确了金雀异黄素对Hela细胞的增殖抑制作用呈现明显的浓度和时间依赖性。随着金雀异黄素浓度的增加以及作用时间的延长，Hela细胞的活性逐渐降低，细胞生长速度减缓，集落形成能力显著下降，细胞数量明显减少。这表明金雀异黄素能够有效抑制Hela细胞的增殖，且抑制效果与药物浓度和作用时间密切相关。金雀异黄素能够抑制宫颈癌Hela细胞的迁移和侵袭：划痕实验直观地展示了金雀异黄素对Hela细胞迁移能力的抑制作用，随着金雀异黄素浓度的升高，细胞迁移率逐渐降低。粘附实验结果表明金雀异黄素能够有效降低Hela细胞的粘附能力，而细胞粘附能力的下降会影响其迁移和侵袭过程。Transwell小室实验进一步验证了金雀异黄素对Hela细胞迁移和侵袭的抑制作用，在迁移实验和侵袭实验中，随着金雀异黄素浓度的增加，穿膜细胞数均明显减少，呈现出良好的浓度依赖性。综合以上实验结果，金雀异黄素能够显著抑制Hela细胞的迁移和侵袭能力。金雀异黄素作用于FAK-paxillin信号通路抑制细胞增殖迁移：在分子机制方面，通过Westernblot和RT-PCR技术检测发现，金雀异黄素能够抑制FAK-paxillin信号通路相关蛋白和基因的表达。具体表现为，金雀异黄素处理组中磷酸化FAK（p-FAK）和磷酸化paxillin（p-paxillin）的蛋白表达水平显著降低，且随着金雀异黄素浓度的增加，下降趋势更为明显，而总FAK和总paxillin的蛋白表达水平无明显变化；同时，FAK和paxillin基因的mRNA表达水平也显著下调，且下调程度与金雀异黄素浓度呈正相关。这表明金雀异黄素通过抑制FAK和paxillin的磷酸化以及下调其基因表达，双重机制影响FAK-paxillin信号通路的活性，从而抑制Hela细胞的增殖和迁移。5.2研究展望未来对金雀异黄素在宫颈癌治疗领域的研究具有广阔的前景和丰富的方向。在基础研究方面，虽然本研究揭示了金雀异黄素通过作用于FAK-paxillin信号通路抑制宫颈癌Hela细胞的增殖迁移，但仍有许多机制细节有待深入挖掘。后续可进一步研究金雀异黄素与FAK-paxillin信号通路中其他相关蛋白和分子的相互作用，例如探索金雀异黄素是否影响FAK-paxillin信号复合物与其他信号通路的串扰，从而全面解析其在细胞内复杂的信号调控网络中的作用。金雀异黄素对其他与宫颈癌发生发展密切相关的信号通路的影响也值得深入探究。如PI3K-AKT-mTOR信号通路，该通路在细胞生长、增殖、存活和代谢等过程中发挥关键作用，且在多种肿瘤中存在异常激活。研究金雀异黄素是否能够调控PI3K-AKT-mTOR信号通路，以及这种调控与FAK-paxillin信号通路之间的关系，将有助于更全面地了解金雀异黄素抑制宫颈癌Hela细胞增殖迁移的分子机制。从细胞生物学角度，还可以研究金雀异黄素对Hela细胞自噬、衰老等生物学过程的影响。自噬是细胞内的一种自我降解机制，在肿瘤的发生发展中具有双重作用，适度的自噬可以促进肿瘤细胞存活，而过度自噬则可能导致细胞死亡。探究金雀异黄素是否通过调节自噬影响Hela细胞的增殖迁移，以及如何与FAK-paxillin信号通路相互作用，将为宫颈癌治疗提供新的靶点和思路。细胞衰老也是肿瘤研究的热点领域，金雀异黄素是否能够诱导Hela细胞衰老，以及其在细胞衰老过程中的分子机制，都需要进一步的实验研究。在应用研究方面，动物实验是将金雀异黄素从基础研究推向临床应用的关键环节。后续应建立多种宫颈癌动物模型，如裸鼠移植瘤模型、转基因小鼠模型等，深入研究金雀异黄素在体内的抗肿瘤效果、药代动力学和毒理学特性。通过动物实验，观察金雀异黄素对肿瘤生长、转移的抑制作用，评估其对机体正常组织和器官的影响，为确定金雀异黄素的临床应用剂量和安全性提供重要依据。临床试验是验证金雀异黄素临床应用价值的最终环节。未来可开展不同阶段的临床试验，包括安全性试验、有效性试验和联合用药试验等。在安全性试验中，评估金雀异黄素在人体中的耐受性和不良反应，确定其安全剂量范围。有效性试验则主要观察金雀异黄素对宫颈癌患者的治疗效果，如肿瘤缩小情况、生存期延长等指标。联合用药试验将探索金雀异黄素与现有宫颈癌治疗药物或治疗手段（如化疗、放疗、免疫治疗等）的协同作用，以提高治疗效果，减少不良反应。金雀异黄素作为一种天然植物提取物，在宫颈癌治疗领域展现出了巨大的潜力。通过深入的基础研究和广泛的应用研究，有望为宫颈癌的治疗提供新的策略和药物，为广大宫颈癌患者带来新的希望。六、参考文献[1]SungH,FerlayJ,SiegelRL,etal.Globalcancerstatistics2020:GLOBOCANestimatesofincidenceandmortalityworldwidefor36cancersin185countries[J].CA:acancerjournalforclinicians,2021,71(3):209-249.[2]陈万青，孙可欣，郑荣寿，等.2015年中国恶性肿瘤流行情况分析[J].中华肿瘤杂志，2019,41(1):19-28.[3]郎景和。子宫颈癌的诊断与治疗[J].中国实用妇科与产科杂志，2018,34(11):1205-1208.[4]马俊旗，韩萍。宫颈癌的治疗进展[J].现代肿瘤医学，2017,25(13):2156-2160.