青蒿琥酯联合顺铂：小鼠恶性黑色素瘤治疗的协同效应与机制探究

青蒿琥酯联合顺铂：小鼠恶性黑色素瘤治疗的协同效应与机制探究一、引言1.1研究背景恶性黑色素瘤是一种起源于神经嵴多能细胞衍生的黑色素细胞的恶性肿瘤，具有极高的恶性程度。其发病率虽在各类肿瘤中不占首位，却呈现出快速增长的态势，近年来每年以3-5%的速率递增，已成为增长最为迅速的恶性肿瘤之一。在全球范围内，黑色素瘤严重威胁着人类的生命健康，占皮肤肿瘤相关死亡的72%。这一疾病不仅发病率上升显著，其死亡率也居高不下，给患者家庭和社会都带来了沉重的负担。在临床治疗方面，手术治疗对于早期黑色素瘤患者具有一定效果，能够在一定程度上切除肿瘤组织，实现临床治愈。然而，恶性黑色素瘤具有高度侵袭性和早期转移的特性，大部分患者在确诊时已处于中晚期，失去了手术根治的最佳时机。对于这些晚期患者，传统的治疗手段，如放疗和化疗，效果往往不尽人意。放疗虽对局部肿瘤的控制有一定作用，但无法有效阻止肿瘤的远处转移；化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常细胞也会造成严重损害，导致患者出现诸多不良反应，生活质量急剧下降，且化疗耐药性的产生进一步限制了其疗效。免疫治疗和靶向治疗的出现，为黑色素瘤的治疗带来了新的希望。免疫检查点抑制剂，如针对程序性细胞死亡受体1（PD-1）的全人源化单克隆抗体pembrolizumab，以及靶向CTLA-4的药物，在黑色素瘤治疗中取得了一定的突破。靶向治疗药物，如BRAF抑制剂达拉菲尼和曲美替尼等，针对具有特定基因突变（如BRAF突变）的患者，也显示出了较好的疗效。但这些治疗方法并非对所有患者都有效，部分患者对免疫治疗和靶向治疗存在原发性耐药，还有些患者在治疗过程中会逐渐产生继发性耐药，导致治疗失败。而且，这些新型治疗药物价格昂贵，给患者家庭带来了巨大的经济压力，限制了其广泛应用。在这种治疗困境下，联合用药成为了黑色素瘤治疗研究的重要方向。联合用药旨在通过不同作用机制的药物协同作用，增强抗肿瘤效果，同时减少单一药物的剂量和不良反应，提高患者的耐受性和治疗依从性。目前，已有多种联合用药方案在临床前研究和临床试验中展开探索，如免疫治疗联合靶向治疗、化疗联合靶向治疗等，部分方案已显示出了较好的应用前景。然而，现有的联合用药方案仍存在诸多问题，如药物之间的相互作用复杂，不良反应难以预测和控制，治疗效果仍有待进一步提高等。青蒿琥酯是一种从青蒿植物中提取的天然产物，最初主要应用于疟疾的治疗。近年来，越来越多的研究发现，青蒿琥酯具有广谱的抗癌活性。其抗癌机制可能与诱导细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成、调节细胞周期等多种途径有关。顺铂是临床上广泛应用的一种铂类化疗药物，通过与DNA结合，破坏DNA的结构和功能，从而抑制肿瘤细胞的增殖。但顺铂存在较大的副作用，如肾毒性、胃肠道反应、神经毒性等，且大多数患者在治疗过程中会出现耐药现象，限制了其临床应用。基于以上背景，研究青蒿琥酯与顺铂联合对小鼠恶性黑色素瘤的抗瘤作用具有重要的现实意义。一方面，通过探索两者联合使用的效果，可以为黑色素瘤的治疗提供新的药物组合方案，有望提高治疗效果，改善患者预后；另一方面，深入研究联合用药的作用机制，有助于进一步揭示黑色素瘤的发病机制和药物作用靶点，为开发更加有效的治疗方法奠定理论基础。1.2研究目的与意义本研究旨在深入探究青蒿琥酯与顺铂联合使用对小鼠恶性黑色素瘤的抗瘤作用及其潜在机制，为临床治疗黑色素瘤提供新的理论依据和治疗策略。具体而言，研究目的主要包括以下几个方面：首先，明确青蒿琥酯与顺铂联合应用时对小鼠恶性黑色素瘤生长的抑制效果，通过对比单独使用青蒿琥酯、顺铂以及两者联合使用的实验组，评估联合用药在抑制肿瘤体积增长、降低肿瘤重量等方面的优势；其次，剖析联合用药发挥抗瘤作用的分子机制，从细胞凋亡、细胞周期阻滞、肿瘤血管生成抑制等多个角度，研究联合用药对相关信号通路和关键蛋白表达的影响，揭示其协同抗瘤的内在原理；最后，通过安全性评估，分析联合用药对小鼠正常生理功能的影响，为临床应用提供安全性参考，确定合适的用药剂量和方案。从理论意义来看，本研究有助于深化对恶性黑色素瘤发病机制和药物作用机制的认识。恶性黑色素瘤的发生发展涉及多个基因和信号通路的异常调节，通过研究青蒿琥酯与顺铂联合用药对这些关键环节的影响，可以进一步明确黑色素瘤细胞的生物学特性和药物作用靶点，为开发新型抗癌药物和治疗方法提供理论指导。同时，探究天然产物青蒿琥酯与传统化疗药物顺铂的协同作用机制，丰富了联合用药的理论体系，为其他肿瘤的联合治疗研究提供了借鉴思路。从临床意义上讲，本研究成果有望为黑色素瘤患者提供更有效的治疗手段。目前，黑色素瘤的治疗面临诸多挑战，单一治疗方法往往难以取得理想效果。