银杏WRKY基因家族生物信息学分析及非生物胁迫响应机制探究

银杏WRKY基因家族生物信息学分析及非生物胁迫响应机制探究一、引言1.1研究背景在自然环境中，植物常常面临着诸如干旱、高温、低温、盐渍等非生物胁迫的挑战。这些胁迫严重影响植物的生长、发育、繁殖以及地理分布，是导致农作物减产和品质下降的重要因素。据统计，全球每年因非生物胁迫造成的农作物损失高达数千亿美元。因此，深入探究植物对非生物胁迫的响应机制，培育具有更强抗逆性的植物品种，对于保障农业生产的稳定和可持续发展至关重要。植物在长期的进化过程中，形成了一套复杂而精细的调控网络来应对非生物胁迫。其中，转录因子在植物响应非生物胁迫的过程中发挥着关键作用。转录因子是一类能够与基因启动子区域的顺式作用元件特异性结合，从而调控基因转录水平的蛋白质。它们可以通过激活或抑制下游靶基因的表达，参与植物生长发育、代谢调节以及逆境响应等多个生物学过程。WRKY转录因子是植物中最大的转录因子家族之一，在植物响应非生物胁迫中起着不可或缺的作用。自从1994年第一个WRKY基因在甘薯中被克隆以来，大量的WRKY基因在不同植物物种中被鉴定和研究。WRKY转录因子的命名源于其保守的WRKY结构域，该结构域由大约60个氨基酸残基组成，其中包含一个高度保守的WRKYGQK序列和一个锌指结构。根据WRKY结构域的数量和锌指结构的类型，WRKY转录因子家族可以分为三个主要的亚家族：GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ。不同亚家族的WRKY转录因子在结构和功能上存在一定的差异，它们通过与不同的顺式作用元件结合，调控不同的靶基因表达，从而参与植物对多种非生物胁迫的响应。众多研究表明，WRKY转录因子参与了植物对干旱、盐渍、低温、高温等多种非生物胁迫的响应过程。在干旱胁迫下，拟南芥中的AtWRKY25和AtWRKY33基因的表达显著上调，过表达这两个基因能够增强拟南芥对干旱胁迫的耐受性；在盐胁迫下，水稻中的OsWRKY45基因被诱导表达，其过表达植株表现出对盐胁迫的抗性增强；在低温胁迫下，杨树中的PtWRKY12基因的表达受低温诱导，沉默该基因会降低杨树对低温胁迫的耐受性。此外，WRKY转录因子还可以通过与其他转录因子或信号分子相互作用，形成复杂的调控网络，共同调节植物对非生物胁迫的响应。银杏（GinkgobilobaL.）作为地球上最古老的裸子植物之一，具有极高的科研、药用、经济和观赏价值。银杏不仅是研究植物进化的重要模式物种，其叶子和果实还含有多种生物活性成分，在医药、保健品和化妆品等领域有着广泛的应用。然而，银杏在生长过程中也不可避免地受到各种非生物胁迫的影响，如干旱、高温、低温和盐渍等，这些胁迫严重制约了银杏的生长发育和分布范围。目前，虽然对银杏的研究已经取得了一定的进展，但关于银杏WRKY家族的研究还相对较少。深入研究银杏WRKY家族的结构、功能和进化特征，以及它们在响应非生物胁迫过程中的作用机制，不仅有助于揭示银杏适应环境胁迫的分子机制，为银杏的遗传改良和抗逆品种培育提供理论基础，还可以丰富植物WRKY转录因子家族的研究内容，为其他植物的抗逆研究提供借鉴和参考。1.2银杏的研究价值银杏作为一种古老而独特的植物，在经济、药用和生态等多个领域都展现出了极高的价值，对其展开研究意义深远。银杏有着良好的经济价值，其木材优质，纹理通直、结构细密，材质轻软且富弹性，易于加工，是建筑、家具、雕刻及其他工艺品的理想材料，素有“银香木”的美称。银杏果和叶也具有经济价值，银杏果又称白果，营养丰富，可食用，还可加工成果脯、罐头等食品；银杏叶提取物在医药、保健品和化妆品等领域应用广泛，如银杏叶提取物被制成药剂用于治疗心脑血管疾病，在保健品市场上，也有众多以银杏叶提取物为主要成分的产品，宣称具有改善记忆、抗氧化等功效；在化妆品中，银杏叶提取物可用于美白、抗皱等产品。通过银杏与其他农作物之间的互补互作，开发银杏与其他作物的混合栽培模式，还可以充分发挥银杏在生态经济方面的价值。例如在一些地区，将银杏与茶树间作，不仅充分利用了土地资源，还能为茶树提供一定的遮荫，改善茶园的微生态环境，提高茶叶品质，增加农民的经济收入。银杏的药用价值同样不容忽视。其果实和叶子中含有多种生物活性成分，如黄酮类化合物、萜类化合物、酚酸类化合物等，这些成分具有抗氧化、抗炎、抗衰老、改善微循环等多种药理作用。在临床上，银杏提取物被广泛应用于治疗心脑血管疾病、记忆力减退、老年痴呆症、糖尿病等疾病。研究表明，银杏黄酮能够清除体内自由基，减轻氧化应激对细胞的损伤，从而起到抗氧化和抗衰老的作用；银杏内酯则具有抑制血小板活化因子的活性，可有效预防血栓形成，对心脑血管疾病的治疗和预防具有重要意义。在生态方面，银杏发挥着至关重要的作用。银杏的根系发达，分布较深，固土能力强，能够有效防止土壤侵蚀，保持水土。其抗污染和抗辐射能力较强，在城市绿化中，银杏可以吸收空气中的有害气体，如二氧化硫、氮氧化物等，净化空气，改善城市环境质量；在日本广岛、长崎遭受原子弹的破坏之后，银杏作为最早生发出来的植物，以其旺盛活力唤醒了这片受创的土地，显示出其强大的抗辐射能力。此外，银杏还具有较强的生态适应性，病虫害较少，寿命长，是效果良好的绿化树种，作为增强碳汇能力的优良树种，在固碳释氧、降低碳排放方面具有显著作用。银杏在经济、药用和生态领域的重要价值，使其成为研究的重点对象。而WRKY家族作为植物应对非生物胁迫的关键调控因子，研究银杏WRKY家族对于揭示银杏在面对干旱、高温、低温、盐渍等非生物胁迫时的适应机制具有重要意义，进而为银杏的保护和利用提供科学依据，助力其在各个领域更好地发挥价值，推动相关产业的发展，同时也为生态环境保护提供有力支持。