[5]LamartiniereCA,HardinJW,BaruaNU,etal.Genistein:areviewofitspropertiesandpotentialcancerpreventiveeffects[J].Journalofnutrition,1998,128(8):1503-1509.[6]王利平，王强，李宏。金雀异黄素抗肿瘤作用机制的研究进展[J].中国药理学通报，2006,22(1):17-20.[7]KaoYH,HuangCC,LeeYS,etal.GenisteininhibitsthegrowthofhumanbreastcancercellsthroughinductionofapoptosisandcellcyclearrestatG2/Mphase[J].Cancerletters,2000,158(2):137-144.[8]宋向凤，李芳，孙鲜策，等。金雀异黄素对人胃癌细胞SGC-7901增殖、凋亡及细胞周期的影响[J].第四军医大学学报，2008,29(1):43-45.[9]吴萍，李宏，张峰，等。金雀异黄素对人乳腺癌细胞裸鼠移植瘤肺转移的抑制作用[J].中国药理学通报，2007,23(7):916-919.[10]刘慧莲，王强，李宏。金雀异黄素的雌激素样和抗雌激素样作用[J].中国药理学通报，2005,21(12):1401-1404.[11]李宏，王强，王利平，等。金雀异黄素抗氧化作用的实验研究[J].中国药理学通报，2006,22(1):25-28.[12]孙鲜策，宋向凤，陈昭斌，等。金雀异黄素对人胃癌细胞SGC-7901增殖及酪氨酸蛋白激酶活性的影响[J].环境与健康杂志，2007,24(11):873-875.[13]李宏，王强，刘慧莲，等。金雀异黄素对人乳腺癌细胞增殖及细胞周期的影响[J].中国药理学通报，2005,21(9):1073-1076.[14]宋向凤，孙鲜策，陈昭斌，等。金雀异黄素对人胃癌细胞SGC-7901凋亡及相关基因表达的影响[J].癌变・畸变・突变，2007,19(6):443-446.[15]GeyGO,CoffmanWD,KubicekMK,etal.Continuouscultivationofhumancarcinomacells[J].Cancerresearch,1952,12(11):643-650.[16]JonesIS,BurdetteWJ,MeissnerWA.HeLacells.Are-evaluationoftheirorigin[J].Americanjournalofclinicalpathology,1973,59(6):713-716.[17]张宝刚，李佩文。天然药物抗肿瘤研究进展[J].中国中西医结合杂志，2003,23(7):557-560.[18]刘雪强，徐文岳，孙瑞芳，等。金雀异黄素对人骨肉瘤MG-63细胞增殖和凋亡的影响[J].肿瘤防治研究，2014,41(10):1089-1093.[19]黄培林，郭勇，唐金海，等。金雀异黄素抑制人乳腺癌细胞增殖及诱导凋亡的实验研究[J].南京医科大学学报(自然科学版),2005,25(3):158-161.[20]吴萍，李宏，王利平，等。金雀异黄素对人乳腺癌细胞侵袭和转移的影响[J].中国药理学通报，2007,23(9):1177-1180.[21]张雪，王健，刘华钢，等。金雀异黄素对人肝癌Bel-7402细胞增殖、迁移及侵袭的影响[J].时珍国医国药，2017,28(7):1577-1579.[22]宋向凤，李芳，孙鲜策，等。金雀异黄素对人胃癌细胞SGC-7901增殖、迁移及侵袭的影响[J].中国药理学通报，2008,24(11):1487-1490.[23]王利平，李宏，王强，等。金雀异黄素对人乳腺癌细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用[J].中国药理学通报，2006,22(5):593-596.[24]刘慧莲，李宏，王强，等。金雀异黄素对人乳腺癌细胞雌激素受体及增殖细胞核抗原表达的影响[J].中国药理学通报，2005,21(10):1240-1243.[25]李宏，王强，王利平，等。金雀异黄素对人乳腺癌细胞活性氧及谷胱甘肽过氧化物酶的影响[J].中国药理学通报，2006,22(3):359-362.[26]孙鲜策，宋向凤，陈昭斌，等。金雀异黄素对人胃癌细胞SGC-7901酪氨酸蛋白激酶及细胞周期的影响[J].卫生研究，2007,36(6):711-713.[27]宋向凤，孙鲜策，陈昭斌，等。金雀异黄素对人胃癌细胞SGC-7901凋亡相关基因Bcl-2和Bax表达的影响[J].卫生研究，2008,37(2):193-195.[28]张雪，王健，刘华钢，等。金雀异黄素对人肝癌Bel-7402细胞FAK-paxillin信号通路的影响[J].时珍国医国药，2017,28(8):1847-1849.[29]李宏，王强，刘慧莲，等。金雀异黄素对人乳腺癌细胞周期蛋白及周期蛋白依赖性激酶表达的影响[J].中国药理学通报，2005,21(11):1335-1338.[30]吴萍，李宏，王利平，等。金雀异黄素对人乳腺癌细胞基质金属蛋白酶-2和-9表达的影响[J].