高麦黄酮小麦籽粒中麦黄酮含量指标和测定方法-编制说明

团体标准《二〇二一年十月二十三日《高麦黄酮小麦籽粒中麦黄酮含量指标和测定方法》一、标准制定的必要性小麦在世界各地被广泛种植，其富含淀粉、蛋白质、脂肪、氨基酸以及多种微量元素，是人类和动物最主要的营养来源之一，小麦产业发展直接关系到世界粮食安全和社会稳定。小麦不仅仅为人类、动物活动提供能量来源，而且特殊用途类型的小麦具有一定的药用价值。特殊用途品种除了黑色小麦和糯小麦外，也包括高麦黄酮和富硒、富锌等特殊营养物质的品种。相关研究表明，含有较高麦黄酮小麦具有干扰体外培养乳腺癌和结肠癌细胞生长的功能，其抗氧化能力能够降低心血管疾病发生的概率，因此，麦黄酮含量较高的小麦是重要的功能性品种。近年来，国内外多个研究团队开展了高麦黄酮小麦的育种、鉴定技术研究。山东农业大学田纪春教授课题组早在20年前就开始了小麦黄酮方面的研究，并于2020年育出了我国第一个审定的高麦黄酮小麦新品种山农101（鲁审麦20206035），黄酮含量1.013mg/kg，是普通小麦平均含量的3.5-5倍。但通过广泛调研发现，国内外至今仍没有关于高麦黄酮小麦品种的麦黄酮含量指标定义和规范，其检测方法也无统一标准。因此，本标准的制定，将首次提出高麦黄酮含量指标，制定高效、准确且统一的测定标准，对指导育种家培育更好的高麦黄酮小麦新品种，满足人民群众对生活质量和健康水平的新需求，确保我国营养导向型农业的健康发展来说重大意义。综上所述，对麦黄酮及高麦黄酮小麦的术语、定义、范围和小麦籽粒中麦黄酮含量指标进行科学确定，对小麦籽粒及制品中麦黄酮的测定方法进行统一规范，服务于小麦品种开发和农业生产是十分有必要的。二、标准编制原则及依据1.按照GB/T1.1－2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》要求进行编写。2.参照相关法律、法规和规定，在编制过程中着重考虑了科学性、适用性和可操作性。三、项目背景及工作情况（一）任务来源近年来，膳食不良成为我国导致死亡的第一大因素，因此全球农业发展研究的热点聚焦于探寻农业、营养、健康的关系。随着《主要农作物品种审定标准》（国品审【2017】1号）的发布，我国的农作物育种导向也发生了重大变化，营养导向型农业和功能作物品种迎来了前所未有的发展机遇。根据《中国国际科技促进会标准化工作委员会团体标准管理办法》的有关规定，经中国国际科技促进会标准化工作委员会及相关专家技术审核，批准《高麦黄酮小麦籽粒中麦黄酮含量指标和测定方法》团体标准制定计划，计划编号为：CI2021079。本标准由山东国仓健生物科技有限公司提出，中国国际科技促进会归口。根据计划要求，本标准完成时限为5个月。（二）标准起草单位本标准的编制工作由山东国仓健生物科技有限公司牵头，负责标准文档起草及相关文件的编制等工作。山东华田农业科技有限公司，山东天泽泰田种业科技有限公司，山东农业大学，莱州宏源面粉有限公司，泰安市谷香园食品有限公司共5家单位作为参与单位共同完成，负责标准中重要技术点的研究和建议，并参与标准内容的讨论。牵头单位与参与单位为此专门成立《高麦黄酮小麦籽粒中麦黄酮含量指标和麦黄酮测定方法》团体标准起草小组，负责本标准的各项工作。（三）编写人员与分工编写人员：胥倩、田纪春、刘振、王群青、王西振、邓志英、于海霞、彭莉、由佳辉、杨明、王延训、赵善仓、吕民全、谢秀伦。