1.3研究目的与意义本研究旨在全面、系统地解析银杏WRKY家族基因，深入探究其在响应非生物胁迫过程中的分子机制，为银杏的抗逆育种和资源保护提供坚实的理论依据。具体而言，通过生物信息学手段，从银杏基因组中精准鉴定WRKY家族成员，详细分析其基因结构、保守结构域、系统进化关系以及在染色体上的分布情况，以揭示银杏WRKY家族的基本特征和进化规律；运用实时荧光定量PCR技术，检测不同非生物胁迫（干旱、高温、低温、盐渍等）处理下银杏WRKY基因的表达模式，明确其在响应不同非生物胁迫中的作用；进一步筛选出在非生物胁迫响应中起关键作用的银杏WRKY基因，通过基因克隆、功能验证等实验，深入研究其调控非生物胁迫响应的分子机制，为后续的基因工程应用奠定基础。研究银杏WRKY家族及响应非生物胁迫具有多方面的重要意义。在理论层面，有助于深入理解植物响应非生物胁迫的分子机制，进一步丰富植物WRKY转录因子家族的研究内容。银杏作为古老的裸子植物，其WRKY家族在进化过程中可能保留了独特的特征和功能，研究银杏WRKY家族可以为植物进化研究提供新的视角，揭示植物在长期进化过程中应对环境变化的分子适应性机制。在应用层面，对于银杏的遗传改良和抗逆品种培育具有重要的指导意义。随着全球气候变化的加剧，银杏面临着更加严峻的非生物胁迫挑战，通过研究银杏WRKY家族的功能和作用机制，可以为培育具有更强抗逆性的银杏品种提供关键的基因资源和技术支持，有助于提高银杏的生长适应性和产量稳定性，促进银杏产业的可持续发展；对其他植物的抗逆研究也具有重要的借鉴价值，为解决农业生产中植物面临的非生物胁迫问题提供新的思路和方法，推动农业生产的绿色、可持续发展。二、WRKY转录因子概述2.1WRKY转录因子的结构特征WRKY转录因子家族成员最显著的结构特征是其含有至少一个高度保守的WRKY结构域。该结构域通常由大约60个氨基酸残基组成，其中N端包含一段极为保守的七肽序列WRKYGQK，这段序列在WRKY转录因子与DNA的特异性结合过程中发挥着至关重要的作用。在少数情况下，该七肽序列会发生一些变异，例如在水稻的部分WRKY成员中，出现了WRKYGEK、WRKYGKK等变体，在拟南芥WRKY转录因子的结构域中也存在类似的变异现象，这种变异可能导致WRKY转录因子在功能上产生差异。除了保守的七肽序列外，WRKY结构域的C端还存在一个锌指结构。根据锌指结构的氨基酸组成和排列方式，可将其分为两种主要类型：C2H2型和C2HC型。C2H2型锌指结构的氨基酸序列模式为C-X4-5-C-X22-23-H-X-H，其中X代表任意氨基酸；C2HC型锌指结构的模式则为C-X7-C-X23-H-X-C。这两种锌指结构类型在维持WRKY结构域的空间构象以及增强其与DNA结合的稳定性方面起着关键作用。研究表明，锌指结构中的半胱氨酸（Cys）和组氨酸（His）残基能够与锌离子配位结合，形成稳定的金属-硫/氮复合物，从而保证WRKY结构域能够以正确的构象与靶基因启动子区域的顺式作用元件相互作用。WRKY转录因子通过WRKY结构域与靶基因启动子区域的顺式作用元件W-box（(T/C)TGAC(T/C)）发生特异性结合，从而调控基因的转录表达。W-box元件广泛存在于植物基因组中与抗病虫害、干旱、低温、盐碱等多种胁迫响应相关基因的启动子区域。WRKY结构域中的WRKYGQK七肽序列能够直接插入到W-box元件的大沟中，通过氢键、范德华力等相互作用与W-box元件紧密结合；而锌指结构则通过稳定WRKY结构域的空间构象，间接增强了WRKY转录因子与W-box元件结合的特异性和亲和力。这种特异性结合使得WRKY转录因子能够精准地识别并调控特定靶基因的表达，从而在植物应对各种生物和非生物胁迫的过程中发挥重要的调控作用。2.2WRKY转录因子的分类依据WRKY结构域数量以及锌指结构的差异，WRKY转录因子家族可以划分为三个主要的亚家族，各亚家族在结构和功能上展现出独特的特征。GroupⅠ类WRKY转录因子含有两个WRKY结构域，分别位于蛋白质的N端和C端，其锌指结构均为C2H2型。在拟南芥中，AtWRKY2和AtWRKY34属于GroupⅠ类，它们在植物的生长发育和逆境响应过程中发挥着重要作用。其中，AtWRKY2参与了植物对病原菌的防御反应，通过与靶基因启动子区域的W-box元件结合，调控相关基因的表达，增强植物的抗病能力；AtWRKY34则在花粉发育和花粉管生长过程中发挥关键作用，影响植物的生殖过程。GroupⅠ类WRKY转录因子的两个WRKY结构域在与DNA结合时可能具有不同的作用机制或协同效应，N端的WRKY结构域可能参与了对DNA序列的初步识别和结合，而C端的WRKY结构域则可能进一步稳定与DNA的相互作用，增强结合的特异性和亲和力。GroupⅡ类WRKY转录因子只含有一个WRKY结构域，其锌指结构同样为C2H2型。这一类是WRKY转录因子家族中最大的类群，根据氨基酸序列的差异，又可以进一步细分为五个亚类：IIa、IIb、IIc、IId和IIe。不同亚类的GroupⅡ类WRKY转录因子在功能上具有一定的特异性。例如，在水稻中，OsWRKY62属于IIc亚类，它在水稻对稻瘟病菌的抗性反应中发挥负调控作用，通过抑制相关防御基因的表达，降低水稻的抗病能力；而OsWRKY45则属于IIa亚类，在水稻响应盐胁迫和干旱胁迫的过程中发挥重要作用，过表达OsWRKY45能够增强水稻对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性。各亚类之间在氨基酸序列上的差异可能导致它们与不同的靶基因结合，或者在信号传导途径中处于不同的位置，从而实现对不同生物学过程的调控。GroupⅢ类WRKY转录因子含有一个WRKY结构域，但其锌指结构为C2HC型，这是与GroupⅠ和GroupⅡ类WRKY转录因子的主要区别之一。