实验大肠杆菌的分离和培养

实验大肠杆菌的分离和培养第1页，共33页。一、大肠杆菌

革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌在肠道中一般对人无害但也有一些菌株对人体是有害的，可侵袭肠粘膜并产生毒素任何大肠杆菌如果进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。第2页，共33页。结晶紫碘液95%乙醇革兰氏染色法1min革兰阳性革兰阴性1min脱色复染第3页，共33页。菌落（colony）：一个细菌细胞在固体培养基上发展成一个肉眼可见，具一定形态结构的子细胞群。光滑型菌落粗糙型菌落第4页，共33页。第5页，共33页。二、细菌的培养和分离1、实验仪器设备：移液枪第6页，共33页。接种环玻璃刮刀第7页，共33页。超净工作台（保证无菌环境）第8页，共33页。高压蒸汽灭菌锅第9页，共33页。恒温培养箱第10页，共33页。摇床第11页，共33页。2、培养基：平板斜面固体培养基LB培养基：蛋白胨：0.5g酵母提取物：0.25gNaCl:0.5gH2O:50mL琼脂：1g液体培养基固体培养基调pH值第12页，共33页。菌膜菌沉淀均匀浑浊对照液体培养基（培养液）第13页，共33页。3、实验步骤：（1）培养基、培养皿灭菌

——高压蒸汽灭菌法

将配制好的50mlLB液体和固体培养基分别装入250ml三角瓶中，加上封口膜；

将培养皿用牛皮纸包好；置于灭菌锅内1kg压力灭菌15min

（121℃）第14页，共33页。无菌技术

最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞（不能用脱脂棉：易吸水引起后引起污染），也可采用各种金属、塑料、封口膜及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。（160℃2h或170℃1h）第15页，共33页。高压蒸汽灭菌法：玻璃器皿、金属、移液枪头等（火焰）灼烧：接种环、试管口、三角烧瓶口紫外灯+过滤风：超净台灭菌消毒：70%酒精棉球（消毒：利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。）第16页，共33页。（2）倒平板

灭菌后，待灭菌锅压力与大气压力相同时打开锅盖将有培养基的三角瓶和培养皿放到超净台上打开超净台的紫外灯和过滤风，待固体培养基冷却到60℃时，关闭紫外灯用酒精棉球消毒桌面和手。第17页，共33页。倒平板：10-12ml培养基/培养皿

每倒入一个后立即置于水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，并形成平面。酒精灯旁：左手？右手？第18页，共33页。制作试管斜面：

将配制好的呈熔化状态的培养基转移到试管中时必须用三角漏斗

灭菌试管冷却到50℃左右，把试管棉塞一端搁在玻棒上，待冷凝后即成试管斜面

将分装好的含培养基的试管灭菌P21小字部分第19页，共33页。1/3在试管外，2/3在试管内正确不正确棉塞制作第20页，共33页。（3）接种培养

左手：将大肠杆菌斜面和有液体培养基的三角烧瓶，靠近酒精灯火焰；

右手：拿接种环，并用无名指和小指夹住斜面的棉塞和三角瓶的封口膜；

接种环在火焰上烧红，再深入到斜面，使环接触培养基，再取菌体；

将菌体放入三角瓶的液体培养基中，瓶口封口膜和管口棉塞复原；

将三角瓶置于37℃摇床振荡培养12h。第21页，共33页。第22页，共33页。（4）划线分离

在酒精灯火焰上灼烧接种环；

将摇床上培养了12h的菌液打开，接种环部分深入到菌液中；

在固体培养基的平板上连续划线，接种环只在菌液中蘸菌液一次，划线后盖好培养皿；

将培养皿倒置（盖在下面），放到恒温培养箱中培养12-24h后，可看到在划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。第23页，共33页。划线分离法划线的起点要有菌，且每一次新的起点应比前一次的起点菌含量（浓度）低划线的最终点不能与前面的划线点重叠除第1次外，其余几次划线前，都要将接种环火焰灼烧第24页，共33页。恒温培养箱平板倒置防止培养皿盖上的冷凝水滴落入培养基表面，使菌落中的菌随水扩散，造成污染。第25页，共33页。划线分离法第26页，共33页。（5）斜面接种保存

在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上。37℃培养24h后，4℃冰箱保存。第27页，共33页。涂布分离法第28页，共33页。首先，涂布分离法的操作比划线分离法更复杂。因为涂布分离法包括先将菌液稀释的步骤，而且通常要稀释多个浓度，常稀释到10-5-10-7倍。（稀释实验过程见P26图）在涂布时，从不同稀释度的稀释菌液中各取0.1ml放在平板固体培养基上，再用玻璃刮刀涂布后