姓名工作单位职称/职务承担任务胥倩山东农业大学教授主持人，负责项目整体规划设计、标准起草田纪春山东农业大学教授副主持人，协助项目整体规划设计、确定标准内容刘振山东国仓健生物科技有限公司技术总监负责标准起草、麦黄酮检测方法优化王群青山东农业大学教授分析我国居民麦黄酮摄入水平王西振山东国仓健生物科技有限公司总经理负责标准规范性审核上报邓志英山东农业大学教授确定标准内容和检测方法，起草标准于海霞山东农业大学高级实验师负责抗性淀粉含量检测方法优化彭莉山东天泽泰田种业科技有限公司负责抗性淀粉含量检测由佳辉山东国仓健生物科技有限公司工程师小麦及面粉中麦黄酮含量检测验证杨明山东华田农业科技有限公司工程师小麦及面粉中麦黄酮含量检测验证王延训山东华田农业科技有限公司农艺师小麦麦黄酮品种种植赵善仓山东省农业科学院研究员负责抗性淀粉含量检测吕民全山东莱州宏源面粉有限公司高级制粉师高麦黄酮品种制粉技术和面粉产品研发谢秀伦泰安市谷香园食品有限公司总工程师高麦黄酮品种食品技术研制和产品研发（四）标准研制过程及相关工作计划1.标准起草组成立2021年8月，标准起草牵头单位山东国仓健生物科技有限公司与山东华田农业科技有限公司，山东天泽泰田种业科技有限公司,山东农业大学,莱州宏源面粉有限公司，泰安市谷香园食品有限公司经讨论研究，建议编制小麦籽粒中麦黄酮含量指标和麦黄酮测定方法团体标准。2021年9月1日在山东泰安召开第一次标准工作会议，标准起草小组正式成立。在本次会议上，部分标准起草人对国内外小麦籽粒中麦黄酮含量指标研究现状、检测方法和规范，高麦黄酮小麦种植、加工及消费情况进行了深入、全面分析，并对拟制定标准内容进行探讨，确定了编制原则，明确了各单位任务分工及标准制修订项目实施计划。2.收集查阅相关资料、实地调研标准编制人员按既定分工从不同方面收集数据和查阅相关文献、书籍等资料，主要包括国内外麦黄酮及高麦黄酮小麦的术语、定义、范围，麦黄酮及高麦黄酮小麦的研究现状、麦黄酮小麦籽粒中麦黄酮含量指标，以及小麦籽粒及制品中麦黄酮测定方法等。标准起草小组还先后对山东华田农业科技有限公司（种植公司），山东天泽泰田种业科技有限公司（研发育种公司），山东国仓健生物科技有限公司（检测公司），山东农业大学（研发育种科研单位），莱州宏源面粉有限公司（收购、加工公司），泰安市谷香园食品有限公司（食品加工利用公司）等单位进行实地调研，考察高麦黄酮小麦种植及加工情况，并详细地了解小麦籽粒中麦黄酮含量测定的样品制备工艺、测试工艺、检测方法和加工领域需求。3.编制标准讨论稿根据前期资料收集、整理和实地调研情况，按照本标准制定的编制原则，参照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的要求，2021年9月下旬完成标准讨论稿的编制。4.召开第二次标准工作会议2021年10月11日在山东泰安召开第二次标准工作会议。本次会议对意见稿中，从不同角度讨论麦黄酮及高麦黄酮小麦专业术语规范、麦黄酮含量下限的确定和探讨小麦籽粒和制品中麦黄酮含量检测方法、判定规则等相关问题。会后根据讨论结果，修改标准稿件，并撰写标准编制说明。5.召开第三次标准工作会议2021年11月28日在山东泰安召开第三系标准工作会议。本次会议对标准文本和编制说明进行最后确定讨论。会后根据讨论结果，修改稿件及编制说明，形成公开征求意见稿。6.公开征求意见2021年11月30日，标准起草组将《高抗性淀粉小麦籽粒中抗性淀粉含量指标和测定方法》“公开征求意见稿”以电子邮件的方式分别发送给***大学、***大学、***大学、***研究所、***检测中心等单位同行业专家；同时由中国国际科技促进会审查后提交全国标准信息平台公示；为减少疫情期间不必要的人员聚集，专家组采用线上交流，通讯评议的方式提出修改意见及建议，计划2021年12月底召开专家评审会。四、标准编制原则和确定标准主要内容（一）编制原则本标准严格按照GB/T1.1-2020的要求和规定编写编制。协调性原则。本标准旨在规范麦黄酮及高麦黄酮小麦的术语、定义、范围，麦黄酮小麦籽粒中麦黄酮含量指标的科学确定，小麦籽粒及制品中麦黄酮的测定方法等各方面指标。