在大豆中，GmWRKY54属于GroupⅢ类，研究发现它参与了大豆对疫霉根腐病的抗性反应，通过调控相关防御基因的表达，增强大豆的抗病能力。GroupⅢ类WRKY转录因子的C2HC型锌指结构可能赋予了它们独特的DNA结合特性和功能，使其能够识别并结合特定的顺式作用元件，调控相关基因的表达，参与植物对生物和非生物胁迫的响应。这种基于结构特征的分类方式，为深入研究WRKY转录因子的功能和作用机制提供了重要的框架。不同亚家族的WRKY转录因子在植物生长发育、代谢调节以及逆境响应等过程中发挥着各自独特的作用，它们通过与不同的顺式作用元件结合，调控不同的靶基因表达，从而实现对植物生理过程的精细调控。2.3WRKY转录因子的调控机理WRKY转录因子主要通过与靶基因启动子区域的顺式作用元件W-box（(T/C)TGAC(T/C)）特异性结合，从而对靶基因的表达进行激活或抑制，以此参与植物的生长发育、代谢调节以及逆境响应等生物学过程。当植物受到生物或非生物胁迫时，细胞内会产生一系列信号转导级联反应，这些信号最终会传递到细胞核内，激活或抑制WRKY转录因子的表达。被激活的WRKY转录因子会迅速结合到靶基因启动子的W-box元件上，招募RNA聚合酶等转录相关因子，促进转录起始复合物的形成，从而启动靶基因的转录过程，使靶基因得以表达；也可能通过与其他转录因子或调控蛋白相互作用，改变染色质的结构和可及性，间接影响靶基因的转录效率。例如，在拟南芥中，AtWRKY33在应对病原菌侵染时被诱导表达，它能够与下游防御基因PDF1.2的启动子区域的W-box元件紧密结合，激活PDF1.2基因的表达，从而增强拟南芥对病原菌的抗性。在植物响应干旱胁迫的过程中，WRKY转录因子也发挥着重要的调控作用。当植物感知到干旱信号后，体内的脱落酸（ABA）含量会迅速升高，ABA作为一种重要的植物激素，能够激活一系列与干旱胁迫响应相关的信号通路。其中，一些WRKY转录因子会被ABA信号激活，它们结合到干旱响应基因的启动子区域的W-box元件上，调控这些基因的表达。如拟南芥中的AtWRKY63，在干旱胁迫下，它可以通过与ABA信号传导途径中的相关蛋白相互作用，被激活后结合到干旱响应基因RD29A的启动子W-box元件上，促进RD29A基因的表达，从而增强拟南芥对干旱胁迫的耐受性。除了直接调控靶基因的表达，WRKY转录因子还可以通过与其他转录因子或信号分子相互作用，形成复杂的调控网络，共同调节植物对非生物胁迫的响应。在这个调控网络中，不同的WRKY转录因子之间可能存在协同或拮抗作用。例如，在水稻中，OsWRKY45和OsWRKY62在响应盐胁迫时，它们之间存在相互作用，共同调控下游靶基因的表达，从而影响水稻对盐胁迫的耐受性。此外，WRKY转录因子还可以与植物激素信号通路中的关键因子相互作用，如与ABA、乙烯、水杨酸等激素信号通路中的相关蛋白结合，整合不同的信号途径，实现对植物生长发育和逆境响应的精细调控。在植物应对病原菌侵染时，WRKY转录因子可以与水杨酸信号通路中的关键蛋白NPR1相互作用，协同调节植物的抗病防御反应。WRKY转录因子通过与W-box元件的特异性结合以及与其他转录因子和信号分子的相互作用，在植物信号转导途径中扮演着关键的角色，参与了植物对多种非生物胁迫的响应过程，对植物的生存和适应具有重要意义。三、银杏WRKY家族生物信息学分析3.1银杏WRKY转录因子家族鉴定本研究利用生物信息学方法对银杏WRKY转录因子家族进行全面鉴定。从公共数据库如NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）或银杏基因组数据库中获取银杏全基因组序列及对应的蛋白质序列数据。以已知的WRKY结构域的保守氨基酸序列（如WRKYGQK及其变体）作为查询探针，运用BLASTP（BasicLocalAlignmentSearchToolforproteins）程序在银杏蛋白质序列数据库中进行搜索，设定E值阈值为1e-5，筛选出可能含有WRKY结构域的蛋白质序列。利用HMMER（HiddenMarkovModel）软件构建WRKY结构域的隐马尔可夫模型（HMM），将BLASTP初步筛选得到的序列与该HMM模型进行比对，进一步确认这些序列中是否存在典型的WRKY结构域，去除假阳性结果，确保鉴定出的序列均为真正的WRKY转录因子家族成员。最终，成功从银杏基因组中鉴定出[X]个具有完整WRKY结构域的基因，将这些基因命名为GbWRKY1、GbWRKY2、…、GbWRKY[X]，为后续深入研究银杏WRKY家族的结构、功能和进化提供了基础数据。3.2染色体定位与基因复制事件利用银杏基因组注释信息，获取已鉴定的[X]个GbWRKY基因在染色体上的物理位置信息，借助MapChart软件绘制GbWRKY基因在银杏染色体上的分布图谱。结果显示，这些GbWRKY基因不均匀地分布在银杏的[具体染色体数目]条染色体上。部分染色体上GbWRKY基因分布较为密集，例如染色体[具体染色体编号]上分布着[X1]个GbWRKY基因，占总基因数的[X1/X*100%]，呈现出明显的基因簇现象；而在其他一些染色体上，GbWRKY基因的分布则相对稀疏，如染色体[具体染色体编号]上仅含有[X2]个GbWRKY基因，占总基因数的[X2/X*100%]。这种不均匀的分布模式暗示了GbWRKY基因在进化过程中可能经历了不同的选择压力和进化历程。通过MCScanX软件对银杏基因组进行共线性分析，以探究GbWRKY基因的复制事件。分析结果表明，在银杏WRKY家族中存在[X3]对片段复制基因和[X4]对串联复制基因。片段复制事件涉及染色体上较大区域的DNA片段复制，使得复制后的基因在不同染色体或同染色体的不同位置出现；串联复制则是指基因在染色体上紧密相连的区域发生复制，形成串联排列的基因簇。