检验诊断试剂免疫

检验诊断试剂免疫文档ppt第一页，共54页。酶标志物、抗原、抗体、酶免疫复合物第二页，共54页。酶标志物——酶标记抗体或抗原酶免疫技术的核心组成部分酶结合物（conjugate）酶标记物通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的结合物

第三页，共54页。酶标记抗体或抗原制备方法过碘酸钠法（直接法）常用于HRP标记抗体或抗原

戊二醛交联法第四页，共54页。1.辣根过氧化物酶（HRP）

糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关辅基是酶的活性中心(ELISA中应用最为广泛的标记用酶)ELISA常用酶2.碱性磷酸酶（AP）

第五页，共54页。辣根过氧化物酶HRP上的糖羟基可以被高碘酸钠（NaPIO4）激活生成醛基，这些醛基能通过Schiff碱与蛋白中的氨基偶联，紧接着还原Schiff碱形成稳定的偶联产物。这种HRP偶联标记方法已经被广泛认可，但是也存在一定的缺陷，特别是去除过量高碘酸钠（NaPIO4）的过程较为繁琐。需要注意的是，被高碘酸钠（NaPIO4）激活的HRP很不稳定，其酶活力会在几天内丢失第六页，共54页。第七页，共54页。第八页，共54页。评价第九页，共54页。第十页，共54页。第十一页，共54页。第十二页，共54页。第十三页，共54页。第十四页，共54页。均相酶免疫测定

homogenousenzymeimmunoassay

用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。原理第十五页，共54页。均相酶免疫测定最具代表性的两种技术酶放大免疫测定技术EMITenzyme-mutipliedimmunoassaytechnique

克隆酶供体免疫分析

CEDIAclonedenzymedonorimmunoassay

第十六页，共54页。第十七页，共54页。第十八页，共54页。利用重组DNA技术制备β-半乳糖苷酶的两个片段：大片段称为酶受体（enzymeacceptor,EA），小片段称为酶供体（enzymedonor,ED），两个片段本身均不具酶活性，但结合在一起就具有酶活性，利用这一特性建立的均相酶免疫测定称为克隆酶供体免疫测定(CEDIA)。CEDIA的反应模式为竞争法。克隆酶供体免疫测定

（clonedenzymedonorimmunoassay,CEDIA）第十九页，共54页。一、基本原理：标本中的抗原和ED标记的抗原与特异性抗体竞争结合，形成两种抗原抗体复合物。ED标记的抗原与抗体结合后由于空间位阻，不能再与EA结合。反应平衡后，剩余的ED标记抗原与EA结合，形成具有活性的酶，加入底物测定酶活力，酶活力的大小与标本中抗原含量呈正比。第二十页，共54页。第二十一页，共54页。第二十二页，共54页。第二十三页，共54页。：健康人O型血或绵羊静脉血，应2w内固化第二十四页，共54页。第二十五页，共54页。第二十六页，共54页。第二十七页，共54页。第二十八页，共54页。第二十九页，共54页。第三十页，共54页。第三十一页，共54页。第三十二页，共54页。第三十三页，共54页。第三十四页，共54页。第三十五页，共54页。第三十六页，共54页。第三十七页，共54页。第三十八页，共54页。第三十九页，共54页。第四十页，共54页。第四十一页，共54页。第四十二页，共54页。第四十三页，共54页。第四十四页，共54页。第四十五页，共54页。第四十六页，共54页。第四十七页，共54页。第四十八页，共54页。第四十九页，共54页。第五十页，共54页。1.概述：以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成。（斑点免疫渗滤试验最初是从斑点ELISA基础上发展起来建立的，应用的结合物是酶标记的，称为斑点酶免疫渗滤试验。90年代初发展了以胶体金为标记物的斑点免疫渗滤试验（DIGFA），又名滴金免疫测定法（简称滴金法）。在滴金法中不需酶对底物的反应，更加简便、快速，在临床检验中应用日渐广泛。）斑点免疫渗滤试验2.原理：以双抗体夹心法为例。在硝酸纤维素膜的膜片中央滴加纯化的抗体，为膜所吸附。当滴加在膜上的标本液体渗滤过膜时，标本中含抗原被膜上抗体捕获，其余无关蛋白等没滤出膜片。其后加入的胶体金标记也在渗滤中与已结合在膜上的抗原相结合。因胶体金本身呈红色，阳性反应即在膜中央显示红色斑点。3.试剂和操作渗滤装置是滴金法测定中的主要试剂成分之一，由塑料小盒、吸水垫料和点加了抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分组成塑料小盒可以是多种形状的，盒盖的中央有一直径约0.4～0.8cm的小圆孔，盒内垫放吸水垫料，硝酸纤维素膜片安放在正对盒盖的中央有一直径约0.40.8cm的小圆孔，盒的垫放吸水塑料，硝酸纤维素膜片安放在正对盒的圆孔下，紧密关闭盒盖，使硝酸纤维素膜片贴紧吸水垫料。如此即制备成一渗滤装置（图19-1）。塑料小盒的形状最多见的是扁平的长方形小板，加之滴金法的整个反应过程都是在渗滤装置上进行的，因此又常称渗滤装置为滴金法反应板。第五十一页，共54页。

图19-1DIGFA渗滤装置及操作示意图A：操作示意图B:装置分解图斑点免疫渗滤试验第五十二页，共54页。斑点免疫层析试验1.原理：斑点免疫层析试验（DICA）简称免疫层析试验（ICA），也以硝酸纤维素膜为载体，但利用了微孔膜的毛细血管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析一般2.试剂和操作免疫层析试验以单克隆双抗体夹心法为例。试验所用试剂全部为干试剂，多个试剂被组合在一个约6mm×70mm的塑料板条上，成为一单一试剂条（图19