在内容上力求与相关现行标准相协调，充分参考GB1351-2008、GB/Z35959-2018等标准相关内容，科学制定高麦黄酮小麦麦黄酮含量及检测方法的各项指标。必要性原则。标准编写过程中坚持必要性原则，仅对高麦黄酮小麦进行了术语规范和定义。适用性原则。标准编写过程中坚持适用性原则，从服务育种、种植和加工应用利益出发，充分考虑行业发展需求，保证标准内容方便被其他标准或文件引用且可操作性强。科学性原则。在标准制定过程中充分调研与高麦黄酮小麦相关的研究、检测和生产企业，归纳总结共性指标和因素，综合全面考虑，并广泛吸收专家意见，逐一对标准各部分内容进行科学规范。（二）主要内容本标准主要内容如下：1.范围本标准规定了高麦黄酮小麦的术语定义和感官、质量、麦黄酮含量、安全等技术要求，以及检验方法、检验规则。本标准适用于在生产、储运、加工、检测、认证、销售过程中对高麦黄酮小麦进行判定、评价。2.规范性引用文件本标准引用文件均为国家标准，共计8项，其中有2项强制性标准、5项为推荐性国家标准、1项为指导性国家标准。GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T603-2002化学试剂_试验方法中所用制剂及制品的制备GB1351-2008小麦GB1355-1986小麦粉GB/T6041质谱分析方法通则GB/T16631-2008高效液相色谱法通则GB/Z35959-2018液相色谱-质谱联用分析方法通则3.术语和定义本标准对麦黄酮、高麦黄酮小麦进行定义。3.1麦黄酮，Tricin麦黄酮（Tricin），化学名称为5,7,4’-三羟基-3’,5’-二甲氧基黄酮，又称苜蓿素、小麦黄素。麦黄酮具有较强的抗氧化能力，能调节心血管功能，抑制癌细胞生长，延迟自发性乳腺肿瘤的发生。已报道的麦黄酮形式包括游离麦黄酮和麦黄酮衍生物，本实验测定的为游离麦黄酮。3.2高麦黄酮小麦，High-tricinwheat小麦生长发育过程自然产生和积累的麦黄酮含量大于0.5mg/kg（含）的小麦品种（不含黑、紫、蓝等彩色小麦）。4.检测方法4.1原理试样用80%乙醇溶液提取，经离心浓缩后复溶，用液相色谱串联质谱仪检测，外标法定量。4.2试剂和材料 除另有规定外，水为符合GB/T6682中规定的一级水。4.2.1试剂4.2.1.1乙醇（CH3CH2OH，64-17-5）：色谱纯。4.2.1.2甲醇（CH3OH，67-56-1）：色谱纯。4.2.1.3标准品（麦黄酮，Tricin，520-32-1）。4.2.2溶液配制4.2.2.180%乙醇溶液：取800mL乙醇，加入200mL水，摇匀备用。4.2.2.20.1%甲酸溶液：取1000mL水，加入1mL甲酸，摇匀备用。4.2.3标准溶液配制4.2.3.1标准储备溶液 分别称取5mg标准物质于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，标准溶液避光-40℃保存，保存期为一年。4.2.3.2材料微孔过滤膜（尼龙）：0.22μm。4.3仪器和设备4.3.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。4.3.22mL离心管4.3.3分析天平：感量0.1mg。4.3.4移液器：1mL。4.3.5震动球磨仪。4.3.6样品瓶：2mL，带聚四氟乙烯旋盖。4.3.7涡旋混合器。4.3.8氮气吹干仪。4.3.9高速离心机：13000r/min。4.3.10超声波清洗仪。4.4试样制备与保存 小麦种子使用震动球磨仪磨碎，密封并标明标记。将试样置于-80℃冰箱保存。