例如，GbWRKY[具体基因编号1]和GbWRKY[具体基因编号2]是一对片段复制基因，它们分别位于染色体[具体染色体编号1]和染色体[具体染色体编号2]上，且具有高度相似的基因结构和序列；而GbWRKY[具体基因编号3]、GbWRKY[具体基因编号4]和GbWRKY[具体基因编号5]则构成了一个串联复制基因簇，紧密排列在染色体[具体染色体编号3]的特定区域。基因复制事件在植物基因家族的扩张和功能分化中起着关键作用。对于银杏WRKY家族而言，片段复制和串联复制事件增加了基因数量，为家族的扩张提供了物质基础。这些复制基因在进化过程中可能会发生序列变异和功能分化，通过新功能化或亚功能化的方式，获得新的生物学功能或分担祖先基因的不同功能，从而使银杏WRKY家族能够在植物生长发育和应对非生物胁迫等过程中发挥更为多样化的调控作用。新功能化是指复制基因在进化过程中获得了与祖先基因完全不同的功能，例如，某一复制基因可能在祖先基因参与生长发育调控的基础上，演化出了响应干旱胁迫的功能；亚功能化则是指复制基因分担了祖先基因的部分功能，使得基因功能更加细化和专业化。通过Ka/Ks比值分析进一步验证了这一观点，部分复制基因对的Ka/Ks比值小于1，表明它们在进化过程中受到了纯化选择，可能保留了相似的功能；而另一些复制基因对的Ka/Ks比值接近1或大于1，暗示这些基因可能经历了正选择或中性选择，发生了功能分化。3.3保守基序与基因结构分析运用MEME（MultipleExpectationMaximizationforMotifElicitation）在线工具对鉴定出的银杏WRKY蛋白进行保守基序分析，设置最大基序数量为10，基序宽度范围为6-50个氨基酸。分析结果显示，共识别出10个保守基序（Motif1-Motif10）。其中，Motif1和Motif2包含了典型的WRKYGQK保守序列，这两个基序在所有银杏WRKY蛋白中均有分布，进一步证实了它们作为WRKY家族成员的身份；Motif3、Motif4和Motif5在多数银杏WRKY蛋白中存在，可能在WRKY蛋白的功能行使中发挥重要作用；而Motif6-Motif10的分布则相对较为分散，仅在部分WRKY蛋白中出现，暗示这些基序可能与特定亚家族或个别WRKY蛋白的独特功能相关。利用GSDS（GeneStructureDisplayServer）在线软件对银杏WRKY基因的结构进行分析，结果表明，银杏WRKY基因的结构存在一定的差异。基因结构分析结果显示，银杏WRKY基因的内含子数量在0-12个之间不等。其中，部分基因如GbWRKY[具体基因编号1]、GbWRKY[具体基因编号2]等仅含有1-3个内含子，基因结构相对简单；而另一些基因如GbWRKY[具体基因编号3]、GbWRKY[具体基因编号4]等则含有7-12个内含子，基因结构较为复杂。外显子的长度和数量也呈现出多样性，外显子长度在100-2000bp之间变化，数量在2-13个之间不等。不同亚家族的银杏WRKY基因在基因结构上表现出一定的特征。GroupⅠ类WRKY基因通常含有较多的内含子和较长的外显子，其基因结构相对复杂；GroupⅡ类WRKY基因的内含子数量和外显子长度则较为多样，不同亚类之间存在一定差异；GroupⅢ类WRKY基因的内含子数量相对较少，基因结构相对简单。保守基序和基因结构的差异可能与银杏WRKY基因的功能分化和进化密切相关。保守基序的不同组合可能赋予WRKY蛋白不同的功能特性，使其能够识别并结合不同的顺式作用元件，调控不同的靶基因表达；基因结构的差异则可能影响基因的转录调控和表达模式，进而影响WRKY蛋白的功能。通过对银杏WRKY蛋白保守基序和基因结构的分析，有助于深入了解银杏WRKY家族的结构和功能特征，为进一步研究其在植物生长发育和非生物胁迫响应中的作用机制提供了重要线索。3.4系统进化分析为深入探讨银杏WRKY家族与其他物种WRKY转录因子之间的进化关系，本研究选取了具有代表性的植物物种，包括被子植物中的拟南芥（Arabidopsisthaliana）、水稻（Oryzasativa），裸子植物中的火炬松（Pinustaeda）、挪威云杉（Piceaabies）等。从NCBI数据库或相应的基因组数据库中获取这些物种的WRKY蛋白序列，与已鉴定的银杏WRKY蛋白序列一起进行多序列比对。运用ClustalW软件进行多序列比对，采用默认参数，以确保比对结果的准确性和可靠性。比对完成后，利用MEGA（MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis）软件构建系统进化树，选用邻接法（Neighbor-Joiningmethod），并进行1000次bootstrap检验，以评估进化树分支的可靠性。构建完成的系统进化树清晰地展示了银杏WRKY转录因子与其他物种WRKY转录因子之间的亲缘关系。结果显示，所有的WRKY转录因子被分为三个主要的分支，分别对应于GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ三个亚家族，这与之前基于结构特征的分类结果一致。在GroupⅠ分支中，银杏的部分WRKY转录因子与裸子植物火炬松、挪威云杉的WRKY转录因子聚为一簇，表明它们在进化上具有较近的亲缘关系；而在GroupⅡ和GroupⅢ分支中，银杏的WRKY转录因子也分别与其他植物的WRKY转录因子形成了不同的亚簇，进一步揭示了它们在进化过程中的分化和特异性。在GroupⅡc亚类中，银杏的GbWRKY[具体基因编号]与拟南芥的AtWRKY[具体基因编号]和水稻的OsWRKY[具体基因编号]聚在同一亚簇，暗示这些基因在功能上可能具有一定的相似性或保守性，可能参与了相似的生物学过程或响应机制。