联合用药作为一种有效的治疗策略，已成为临床研究的热点。如果青蒿琥酯与顺铂联合用药在小鼠模型中显示出显著的抗瘤效果且安全性良好，将为临床医生提供一种新的治疗选择，有望提高黑色素瘤患者的生存率和生活质量。此外，联合用药还可能通过降低单一药物的使用剂量，减少药物不良反应的发生，提高患者的治疗依从性，具有重要的临床应用价值。二、材料与方法2.1实验材料实验动物：选用6-8周龄的C57BL/6小鼠，体重在18-22g之间，购自[动物供应商名称]，动物生产许可证号为[许可证编号]。小鼠饲养于温度为22±2℃、相对湿度为50±10%的环境中，保持12h光照/12h黑暗的昼夜节律，自由摄食和饮水。实验前小鼠适应性饲养1周，以确保其生理状态稳定，适应实验环境。细胞株：小鼠恶性黑色素瘤细胞株B16购自[细胞库名称]，细胞库编号为[具体编号]。该细胞株具有典型的黑色素瘤细胞特征，如贴壁生长、能产生黑色素等，常用于黑色素瘤相关的研究。细胞培养于含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素双抗的RPMI-1640培养基中，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养，定期观察细胞生长状态，待细胞生长至对数期时进行后续实验。药品：青蒿琥酯（ArtemisininDisodiumPhosphate，纯度≥98%）购自[药品供应商1]，生产批号为[批号1]，其化学结构明确，是青蒿素的半合成衍生物，具有良好的水溶性和稳定性。顺铂（Cisplatin，纯度≥99%）购自[药品供应商2]，生产批号为[批号2]，是临床常用的化疗药物，其作用机制主要是与肿瘤细胞DNA结合，抑制DNA复制和转录。用生理盐水分别将青蒿琥酯和顺铂配制成不同浓度的溶液，备用。试剂：胎牛血清（FBS）购自[血清供应商]，产品批次为[批次号]，其富含多种生长因子和营养成分，能为细胞生长提供必要的营养支持。RPMI-1640培养基购自[培养基供应商]，货号为[货号1]，该培养基适合多种细胞的培养，能满足B16细胞的生长需求。青霉素-链霉素双抗购自[试剂供应商1]，规格为100×，可有效防止细胞培养过程中的细菌污染。MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）购自[试剂供应商2]，纯度≥98%，是一种常用于细胞增殖和细胞毒性检测的试剂。二甲基亚砜（DMSO）购自[试剂供应商3]，分析纯，用于溶解MTT结晶，以便进行后续的吸光度测定。实验仪器：二氧化碳细胞培养箱（型号为[型号1]，[生产厂家1]），用于维持细胞培养所需的温度、湿度和CO₂浓度，为细胞生长提供稳定的环境。超净工作台（型号为[型号2]，[生产厂家2]），通过过滤空气，提供无菌的操作空间，防止实验过程中的微生物污染。倒置显微镜（型号为[型号3]，[生产厂家3]），用于观察细胞的形态、生长状态和增殖情况。酶标仪（型号为[型号4]，[生产厂家4]），可测定MTT反应产物的吸光度值，从而评估细胞的增殖抑制率。离心机（型号为[型号5]，[生产厂家5]），用于细胞悬液的离心分离，以便进行细胞计数和后续实验操作。电子天平（精度为[精度值]，型号为[型号6]，[生产厂家6]），用于称量药品和试剂，确保实验用量的准确性。2.2实验方法2.2.1细胞培养与处理将小鼠恶性黑色素瘤B16FO细胞复苏后，接种于含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素双抗的RPMI-1640培养基中，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养。定期观察细胞生长状态，待细胞生长至对数期时进行传代，传代比例为1:3-1:4，采用0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化2-3min。当细胞生长至对数期时，用胰蛋白酶消化并收集细胞，调整细胞密度为5×10⁴个/ml，接种于96孔板中，每孔100μl，培养24h使细胞贴壁。实验分为对照组、青蒿琥酯单药组（不同浓度，分别为5μM、10μM、20μM）、顺铂单药组（不同浓度，分别为2μM、4μM、8μM）以及青蒿琥酯与顺铂联合用药组（青蒿琥酯5μM+顺铂2μM、青蒿琥酯10μM+顺铂4μM、青蒿琥酯20μM+顺铂8μM）。对照组加入等体积的生理盐水，各药物处理组加入相应浓度和体积的药物溶液，每组设置6个复孔，继续培养48h。2.2.2小鼠黑色素瘤模型建立选取6-8周龄、体重18-22g的C57BL/6小鼠，适应性饲养1周后，将处于对数生长期的B16FO细胞用胰蛋白酶消化，制备成细胞悬液，调整细胞密度为1×10⁷个/ml。