4.5准备步骤 称取100mg试样（精确至0.01g）2mL离心管中，加入1mL80%乙醇水溶液，在涡旋混合器上涡旋2min，超声处理40min，置于旋转混匀仪上混匀8h，13000r/min离心5min，取全部上清液至另一干净离心管中，再加入1mL甲醇，超声40min，13000r/min离心5min，合并两次上清液，在氮气吹干仪上常温吹干，加入100μL甲醇复溶，0.22μm滤膜过滤后供液相色谱串联质谱仪检测。4.6分析4.6.1测定4.6.1.1液相色谱-串联质谱参考条件a)色谱柱：HypersilGoldC18,3.5μm,100mm×2.1mm（内径）或相当者；b)流动相及梯度洗脱条件见表1；表1流动相及梯度洗脱条件步骤总时间/min流速（μL/min）流动相A（0.1%甲酸水）/％流动相B（甲醇）/％10300901020.2300901036300109048300109058.130090106103009010c)柱温：35℃；d)进样量：5μL；e)电离源模式：电喷雾离子化；f)电离源极性：负离子模式；g)雾化气：氮气；h)离子喷雾电压：2500V；i)雾化气温度：317℃；j)离子传输管温度：333℃；k)监测离子对及碰撞气能量见表2表2监测离子对及碰撞气能量中文名称英文名称保留时间/min定量离子定性离子碰撞气能量/V麦黄酮Tricin5.67329.1/299329.1/299；329.1/314.125；194.6.1.2定性测定 在相同实验条件下进行样品测定时，如果检出的色谱峰的保留时间与标准样品相一致，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，而且所选择的离子丰度比与标准样品的离子丰度比相一致（相对丰度＞50%，允许±20%偏差；相对丰度＞20%至50%，允许±25%偏差；相对丰度＞10%至20%，允许±30%偏差；相对丰度≤10%，允许±50%偏差），则可判断样品中存在麦黄酮。4.6.1.3定量测定 本标准中液相色谱串联质谱采用外标-校准曲线法定量测定。为减少基质对定量测定的影响，定量用标准溶液应采用基质混合标准工作溶液绘制标准曲线。并且保证所测样品中农药及相关化学品的响应值均在仪器的线性范围内。麦黄酮标准品液质联用谱图见图1。图1麦黄酮液质联用谱图4.6.2平行试验按以上步骤对同一试样进行平行试验。4.6.3空白试验除不称取试样外，均按上述步骤进行。4.6.4结果计算和表述 液相色谱-串联质谱测定采用标准曲线法定量，标准曲线法定量结果按式（1）计算：Xi 式中： Xi——试样中被测组分含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； Ci——从标准曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； V——样品溶液定容体积，单位为毫升（mL）； m——样品溶液所代表试样的重量，单位为克（g）。4.7精密度4.7.1在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值与其算术平均值的比值（百分率），应符合表3的要求。表3实验室内重复性要求被测组分含量mg/kg精密度%≤0.00136＞0.001，≤0.0132＞0.01，≤0.122＞0.1，≤118＞1144.7.2在再现性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值与其算术平均值的比值（百分率），应符合表4的要求。表4实验室间再现性要求被测组分含量mg/kg精密度%0.00154＞0.001，≤0.0146＞0.01，≤0.134＞0.1，≤125＞1194.8定量限和回收率4.8.1定量限 本方法的定量限LOQ为4μg/g。