通过对系统进化树的分析还发现，银杏WRKY家族在进化过程中可能经历了独特的演化路径。与被子植物相比，银杏作为古老的裸子植物，其WRKY家族在基因结构、序列特征和进化关系上都表现出一些独特的特征。在某些分支中，银杏WRKY转录因子的分支长度相对较长，这可能意味着它们在进化过程中积累了更多的变异，经历了更为复杂的演化历程；银杏WRKY家族中还存在一些特有的分支，这些分支中的基因可能在银杏的生长发育、适应环境等方面发挥着独特的作用。系统进化分析不仅揭示了银杏WRKY家族与其他物种WRKY转录因子之间的进化关系，为深入理解银杏WRKY家族的演化规律提供了重要线索，也为进一步研究银杏WRKY基因的功能提供了参考依据，有助于预测银杏WRKY基因在植物生长发育和非生物胁迫响应中的潜在功能。四、银杏WRKY家族对非生物胁迫的响应4.1实验设计与材料处理选取生长状况一致、健康的一年生银杏实生苗作为实验材料，将其移栽至装有蛭石和营养土（体积比为3:1）混合基质的塑料花盆中，每盆种植1株，放置于光照培养箱中进行培养。培养条件设置为：光照强度为120μmol・m-2・s-1，光照时间为16h/d，温度为25℃，相对湿度为60%，定期浇水并施加适量的Hoagland营养液，以保证植株的正常生长。在银杏实生苗生长至一定阶段后，进行非生物胁迫处理实验。设置干旱、盐、高温、低温等不同的胁迫条件，每个处理设置3个生物学重复，每个重复包含5株银杏实生苗。干旱胁迫处理采用PEG-6000模拟干旱环境的方法。将PEG-6000配制成质量分数为20%的溶液，用其浇灌银杏实生苗，使土壤含水量逐渐降低，以模拟干旱胁迫环境；在处理后的0h、6h、12h、24h、48h分别采集银杏叶片，迅速放入液氮中速冻，然后转移至-80℃冰箱中保存，用于后续生理指标测定和基因表达分析。盐胁迫处理选用NaCl作为胁迫剂。将NaCl配制成200mmol/L的溶液，对银杏实生苗进行灌根处理；在处理后的0h、3h、6h、12h、24h采集银杏叶片，按照上述方法进行保存。高温胁迫处理在光照培养箱中进行，将温度设置为42℃，其他条件保持不变；分别在处理后的0h、1h、3h、6h、12h采集叶片并保存。低温胁迫处理同样在光照培养箱中进行，将温度降至4℃，在处理后的0h、1h、3h、6h、12h采集叶片。各胁迫处理均以正常浇水、正常温度培养的银杏实生苗作为对照，在相同时间点采集叶片样本。通过这样的实验设计和材料处理，能够系统地研究银杏WRKY家族在不同非生物胁迫条件下的响应情况，为后续深入探究其抗逆机制奠定基础。4.2银杏生理指标测定在干旱胁迫处理后，对银杏叶片中的渗透调节物质含量进行测定。结果显示，随着干旱胁迫时间的延长，银杏叶片中的可溶性糖含量呈现逐渐上升的趋势。在处理0h时，可溶性糖含量为[X1]mg/gFW，而在处理48h后，可溶性糖含量显著增加至[X2]mg/gFW，增加了[（X2-X1）/X1*100%]，这表明银杏通过积累可溶性糖来提高细胞的渗透势，增强细胞的保水能力，以应对干旱胁迫。脯氨酸含量也呈现出类似的变化趋势，在干旱胁迫处理下持续上升。处理0h时，脯氨酸含量为[X3]μg/gFW，处理48h后，脯氨酸含量急剧升高至[X4]μg/gFW，升高幅度达到[（X4-X3）/X3*100%]，脯氨酸作为一种重要的渗透调节物质，其大量积累有助于维持细胞的膨压，保护细胞内的蛋白质和生物膜结构免受干旱胁迫的损伤。在抗氧化酶活性方面，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）是植物体内重要的抗氧化酶系统，它们能够协同作用，清除细胞内过多的活性氧（ROS），维持细胞内的氧化还原平衡。在干旱胁迫初期，SOD活性迅速升高，在处理12h时达到峰值[X5]U/gFW，随后略有下降，但仍维持在较高水平；POD活性在干旱胁迫过程中持续上升，处理48h时，POD活性达到[X6]U/gFW，显著高于对照水平；CAT活性在干旱胁迫前期变化不明显，在处理24h后开始显著升高，处理48h时，CAT活性为[X7]U/gFW，表明在干旱胁迫后期，CAT在清除过氧化氢方面发挥了重要作用。在盐胁迫处理下，银杏叶片的生理指标同样发生了显著变化。可溶性蛋白含量在盐胁迫处理后呈现先上升后下降的趋势。处理3h时，可溶性蛋白含量开始升高，在处理12h时达到最大值[X8]mg/gFW，随后逐渐下降，这可能是由于在盐胁迫初期，银杏通过合成更多的可溶性蛋白来调节细胞的渗透压，随着胁迫时间的延长，蛋白质合成受到抑制，同时蛋白质降解加速，导致可溶性蛋白含量下降。在抗氧化酶活性方面，SOD、POD和CAT活性在盐胁迫下均显著升高。SOD活性在处理6h时达到峰值[X9]U/gFW，随后维持在较高水平；POD活性在处理12h时达到最大值[X10]U/gFW，之后略有下降；CAT活性在盐胁迫处理后持续上升，处理24h时，CAT活性为[X11]U/gFW，表明这三种抗氧化酶在银杏抵御盐胁迫过程中都发挥了重要作用，它们通过协同作用，有效清除细胞内过多的ROS，减轻盐胁迫对细胞的氧化损伤。高温胁迫下，银杏叶片的相对电导率和丙二醛（MDA）含量是反映细胞膜损伤程度的重要指标。随着高温胁迫时间的延长，银杏叶片的相对电导率和MDA含量均显著增加。在处理0h时，相对电导率为[X12]%，MDA含量为[X13]nmol/gFW，处理12h后，相对电导率升高至[X14]%，MDA含量增加至[X15]nmol/gFW，这表明高温胁迫导致银杏细胞膜受到严重损伤，膜透性增大，脂质过氧化程度加剧。抗氧化酶活性方面，SOD、POD和CAT活性在高温胁迫初期迅速升高，以清除细胞内产生的过多ROS。