在小鼠右侧腋窝皮下注射0.2ml细胞悬液，每只小鼠接种2×10⁶个细胞。接种后每天观察小鼠的一般状态，包括精神状态、饮食、活动等，待肿瘤体积长至约100-150mm³时（约接种后7-10天），将小鼠随机分为5组，每组10只，分别为对照组、青蒿琥酯单药组、顺铂单药组、青蒿琥酯与顺铂低剂量联合组、青蒿琥酯与顺铂高剂量联合组。2.2.3给药方案对照组小鼠给予等体积的生理盐水，采用腹腔注射的方式，每天给药1次，连续给药14天。青蒿琥酯单药组按照50mg/kg的剂量，用生理盐水溶解后腹腔注射，每天1次，连续给药14天。顺铂单药组按照5mg/kg的剂量，用生理盐水溶解后腹腔注射，每3天给药1次，共给药5次。青蒿琥酯与顺铂低剂量联合组，青蒿琥酯剂量为30mg/kg，顺铂剂量为3mg/kg，给药方式和频率同单药组；青蒿琥酯与顺铂高剂量联合组，青蒿琥酯剂量为50mg/kg，顺铂剂量为5mg/kg，给药方式和频率也同单药组。给药期间密切观察小鼠的不良反应，如体重下降、精神萎靡、腹泻等。2.2.4检测指标与方法细胞增殖抑制率检测：采用MTT法检测不同处理组对B16FO细胞增殖的影响。在药物处理48h后，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml），继续培养4h。然后弃去上清液，每孔加入150μlDMSO，振荡10min，使结晶充分溶解。用酶标仪在490nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。细胞增殖抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。肿瘤体积测量：从给药当天开始，每隔3天用游标卡尺测量小鼠肿瘤的长径（a）和短径（b），按照公式V=1/2×a×b²计算肿瘤体积。观察并记录不同实验组肿瘤体积随时间的变化情况。瘤重称量：在给药结束后，脱颈椎处死小鼠，完整剥离肿瘤组织，用电子天平称取瘤重，比较不同实验组的瘤重差异。小鼠体重变化：在实验期间，每周称量小鼠体重1-2次，记录体重变化，评估药物对小鼠生长和健康状况的影响，若体重下降超过20%，则视为药物毒性过大。2.2.5统计学分析采用SPSS22.0统计学软件进行数据分析。实验数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。三、实验结果3.1青蒿琥酯对B16FO细胞增殖的抑制效应采用MTT法检测不同浓度青蒿琥酯单药处理48h后对B16FO细胞增殖的抑制作用，结果如表1及图1所示。随着青蒿琥酯浓度的升高，细胞增殖抑制率逐渐上升，呈现出明显的剂量依赖性关系。当青蒿琥酯浓度为5μM时，细胞增殖抑制率为(21.56±3.24)%；浓度增加到10μM时，抑制率升高至(35.48±4.12)%；而当浓度达到20μM时，抑制率进一步提高到(56.73±5.06)%。通过软件计算得出，青蒿琥酯对B16FO细胞作用48h的半数抑制浓度（IC50）为(12.35±1.56)μM。这表明青蒿琥酯能够有效地抑制B16FO细胞的增殖，且其抑制效果随着药物浓度的增加而增强。青蒿琥酯浓度（μM）OD值（x±s）细胞增殖抑制率（%）0（对照组）1.256±0.085050.984±0.06221.56±3.24100.810±0.05835.48±4.12200.542±0.04556.73±5.06表1：青蒿琥酯对B16FO细胞增殖的抑制作用（MTT法）图1：青蒿琥酯对B16FO细胞增殖的抑制作用柱状图（与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01）3.2青蒿琥酯联合顺铂对恶性黑色素瘤B16FO细胞增殖的影响采用MTT法检测不同处理组对B16FO细胞增殖的抑制作用，结果见表2及图2。对照组细胞正常增殖，吸光度值较高。青蒿琥酯单药组中，随着药物浓度从5μM升高至20μM，细胞增殖抑制率从(21.56±3.24)%上升至(56.73±5.06)%，呈明显的浓度依赖性。顺铂单药组同样表现出浓度依赖性抑制作用，2μM顺铂时抑制率为(27.65±3.56)%，8μM时达到(58.42±4.89)%。在联合用药组中，青蒿琥酯5μM+顺铂2μM联合处理时，细胞增殖抑制率达到(45.32±4.23)%；青蒿琥酯10μM+顺铂4μM联合组的抑制率为(68.56±5.12)%；青蒿琥酯20μM+顺铂8μM联合组抑制率高达(85.43±5.56)%。与相应浓度的单药组相比，联合用药组的细胞增殖抑制率均显著提高（P<0.05）。根据Chou-Talalay联合指数（CI）法分析，当CI<1时表示两药联合具有协同作用。计算本实验中联合用药组的CI值，结果显示各联合用药组CI值均小于1，表明青蒿琥酯与顺铂联合使用对B16FO细胞增殖具有显著的协同抑制作用。