4.8.2回收率 当添加水平为LOQ、4×LOQ时,添加回收率分别为84%和79%。主要试验（或验证）的分析、综合报告，技术经济论证，预期的经济效果（一）中国小麦麦黄酮含量情况分析关于小麦中麦黄酮含量的测定，仅2009年赵善仓等人采用超高效液相色谱串联质谱法测定了14个小麦品种（系）籽粒中麦黄酮含量，发现麦黄酮含量最高的品种为黑小麦76，达379μg/kg，最低的品种为VICTO，仅含有47.1μg/kg，且品种间麦黄酮含量存在极显著差异。本团队使用上述液相色谱-质谱联用方法对四十余种常见小麦品种的麦黄酮含量进行了精确定量检测，结果表明这些小麦籽粒中麦黄酮含量最低的品种仅为50.33μg/kg，最高的品种为577.48μg/kg，进一步确认了不同品种间麦黄酮含量的差异性。而本标准主要研究材料“山农101”（区试号：山农黄酮麦1号）于2020年通过山东省农作物品种审定委员会审定（鲁审麦20206035），是国内审定的第一个高黄酮小麦新品种。经山东省农科院农业质量标准与检测技术研究所以芦丁比色法测定，其黄酮含量1.013mg/kg，是普通小麦平均含量的3.5~5倍。参考文献：赵善仓,赵领军,谷小红,王宪泽,田纪春.超高效液相色谱串联质谱法测定小麦籽粒中麦黄酮[J].分析化学,2009,37(6):873-876.（二）麦黄酮测定方法麦黄酮是小麦籽粒中重要的抗氧化剂和生理活性物质，具有扩张血管、抗菌消炎、增强人体免疫力以及抑制癌细胞生长等多重功效。日常饮食中摄入的黄酮类化合物能够减少癌症和心脏病等疾病的发病率。关于麦黄酮含量的测定目前已有一些报道，如Estiarte、凌俊红、Tian以及赵善仓等人均采用高效液相色谱（HPLC）法分别测定了竹叶、大麦芽、小麦叶片和小麦籽粒中的麦黄酮含量。而国内关于麦黄酮的检测标准只有一个广西地方标准《DB45/T1177-2015山银花中苜蓿素的测定高效液相色谱法》，其中涉及的检测方法耗时较长（25分钟/样品），且单纯采用的是液相方法，难于应用于小麦籽粒复杂基质中微量麦黄酮的精确定性定量。国外方面，欧盟、英国和美国则没有查询到关于麦黄酮的任何检测标准。本标准主要涉及建立一种精确检测小麦籽粒中麦黄酮含量的液相色谱串联质谱检测方法。该标准基于2009年田纪春课题的方法进行改造，利用三重四极杆高效液相质谱法进行定量检测，并针对小麦籽粒进行了提取方法优化改造，大大简化检测步骤，提高了检测的灵敏度和准确性，单位样品检测耗时小于10分钟。目前，本单位已经使用标准品建立标准曲线，并已经进行了上百个实际样品的检测和定量分析，验证了方法的可行性和稳定性。参考文献：[2]EstiarteM.PenuelasJ.,KimballB.A.,etal.Free-airCO2enrichmentofwheat:leafflavonoidconcentrationthroughoutthegrowthcycle.Physiologiaplantarum,99,105(3):423-433.[3]凌俊红,王楠,任玉珍,王龙虎,王金辉,李铣.HPLC法测定大麦芽中麦黄酮[J].中草药,2005(11):1632-1634.[4]田向军,邱宗波,刘晓,岳明.增强UV-B辐射对小麦叶片黄酮类化合物日变化的影响[J].环境科学学报,2007(3):516-521.[5]赵善仓,赵领军,谷小红,王宪泽,田纪春.超高效液相色谱串联质谱法测定小麦籽粒中麦黄酮[J].分析化学,2009,37(6):873-876.（三）技术经济论证麦黄酮是小麦籽粒中重要的抗氧化剂和生理活性物质，可降低环加氧酶活性的，具有扩张血管、抗菌消炎、增强人体免疫力以及抑制癌细胞生长等多重功效日常饮食中摄入的黄酮类化合物能够减少癌症和心脏病等疾病的发病率。食用高麦黄酮小麦能够提高人们自身的免