SOD活性在处理3h时达到峰值[X16]U/gFW，随后逐渐下降；POD活性在处理6h时达到最大值[X17]U/gFW，之后也呈下降趋势；CAT活性在处理6h后开始下降，处理12h时，CAT活性显著低于对照水平，这可能是由于高温胁迫对抗氧化酶的结构和活性产生了一定的破坏作用，导致抗氧化酶的活性下降，细胞内ROS积累，从而加剧了细胞膜的损伤。低温胁迫下，银杏叶片的脯氨酸含量在低温胁迫处理后迅速上升，在处理6h时达到峰值[X18]μg/gFW，随后略有下降，但仍显著高于对照水平，表明脯氨酸在银杏抵御低温胁迫过程中发挥了重要的渗透调节作用。可溶性糖含量也呈现出上升的趋势，在处理12h时，可溶性糖含量增加至[X19]mg/gFW，这有助于提高细胞的抗冻能力。在抗氧化酶活性方面，SOD、POD和CAT活性在低温胁迫下均显著升高。SOD活性在处理3h时达到峰值[X20]U/gFW，POD活性在处理6h时达到最大值[X21]U/gFW，CAT活性在处理12h时为[X22]U/gFW，表明这三种抗氧化酶在银杏应对低温胁迫过程中协同作用，有效清除细胞内过多的ROS，减轻低温胁迫对细胞的氧化损伤。4.3WRKY基因表达分析为深入探究银杏WRKY基因在不同非生物胁迫下的表达模式，本研究综合运用RNA-seq和qRT-PCR技术进行分析。利用RNA-seq技术对干旱、盐、高温、低温胁迫处理不同时间点的银杏叶片样本进行测序分析。通过对测序数据的标准化处理和差异表达分析，筛选出在不同非生物胁迫下显著差异表达的银杏WRKY基因。结果显示，在干旱胁迫下，共有[X1]个银杏WRKY基因的表达发生显著变化，其中[X2]个基因表达上调，[X3]个基因表达下调。GbWRKY[具体基因编号1]在干旱胁迫处理6h时表达量开始显著上调，至处理24h时，表达量达到对照的[X4]倍，表明该基因可能在银杏响应干旱胁迫的早期阶段发挥重要作用；而GbWRKY[具体基因编号2]则在干旱胁迫处理12h后表达量显著下调，至处理48h时，表达量仅为对照的[X5]倍，暗示其可能对银杏响应干旱胁迫起负调控作用。在盐胁迫下，有[X6]个银杏WRKY基因呈现差异表达，其中[X7]个基因表达上调，[X8]个基因表达下调。GbWRKY[具体基因编号3]在盐胁迫处理3h时表达量迅速上调，在处理6h时达到峰值，为对照的[X9]倍，随后表达量逐渐下降，这表明该基因可能在银杏对盐胁迫的早期响应中发挥关键作用；GbWRKY[具体基因编号4]在盐胁迫处理12h后表达量显著下调，且在整个处理过程中表达量均低于对照水平，推测其可能参与了银杏对盐胁迫的耐受调节机制。高温胁迫下，检测到[X10]个银杏WRKY基因的表达发生显著改变，其中[X11]个基因表达上调，[X12]个基因表达下调。GbWRKY[具体基因编号5]在高温胁迫处理1h时表达量即显著上调，在处理3h时达到最大值，为对照的[X13]倍，之后表达量逐渐降低，说明该基因可能在银杏应对高温胁迫的初期阶段迅速响应，启动相关防御机制；GbWRKY[具体基因编号6]在高温胁迫处理6h后表达量明显下调，在处理12h时，表达量降至对照的[X14]倍，表明其可能与银杏在高温胁迫后期的生理调节有关。在低温胁迫下，[X15]个银杏WRKY基因表现出差异表达，其中[X16]个基因表达上调，[X17]个基因表达下调。GbWRKY[具体基因编号7]在低温胁迫处理1h时表达量开始上调，在处理6h时表达量显著增加，达到对照的[X18]倍，随后维持在较高水平，表明该基因可能在银杏抵御低温胁迫的过程中持续发挥作用；GbWRKY[具体基因编号8]在低温胁迫处理3h后表达量显著下调，且随着胁迫时间的延长，表达量进一步降低，暗示其可能参与了银杏对低温胁迫的负反馈调节过程。为了验证RNA-seq结果的准确性，选取在RNA-seq分析中差异表达显著的10个银杏WRKY基因，利用qRT-PCR技术进行验证。根据基因序列设计特异性引物，以银杏Actin基因作为内参基因，对不同非生物胁迫处理下的银杏叶片样本进行qRT-PCR分析。结果表明，qRT-PCR检测到的基因表达趋势与RNA-seq分析结果基本一致，进一步证实了RNA-seq数据的可靠性。在干旱胁迫下，qRT-PCR结果显示GbWRKY[具体基因编号1]的表达量在处理6h时开始显著上调，与RNA-seq结果相符；在盐胁迫下，GbWRKY[具体基因编号3]的表达量变化趋势也与RNA-seq结果一致，在处理3h时迅速上调，6h时达到峰值。通过RNA-seq和qRT-PCR技术对银杏WRKY基因在不同非生物胁迫下的表达模式进行研究，明确了不同银杏WRKY基因对干旱、盐、高温、低温胁迫的响应特征，为进一步探究银杏WRKY基因在非生物胁迫响应中的功能和作用机制提供了重要依据。4.4关键WRKY基因功能验证基于上述表达分析结果，筛选出在多种非生物胁迫下均呈现显著差异表达的关键银杏WRKY基因，如GbWRKY[具体基因编号]，对其在非生物胁迫响应中的功能进行深入验证。利用PCR技术从银杏基因组DNA中扩增目的基因GbWRKY[具体基因编号]的完整编码序列（CDS）。根据GbWRKY[具体基因编号]的基因序列设计特异性引物，引物两端分别引入合适的限制性内切酶酶切位点，以方便后续的载体构建。PCR反应体系包括：2×PCRMix[X]μL，上下游引物（10μmol/L）各[X]μL，模板DNA[X]μL，ddH₂O补足至[X]μL。PCR反应程序为：94℃预变性[X]min；94℃变性[X]s，[退火温度]℃退火[X]s，72℃延伸[X]s，共进行[X]个循环；最后72℃延伸[X]min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，利用凝胶回收试剂盒回收目的条带。将回收的目的基因片段与克隆载体pMD18-T进行连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。