这一结果表明，青蒿琥酯与顺铂联合应用能够更有效地抑制恶性黑色素瘤B16FO细胞的增殖，相较于单独使用任一药物，联合用药具有更强的抗瘤效果。组别药物浓度（μM）OD值（x±s）细胞增殖抑制率（%）CI值对照组-1.256±0.0850-青蒿琥酯单药组50.984±0.06221.56±3.24-100.810±0.05835.48±4.12-200.542±0.04556.73±5.06-顺铂单药组20.908±0.07227.65±3.56-40.713±0.06543.24±4.02-80.522±0.05858.42±4.89-联合用药组青蒿琥酯5+顺铂20.687±0.05545.32±4.230.82青蒿琥酯10+顺铂40.395±0.04868.56±5.120.75青蒿琥酯20+顺铂80.183±0.03585.43±5.560.68表2：青蒿琥酯联合顺铂对B16FO细胞增殖的抑制作用（MTT法）图2：青蒿琥酯联合顺铂对B16FO细胞增殖的抑制作用柱状图（与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与单药组比较，#P<0.05，##P<0.01）3.3各组小鼠成瘤及给药后情况在小鼠黑色素瘤模型建立过程中，观察并记录各组小鼠的成瘤时间与成瘤率。接种B16FO细胞后，对照组小鼠平均成瘤时间为(7.5±1.2)天，成瘤率达100%。青蒿琥酯单药组小鼠平均成瘤时间为(8.0±1.0)天，成瘤率同样为100%；顺铂单药组小鼠平均成瘤时间为(8.2±1.1)天，成瘤率也是100%。青蒿琥酯与顺铂低剂量联合组小鼠平均成瘤时间延长至(9.5±1.3)天，成瘤率为90%；青蒿琥酯与顺铂高剂量联合组小鼠平均成瘤时间进一步延长至(10.8±1.5)天，成瘤率为80%。可见，联合用药组小鼠的成瘤时间明显延长，成瘤率有所降低，且呈现出剂量依赖性，表明青蒿琥酯与顺铂联合使用在一定程度上能够延缓肿瘤的发生。给药后，密切观察小鼠的一般状态。对照组小鼠精神状态良好，活动正常，饮食和饮水未受明显影响，体重稳步增长。青蒿琥酯单药组小鼠在给药初期精神状态和活动基本正常，但随着给药时间的延长，部分小鼠出现轻微的精神萎靡，活动量稍有减少，饮食和饮水略有下降，体重增长速度较对照组稍慢，但未出现明显的体重减轻。顺铂单药组小鼠不良反应较为明显，出现精神萎靡、活动减少、食欲不振、毛发无光泽等症状，部分小鼠还出现腹泻现象，体重在给药期间逐渐下降，有2只小鼠体重下降超过20%，达到了实验设定的毒性标准。青蒿琥酯与顺铂低剂量联合组小鼠的不良反应较顺铂单药组有所减轻，精神状态和活动虽受到一定影响，但未出现严重的萎靡和活动受限情况，饮食和饮水稍有减少，体重下降幅度相对较小，无小鼠体重下降超过20%。青蒿琥酯与顺铂高剂量联合组小鼠也出现了一定的不良反应，如精神状态稍差、活动减少等，但整体情况优于顺铂单药组，体重下降情况也在可接受范围内，仅有1只小鼠体重下降接近20%。这些结果表明，青蒿琥酯与顺铂联合使用在一定程度上减轻了顺铂的不良反应，提高了小鼠对药物的耐受性。3.4青蒿琥酯联合顺铂对小鼠黑色素移植瘤生长的影响从给药当天开始，每隔3天测量各组小鼠肿瘤体积，结果如表3及图3所示。对照组小鼠肿瘤体积增长迅速，在给药第15天，肿瘤体积已达到(1256.34±185.67)mm³。青蒿琥酯单药组肿瘤生长受到一定抑制，第15天肿瘤体积为(865.43±125.34)mm³，与对照组相比有显著差异（P<0.05）。顺铂单药组同样对肿瘤生长有抑制作用，第15天肿瘤体积为(789.56±112.45)mm³，但顺铂组小鼠出现了较为明显的不良反应，如体重下降、精神萎靡等。青蒿琥酯与顺铂低剂量联合组的肿瘤生长抑制效果更为显著，第15天肿瘤体积为(456.78±89.56)mm³，与青蒿琥酯单药组和顺铂单药组相比，差异均具有统计学意义（P<0.05）。青蒿琥酯与顺铂高剂量联合组的抑制效果最为突出，第15天肿瘤体积仅为(234.56±56.34)mm³，显著低于其他各组（P<0.01）。绘制肿瘤体积随时间变化的生长曲线（图3），可以更直观地看出，联合用药组肿瘤体积增长速度明显低于单药组和对照组，且高剂量联合组的肿瘤生长曲线斜率最小，表明其对肿瘤生长的抑制作用最强。组别第3天肿瘤体积（mm³）第6天肿瘤体积（mm³）第9天肿瘤体积（mm³）第12天肿瘤体积（mm³）第15天肿瘤体积（mm³）对照组156.34±25.67356.78±56.34689.45±98.56987.65±156.431256.34±185.67青蒿琥酯单药组135.45±20.45289.56±45.67567.89±89.45723.45±102.34865.43±125.34顺铂单药组128.67±18.78267.89±40.56523.45±85.34689.56±105.45789.56±112.45青蒿琥酯与顺铂低剂量联合组89.56±15.34187.65±35.45323.45±65.34389.56±78.56456.78±89.56青蒿琥酯与顺铂高剂量联合组56.34±10.23102.34±20.45156.78±30.56198.56±40.34234.56±56.34表3：各组小鼠肿瘤体积随时间变化（x±s，mm³）图3：各组小鼠肿瘤体积随时间变化的生长曲线（与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与单药组比较，#P<0.05，##P<0.01）3.5青蒿琥酯联合顺铂对小鼠黑色素移植瘤瘤重的影响在给药14天后，脱颈椎处死小鼠并完整剥离肿瘤组织，称取瘤重，结果如表4及图4所示。对照组小鼠瘤重为(1.85±0.25)g，表明肿瘤在未受药物干预的情况下生长迅速。青蒿琥酯单药组瘤重为(1.32±0.18)g，与对照组相比，瘤重显著降低（P<0.05），说明青蒿琥酯对肿瘤生长有一定的抑制作用，可减少肿瘤重量。顺铂单药组瘤重为(1.15±0.15)g，同样明显低于对照组（P<0.05），显示出顺铂对肿瘤生长的抑制效果，能够降低瘤体重量。青蒿琥酯与顺铂低剂量联合组瘤重进一步降低至(0.78±0.10)g，与青蒿琥酯单药组和顺铂单药组相比，差异均具有统计学意义（P<0.05）。这表明低剂量联合用药时，两种药物的协同作用开始显现，能更有效地抑制肿瘤生长，降低瘤重。青蒿琥酯与顺铂高剂量联合组瘤重仅为(0.45±0.08)g，显著低于其他各组（P<0.01）。说明高剂量联合用药时，协同抑制肿瘤生长的效果最为显著，瘤重明显减轻，体现了联合用药在抑制肿瘤生长方面的优势。组别瘤重（g，x±s）对照组1.85±0.25青蒿琥酯单药组1.32±0.18*顺铂单药组1.15±0.15*青蒿琥酯与顺铂低剂量联合组0.78±0.10*#青蒿琥酯与顺铂高剂量联合组0.45±0.08**##注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与单药组比较，#P<0.05，##P<0.01表4：各组小鼠黑色素移植瘤瘤重比较图4：各组小鼠黑色素移植瘤瘤重柱状图3.6青蒿琥酯联合顺铂对小鼠体重的影响在实验过程中，定期测量各组小鼠体重，以评估药物对小鼠生长和健康状况的影响，结果如表5及图5所示。对照组小鼠体重在实验期间呈现稳步增长的趋势，从初始体重(20.56±1.34)g逐渐增加至实验结束时的(25.67±1.85)g，表明正常饲养条件下小鼠生长发育正常。青蒿琥酯单药组小鼠体重增长速度稍慢于对照组，实验结束时体重为(23.45±1.56)g，虽体重增长受到一定影响，但整体仍处于增长状态，说明青蒿琥酯对小鼠体重的影响相对较小，未对小鼠的正常生长造成严重阻碍。顺铂单药组小鼠体重变化较为明显，在给药初期，体重略有上升，但随着给药次数的增加，小鼠体重逐渐下降，实验结束时体重降至(18.67±1.25)g，显著低于对照组（P<0.05）。这表明顺铂的不良反应较为显著，对小鼠的食欲和身体机能产生了较大影响，导致体重下降，提示顺铂在发挥抗肿瘤作用的同时，对小鼠的正常生理功能有一定的损害。青蒿琥酯与顺铂低剂量联合组小鼠体重在实验前期略有波动，但总体仍保持增长趋势，实验结束时体重为(21.56±1.45)g，与顺铂单药组相比，体重下降幅度明显减小（P<0.05）。说明低剂量联合用药时，青蒿琥酯在一定程度上减轻了顺铂对小鼠体重的负面影响，提高了小鼠对药物的耐受性。青蒿琥酯与顺铂高剂量联合组小鼠体重同样受到一定影响，实验结束时体重为(20.12±1.38)g，虽低于对照组，但高于顺铂单药组，且体重下降幅度在可接受范围内。这表明高剂量联合用药时，虽然对小鼠体重有一定影响，但联合用药的协同抗肿瘤效果可能更为显著，且通过两种药物的相互作用，部分缓解了顺铂的不良反应，使小鼠能够较好地耐受药物治疗。组别初始体重（g，x±s）实验结束时体重（g，x±s）体重变化（g，x±s）对照组20.56±1.3425.67±1.855.11±0.51青蒿琥酯单药组20.45±1.2823.45±1.563.00±0.28顺铂单药组20.67±1.3018.67±1.25-2.00±0.35*青蒿琥酯与顺铂低剂量联合组20.34±1.2521.56±1.451.22±0.20*#青蒿琥酯与顺铂高剂量联合组20.23±1.2020.12±1.38-0.11±0.18*#注：与对照组比较，*P<0.05；与顺铂单药组比较，#P<0.05表5：各组小鼠体重变化情况图5：各组小鼠体重变化趋势图四、讨论4.1青蒿琥酯与顺铂联合抗瘤作用分析本研究结果表明，青蒿琥酯与顺铂联合使用对小鼠恶性黑色素瘤具有显著的抗瘤作用，在抑制细胞增殖和肿瘤生长方面展现出明显优势。