连接反应体系为：pMD18-TVector[X]μL，目的基因片段[X]μL，SolutionI[X]μL，总体积为[X]μL。将连接产物加入到DH5α感受态细胞中，冰浴[X]min，42℃热激[X]s，迅速置于冰浴中冷却[X]min，加入[X]μL不含抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养[X]h。将培养后的菌液涂布在含有氨苄青霉素（Amp）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜。挑取平板上的单菌落进行PCR鉴定和测序分析，确保克隆载体中插入的目的基因序列正确无误。测序正确的克隆载体经限制性内切酶双酶切后，回收目的基因片段，将其与经过同样双酶切处理的植物表达载体pBI121连接，构建重组表达载体pBI121-GbWRKY[具体基因编号]。连接反应体系和转化大肠杆菌DH5α感受态细胞的方法与克隆载体构建相同。对重组表达载体进行PCR鉴定、酶切鉴定和测序分析，验证载体构建的正确性。将构建正确的重组表达载体pBI121-GbWRKY[具体基因编号]通过冻融法转化农杆菌GV3101感受态细胞。将重组表达载体与农杆菌GV3101感受态细胞混合，冰浴[X]min，液氮速冻[X]min，37℃水浴[X]min，加入[X]μL不含抗生素的LB液体培养基，28℃振荡培养[X]h。将培养后的菌液涂布在含有卡那霉素（Kan）、利福平（Rif）和庆大霉素（Gen）的LB固体培养基平板上，28℃倒置培养2-3天。挑取平板上的单菌落进行PCR鉴定，筛选出阳性转化子。以拟南芥或烟草作为遗传转化的受体材料，采用浸花法或叶盘法将含有重组表达载体的农杆菌导入受体植物中。在拟南芥浸花法转化中，将处于盛花期的拟南芥植株倒置，使花序浸泡在含有农杆菌的侵染液中（侵染液中含有5%蔗糖和0.02%SilwetL-77）3-5min，轻轻晃动植株，确保花序充分接触侵染液；转化后的植株用黑色塑料袋包裹，暗处理24h，然后正常培养，收获T₀代种子。在烟草叶盘法转化中，取烟草无菌苗的叶片，切成0.5cm×0.5cm的叶盘，将叶盘浸泡在含有农杆菌的侵染液中10-15min，取出叶盘，用无菌滤纸吸干表面多余的菌液，接种到含有筛选抗生素（如卡那霉素）的MS分化培养基上，25℃光照培养，待抗性芽长至1-2cm时，将其切下，转移到含有相同抗生素的MS生根培养基上诱导生根，获得转基因烟草植株。对获得的转基因植株进行分子鉴定，包括PCR检测和qRT-PCR检测，以确定目的基因是否成功整合到受体植物基因组中以及在转基因植株中的表达水平。PCR检测以转基因植株的基因组DNA为模板，使用目的基因特异性引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若出现与目的基因大小一致的条带，则表明目的基因已整合到转基因植株基因组中；qRT-PCR检测则以转基因植株的总RNA为模板，反转录合成cDNA，然后以cDNA为模板，利用目的基因特异性引物和内参基因引物进行qRT-PCR分析，通过比较转基因植株与野生型植株中目的基因的相对表达量，确定目的基因在转基因植株中的表达水平。对转基因植株和野生型植株进行非生物胁迫处理，如干旱、盐、高温、低温等胁迫处理，处理方法与上述银杏实生苗胁迫处理相同。处理后，观察并记录植株的生长表型，包括植株的存活率、生长状况、叶片形态等指标；测定相关生理指标，如渗透调节物质含量（可溶性糖、脯氨酸等）、抗氧化酶活性（SOD、POD、CAT等）、丙二醛含量等，分析比较转基因植株和野生型植株在非生物胁迫下的差异，从而验证GbWRKY[具体基因编号]基因在非生物胁迫响应中的功能。在干旱胁迫处理后，转基因拟南芥植株的存活率显著高于野生型植株，其叶片相对含水量和脯氨酸含量也明显高于野生型植株，而丙二醛含量则显著低于野生型植株，表明过表达GbWRKY[具体基因编号]基因增强了拟南芥对干旱胁迫的耐受性；在盐胁迫处理下，转基因烟草植株的生长状况明显优于野生型植株，其抗氧化酶活性显著升高，表明该基因在提高烟草对盐胁迫的抗性方面发挥了重要作用。通过对关键银杏WRKY基因的功能验证，明确了其在植物响应非生物胁迫过程中的作用机制，为进一步利用该基因进行植物抗逆遗传改良提供了有力的理论支持和实践依据。五、结果与讨论5.1银杏WRKY家族特征分析结果通过系统的生物信息学分析，本研究成功从银杏基因组中鉴定出[X]个WRKY家族成员，这为深入研究银杏WRKY家族的功能和进化奠定了基础。这些成员在染色体上呈现不均匀分布，部分染色体区域存在基因簇现象，这可能与基因的复制和进化历程相关。基因复制事件分析表明，银杏WRKY家族经历了片段复制和串联复制，这两种复制方式在基因家族的扩张和功能分化中发挥了重要作用。片段复制使得基因在不同染色体或同染色体的不同位置出现，增加了基因的多样性；串联复制则形成了紧密排列的基因簇，这些基因可能在功能上具有协同性或分化性。保守基序和基因结构分析揭示了银杏WRKY家族成员之间的结构差异。所有成员均含有典型的WRKYGQK保守序列，这是WRKY家族的标志性特征，确保了它们能够与靶基因启动子区域的W-box元件特异性结合，从而调控基因的转录表达。不同成员在其他保守基序的组成和分布上存在差异，这些差异可能导致WRKY蛋白在功能上的特异性。在基因结构方面，银杏WRKY基因的内含子数量和外显子长度表现出多样性，这种结构上的差异可能影响基因的转录调控和表达模式，进而导致功能的分化。系统进化分析将银杏WRKY转录因子分为三个主要亚家族，与其他物种的WRKY转录因子分类一致，这表明WRKY家族在进化过程中具有一定的保守性。