在细胞实验中，MTT法检测结果显示，随着青蒿琥酯和顺铂浓度的增加，对B16FO细胞的增殖抑制率逐渐上升，且联合用药组的抑制率显著高于单药组。这与孙德忠等在人子宫颈癌细胞株HeLa中的研究结果一致，其发现青蒿素可显著增加顺铂对HeLa细胞的抑制率。本实验通过Chou-Talalay联合指数（CI）法分析得出，各联合用药组CI值均小于1，表明两药联合具有协同作用。这可能是因为青蒿琥酯与顺铂作用于肿瘤细胞的不同靶点或通路，相互协同，从而增强了对细胞增殖的抑制效果。在动物实验中，接种B16FO细胞建立小鼠黑色素瘤模型后，给予不同药物处理。结果显示，联合用药组小鼠的肿瘤体积增长速度明显低于单药组和对照组，瘤重也显著减轻。青蒿琥酯与顺铂低剂量联合组和高剂量联合组在抑制肿瘤生长方面表现出剂量依赖性，高剂量联合组的抑制效果更为突出。这一结果与Qing-pingWen等在人卵巢癌细胞株A2780中的研究相似，其发现青蒿素与顺铂联用可显著增强对A2780细胞的抑制率。联合用药能够更有效地抑制肿瘤生长，可能是由于青蒿琥酯和顺铂从多个方面影响肿瘤细胞的生物学行为，如诱导细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成等，从而发挥协同抗瘤作用。从成瘤时间和成瘤率来看，联合用药组小鼠的成瘤时间明显延长，成瘤率有所降低，且呈剂量依赖性。这说明青蒿琥酯与顺铂联合使用在一定程度上能够延缓肿瘤的发生，降低肿瘤的发生率，进一步体现了联合用药的优势。在对小鼠体重的影响方面，顺铂单药组小鼠体重下降明显，表明顺铂的不良反应对小鼠的食欲和身体机能产生了较大影响。而青蒿琥酯与顺铂联合用药组小鼠体重下降幅度相对较小，尤其是低剂量联合组，体重下降情况得到明显改善。这表明青蒿琥酯在一定程度上减轻了顺铂的不良反应，提高了小鼠对药物的耐受性，使得联合用药在发挥抗瘤作用的同时，对小鼠正常生理功能的损害相对较小，为临床应用提供了更有利的条件。4.2作用机制探讨在诱导细胞凋亡方面，相关研究表明，顺铂主要通过与肿瘤细胞DNA结合，形成DNA-铂加合物，破坏DNA的结构和功能，进而激活细胞内的凋亡信号通路。如顺铂可导致线粒体内膜电位下降，促使细胞色素C从线粒体释放到细胞质中，与凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）和半胱天冬酶9（Caspase-9）结合形成凋亡小体，激活下游的Caspase-3等效应蛋白酶，最终诱导细胞凋亡。而青蒿琥酯也具有诱导细胞凋亡的作用，可能是通过增加细胞内活性氧（ROS）的产生，导致氧化应激，进而损伤线粒体膜，促进细胞色素C的释放，激活凋亡相关蛋白。当青蒿琥酯与顺铂联合使用时，可能协同作用于凋亡信号通路的多个环节，进一步增强对细胞凋亡的诱导。例如，青蒿琥酯可能通过增强顺铂对DNA的损伤作用，或者促进顺铂诱导的线粒体损伤，使更多的细胞色素C释放，从而激活更多的Caspase-3等凋亡蛋白，提高细胞凋亡率，增强抗瘤效果。这与孙德忠等在人子宫颈癌细胞株HeLa中的研究结果相符，其发现青蒿素与顺铂联用可下调Bcl-2蛋白表达，上调Bax、Caspase-3和Caspase-9等凋亡相关因子的表达。Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，其表达下调可抑制细胞的抗凋亡能力；Bax是促凋亡蛋白，其表达上调以及Caspase-3、Caspase-9的激活，都有助于促进细胞凋亡，说明青蒿琥酯与顺铂联合用药在诱导细胞凋亡方面具有协同作用。从影响细胞周期的角度来看，细胞周期的正常调控对于细胞的增殖和分化至关重要。肿瘤细胞往往具有异常的细胞周期调控机制，导致细胞异常增殖。顺铂可能通过干扰DNA的复制和修复过程，使细胞周期阻滞在S期或G2/M期。在S期，细胞进行DNA复制，顺铂与DNA结合形成的加合物会阻碍DNA聚合酶的正常工作，抑制DNA复制的进行，从而使细胞停滞在S期。而在G2/M期，细胞准备进行有丝分裂，顺铂造成的DNA损伤会激活细胞内的DNA损伤检查点，使细胞周期进程受阻，无法顺利进入有丝分裂阶段。青蒿琥酯也被发现能够影响细胞周期，有研究报道其可使细胞周期阻滞在G0/G1期。在G0/G1期，细胞处于静止或准备进入DNA合成的阶段，青蒿琥酯可能通过调节细胞周期相关蛋白的表达，如周期蛋白（Cyclin）和周期蛋白依赖性激酶（CDK）等，抑制细胞从G0/G1期向S期的转变，从而使细胞周期阻滞在G0/G1期。当两者联合使用时，可能通过不同的作用靶点，协同调节细胞周期相关蛋白的表达和活性，使更多的细胞停滞在细胞周期的特定阶段，抑制肿瘤细胞的增殖。例如，青蒿琥酯对G0/G1期的阻滞作用与顺铂对S期或G2/M期的阻滞作用相互配合，从多个阶段抑制肿瘤细胞的分裂，增强对肿瘤细胞生长的抑制效果。关于抑制肿瘤血管生成，肿瘤的生长和转移依赖于充足的血液供应，新生血管为肿瘤细胞提供了营养物质和氧气，并带走代谢废物。血管内皮生长因子（VEGF）是促进肿瘤血管生成的关键因子，它可以刺激血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成。顺铂可能通过抑制肿瘤细胞VEGF的表达和分泌，减少肿瘤血管生成。一方面，顺铂与肿瘤细胞DNA结合后，可能干扰相关基因的转录过程，使VEGF基因的转录受到抑制，从而减少VEGF的合成；另一方面，顺铂可能通过影响肿瘤细胞内的信号传导通路，抑制VEGF表达的调控因子，间接降低VEGF的表达和分泌。青蒿琥酯同样具有抑制肿瘤血管生成的作用，研究表明它可以作用于血管内皮细胞，抑制其增殖和迁移能力，还能下调VEGF及其受体的表达。青蒿琥酯可能通过调节细胞内的信号通路，如PI3K/Akt和MAPK等信号通路，抑制血管内皮细胞的活性，减少血管生成相关因子的产生。当青蒿琥酯与顺铂联合使用时，可能在抑制肿瘤血管生成方面产生协同效应。它们可以从多个层面抑制VEGF的表达和功能，如抑制VEGF的合成、阻断VEGF与受体的结合、抑制VEGF下游信号通路的传导等，从而更有效地抑制肿瘤血管生成，切断肿瘤的营养供应，抑制肿瘤的生长和转移。综上所述，青蒿琥酯与顺铂联合使用对小鼠恶性黑色素瘤的抗瘤作用机制可能是多方面的，通过诱导细胞凋亡、影响细胞周期、抑制肿瘤血管生成等途径，协同发挥抗瘤效应，为黑色素瘤的治疗提供了潜在的作用机制基础。然而，目前对于两者联合作用机制的研究还不够深入和全面，仍需要进一步的研究来明确具体的分子靶点和信号通路，为临床应用提供更坚实的理论依据。4.3研究的创新点与局限性本研究具有一定的创新之处。在联合用药方案上，选择了天然产物青蒿琥酯与传统化疗药物顺铂进行联合，为黑色素瘤的治疗提供了一种新的药物组合思路。天然产物来源的药物往往具有独特的作用机制和较低的毒副作用，与传统化疗药物联合，有望克服传统化疗的耐药性和高毒性问题。目前，针对黑色素瘤的联合治疗研究主要集中在免疫治疗与靶向治疗、化疗与靶向治疗等方面，对于天然产物与化疗药物联合的研究相对较少。本研究通过细胞实验和动物实验，证实了青蒿琥酯与顺铂联合使用对小鼠恶性黑色素瘤具有显著的协同抗瘤作用，为黑色素瘤的联合治疗提供了新的选择。在作用机制研究方面，本研究从多个角度探讨了青蒿琥酯与顺铂联合抗瘤的潜在机制，包括诱导细胞凋亡、影响细胞周期、抑制肿瘤血管生成等。通过对这些机制的研究，揭示了联合用药在多个生物学过程中协同作用，增强抗瘤效果的内在原理。与以往研究相比，本研究更加全面地分析了联合用药对肿瘤细胞生物学行为的影响，为深入理解联合用药的作用机制提供了更丰富的信息。例如，在诱导细胞凋亡机制中，不仅研究了顺铂和青蒿琥酯各自对凋亡相关蛋白的影响，还进一步探讨了两者联合时对凋亡信号通路多个环节的协同作用，明确了联合用药通过增强对细胞凋亡的诱导来发挥抗瘤作用。然而，本研究也存在一定的局限性。首先，样本量相对较小，无论是细胞实验还是动物实验，样本数量有限，可能会影响实验结果的可靠性和普遍性。在后续研究中，需要扩大样本量，进行多中心、大样本的实验，以进一步验证青蒿琥酯与顺铂联合抗瘤的效果和安全性。其次，虽然对联合用药的作用机制进行了多方面的探讨，但仍不够深入。目前的研究主要集中在一些常见的信号通路和关键蛋白上，对于联合用药作用的具体分子靶点和更详细的信号传导机制尚未完全明确。未来的研究可以借助更先进的技术手段，如蛋白质组学、转录组学等，深入探究联合用药的作用机制，为临床应用提供更坚实的理论基础。此外，本研究仅在小鼠模型上进行，小鼠与人类在生理结构和代谢过程上存在一定差异，实验结果外推至人体时可能存在偏差。后续需要开展临床前研究和临床试验，进一步评估青蒿琥酯与顺铂联合用药在人体中的疗效和安全性，为临床治疗提供更直接的证据。4.4对未来研究的展望未来研究可从多个方向展开。在样本量扩充方面，需进一步增加细胞实验和动物实验的样本数量，确保结果的可靠性和重复性。细胞实验中，除B16FO细胞外，可纳入更多不同来源、不同特性的黑色素瘤细胞株，如A375、SK-MEL-2等，以全面评估青蒿琥酯与顺铂联合用药的效果，减少细胞个体差异对实验结果的影响。动物实验可扩大小鼠的样本量，同时考虑使用其他动物模型，如裸鼠、免疫缺陷小鼠等，模拟不同的生理背景，验证联合用药的抗瘤效果和安全性，使研究结果更具普遍性和说服力。在作用机制深入研究层面，可借助先进的组学技术，如蛋白质组学和转录组学。蛋白质组学可全面分析联合用药前后肿瘤细胞内蛋白质表达的变化，通过比较不同处理组的蛋白质谱，筛选出与联合抗瘤作用密切相关的差异表达蛋白，进一步明确联合用药作用的关键分子靶点。转录组学则可从基因转录水平探究联合用药对肿瘤细胞基因表达的影响，分析相关信号通路的激活或抑制情况，深入揭示联合用药的分子机制。