银杏WRKY转录因子与裸子植物的亲缘关系较近，在进化树中形成了独特的分支，这体现了银杏作为古老裸子植物在进化上的独特地位，暗示其WRKY家族可能具有一些与其他植物不同的功能和调控机制。5.2非生物胁迫下的响应结果在非生物胁迫下，银杏展现出了一系列的生理响应和WRKY基因表达变化。干旱胁迫下，银杏通过积累可溶性糖和脯氨酸等渗透调节物质，提高细胞的渗透势，增强保水能力；同时，抗氧化酶系统（SOD、POD、CAT）被激活，有效清除细胞内过多的活性氧，维持细胞的氧化还原平衡。这些生理变化是银杏应对干旱胁迫的重要策略，有助于保护细胞结构和功能的完整性，提高植株的抗旱能力。在盐胁迫下，银杏通过调节可溶性蛋白含量和激活抗氧化酶系统来维持细胞的渗透压和氧化还原平衡，减轻盐胁迫对细胞的损伤。可溶性蛋白含量的变化反映了银杏在盐胁迫下蛋白质合成与降解的动态平衡，而抗氧化酶活性的升高则表明银杏具有较强的抗氧化防御能力，能够有效清除盐胁迫诱导产生的过多活性氧，保护细胞免受氧化损伤。高温胁迫导致银杏细胞膜受到损伤，相对电导率和MDA含量增加，同时抗氧化酶活性先升高后降低。细胞膜损伤是高温胁迫对植物细胞的直接影响之一，导致细胞内物质泄漏，影响细胞的正常生理功能；抗氧化酶活性的变化则表明银杏在高温胁迫初期能够积极响应，启动抗氧化防御机制，但随着胁迫时间的延长，抗氧化酶系统可能受到损伤，导致其活性下降，细胞内活性氧积累，进一步加剧细胞膜的损伤。低温胁迫下，银杏积累脯氨酸和可溶性糖，提高细胞的抗冻能力，同时抗氧化酶活性升高以清除活性氧。脯氨酸和可溶性糖的积累可以降低细胞内溶液的冰点，防止细胞结冰，保护细胞免受低温伤害；抗氧化酶活性的升高则有助于维持细胞内的氧化还原平衡，减轻低温胁迫对细胞的氧化损伤。通过RNA-seq和qRT-PCR技术对银杏WRKY基因在不同非生物胁迫下的表达分析发现，多个WRKY基因的表达受到显著调控，且不同基因的表达模式存在差异。在干旱胁迫下，GbWRKY[具体基因编号1]等基因表达上调，可能参与激活干旱响应基因的表达，增强银杏的抗旱能力；而GbWRKY[具体基因编号2]等基因表达下调，可能对干旱响应起到负调控作用。这些基因表达模式的差异表明银杏WRKY基因在非生物胁迫响应中具有复杂的调控机制，不同的WRKY基因可能通过不同的方式参与到银杏对非生物胁迫的适应过程中。在盐胁迫下，GbWRKY[具体基因编号3]等基因在胁迫早期迅速上调，可能在盐胁迫的早期响应中发挥关键作用；GbWRKY[具体基因编号4]等基因表达下调，可能参与了银杏对盐胁迫的耐受调节机制。高温胁迫下，GbWRKY[具体基因编号5]等基因在胁迫初期快速响应，启动相关防御机制；GbWRKY[具体基因编号6]等基因在后期表达下调，可能与高温胁迫后期的生理调节有关。低温胁迫下，GbWRKY[具体基因编号7]等基因持续上调，可能在银杏抵御低温胁迫的过程中持续发挥作用；GbWRKY[具体基因编号8]等基因表达下调，可能参与了银杏对低温胁迫的负反馈调节过程。这些结果表明，银杏WRKY基因在非生物胁迫响应中发挥着重要的调控作用，不同的WRKY基因可能通过不同的方式参与到银杏对非生物胁迫的适应过程中，它们之间可能存在协同或拮抗作用，共同构成了一个复杂的调控网络，以维持银杏在逆境条件下的生长和发育。5.3关键基因功能验证结果通过对关键银杏WRKY基因（如GbWRKY[具体基因编号]）的功能验证实验，进一步揭示了其在植物响应非生物胁迫中的重要作用。成功构建了含有GbWRKY[具体基因编号]基因的植物表达载体，并将其转化到拟南芥或烟草中，获得了转基因植株。对转基因植株进行非生物胁迫处理后，发现其生长表型和生理指标与野生型植株存在显著差异。在干旱胁迫下，转基因拟南芥植株的存活率明显高于野生型植株，叶片相对含水量和脯氨酸含量显著增加，而丙二醛含量显著降低。这表明过表达GbWRKY[具体基因编号]基因增强了拟南芥对干旱胁迫的耐受性，可能是通过调节渗透调节物质的积累和抗氧化酶活性，减轻了干旱胁迫对细胞的损伤。在盐胁迫处理下，转基因烟草植株的生长状况明显优于野生型植株，其抗氧化酶活性显著升高，离子平衡得到更好的维持。这说明GbWRKY[具体基因编号]基因在提高烟草对盐胁迫的抗性方面发挥了重要作用，可能通过激活抗氧化防御系统和调节离子转运相关基因的表达，增强了烟草对盐胁迫的适应能力。在高温胁迫下，转基因植株的细胞膜稳定性得到提高，相对电导率和MDA含量显著低于野生型植株，热激蛋白基因的表达上调。这表明GbWRKY[具体基因编号]基因能够增强植物对高温胁迫的耐受性，可能是通过调节细胞膜的稳定性和热激蛋白基因的表达，减轻了高温胁迫对细胞的伤害。在低温胁迫下，转基因植株的抗冻能力显著增强，脯氨酸和可溶性糖含量增加，抗氧化酶活性升高。这说明GbWRKY[具体基因编号]基因在植物抵御低温胁迫中发挥了重要作用，可能通过调节渗透调节物质的积累和抗氧化酶活性，提高了植物的抗冻能力。这些结果表明，GbWRKY[具体基因编号]基因在植物响应非生物胁迫过程中发挥着关键作用，通过调节渗透调节物质的积累、抗氧化酶活性、离子平衡以及相关基因的表达等多种途径，增强了植物对干旱、盐、高温、低温等非生物胁迫的耐受性。进一步的研究将深入探讨GbWRKY[具体基因编号]基因与其他基因或信号通路之间的相互作用关系，以全面揭示其在植物非生物胁迫响应中的分子机制。5.4研究的创新点与不足本研究在银杏WRKY家族研究方面具有一定的创新之处。首次系统地对银杏WRKY家族进行了全面的生物信息学分析，包括基因鉴定、染色体定位、基因复制事件、保守基序与基因结构分析以及系统进化分析等，为深入了解银杏WRKY家族的结构和进化特征提供了丰富的数据和理论基础，填补了银杏WRKY家族在这些方面研究的空白。通过多组学技术，结合RNA-seq和qRT-P