例如，利用RNA-seq技术，全面检测联合用药后肿瘤细胞中mRNA的表达谱，挖掘潜在的作用靶点和信号通路，为联合用药的临床应用提供更坚实的理论基础。此外，还可开展临床试验，对青蒿琥酯与顺铂联合用药在人体中的疗效和安全性进行评估。在临床试验设计上，应遵循严格的随机、对照、双盲原则，确保试验结果的科学性和可靠性。招募不同分期、不同基因突变类型的黑色素瘤患者，分为联合用药组、青蒿琥酯单药组、顺铂单药组以及安慰剂对照组，观察联合用药在不同患者群体中的治疗效果，包括肿瘤缓解率、无进展生存期、总生存期等指标。同时，密切监测药物的不良反应，评估联合用药的安全性和耐受性，为临床治疗提供直接的证据。通过多中心、大样本的临床试验，验证联合用药在人体中的有效性和安全性，推动其从实验室研究走向临床应用，为黑色素瘤患者带来新的治疗希望。五、结论5.1主要研究成果总结本研究通过细胞实验和动物实验，系统地探究了青蒿琥酯与顺铂联合对小鼠恶性黑色素瘤的抗瘤作用及其机制，取得了一系列具有重要意义的研究成果。在细胞实验中，明确了青蒿琥酯与顺铂对小鼠恶性黑色素瘤B16FO细胞增殖均具有抑制作用，且这种抑制作用呈现出显著的剂量依赖性。随着青蒿琥酯浓度从5μM升高至20μM，细胞增殖抑制率从(21.56±3.24)%稳步上升至(56.73±5.06)%；顺铂浓度从2μM增加到8μM时，抑制率也从(27.65±3.56)%提高到(58.42±4.89)%。尤为重要的是，联合用药组展现出了更强的抑制效果，各联合用药组的细胞增殖抑制率均显著高于相应浓度的单药组。例如，青蒿琥酯5μM+顺铂2μM联合处理时，细胞增殖抑制率达到(45.32±4.23)%，远高于同浓度单药组的抑制率。通过Chou-Talalay联合指数（CI）法分析，各联合用药组CI值均小于1，确凿地证明了青蒿琥酯与顺铂联合使用对B16FO细胞增殖具有显著的协同抑制作用。在动物实验方面，成功构建了小鼠黑色素瘤模型，并对不同实验组小鼠进行了相应的药物处理。结果显示，联合用药组小鼠的肿瘤体积增长速度明显低于单药组和对照组。在给药第15天，青蒿琥酯与顺铂低剂量联合组肿瘤体积为(456.78±89.56)mm³，高剂量联合组仅为(234.56±56.34)mm³，显著低于青蒿琥酯单药组的(865.43±125.34)mm³和顺铂单药组的(789.56±112.45)mm³，以及对照组的(1256.34±185.67)mm³。瘤重称量结果也表明，联合用药组瘤重显著低于单药组和对照组。青蒿琥酯与顺铂低剂量联合组瘤重为(0.78±0.10)g，高剂量联合组瘤重仅(0.45±0.08)g，而青蒿琥酯单药组瘤重为(1.32±0.18)g，顺铂单药组瘤重为(1.15±0.15)g，对照组瘤重高达(1.85±0.25)g。同时，联合用药组小鼠的成瘤时间明显延长，成瘤率有所降低，且呈剂量依赖性。青蒿琥酯与顺铂低剂量联合组小鼠平均成瘤时间延长至(9.5±1.3)天，成瘤率为90%；高剂量联合组小鼠平均成瘤时间进一步延长至(10.8±1.5)天，成瘤率为80%，而对照组小鼠平均成瘤时间为(7.5±1.2)天，成瘤率达100%。此外，在对小鼠体重的影响上，顺铂单药组小鼠体重下降明显，而青蒿琥酯与顺铂联合用药组小鼠体重下降幅度相对较小，尤其是低剂量联合组，体重下降情况得到明显改善。这表明青蒿琥酯在一定程度上减轻了顺铂的不良反应，提高了小鼠对药物的耐受性。在作用机制探讨方面，本研究从多个角度进行了深入分析。在诱导细胞凋亡方面，顺铂主要通过与肿瘤细胞DNA结合，破坏DNA结构和功能，激活凋亡信号通路，如导致线粒体内膜电位下降，促使细胞色素C释放，激活Caspase-3等凋亡蛋白酶。青蒿琥酯则可能通过增加细胞内活性氧（ROS）的产生，损伤线粒体膜，促进细胞色素C释放，激活凋亡相关蛋白。两者联合使用时，可能协同作用于凋亡信号通路的多个环节，进一步增强对细胞凋亡的诱导，如增强顺铂对DNA的损伤作用，促进顺铂诱导的线粒体损伤，使更多的细胞色素C释放，激活更多的Caspase-3等凋亡蛋白，从而提高细胞凋亡率，增强抗瘤效果。在影响细胞周期方面，顺铂可能通过干扰DNA的复制和修复过程，使细胞周期阻滞在S期或G2/M期；青蒿琥酯可使细胞周期阻滞在G0/G1期。联合使用时，两者可能通过不同的作用靶点，协同调节细胞周期相关蛋白的表达和活性，使更多的细胞停滞在细胞周期的特定阶段，抑制肿瘤细胞的增殖。在抑制肿瘤血管生成方面，顺铂可能通过抑制肿瘤细胞VEGF的表达和分泌，减少肿瘤血管生成；青蒿琥酯则可以作用于血管内皮细胞，抑制其增殖和迁移能力，还能下调VEGF及其受体的表达。联合使用时，它们可能从多个层面抑制VEGF的表达和功能，如抑制VEGF的合成、阻断VEGF与受体的结合、抑制VEGF下游信号通路的传导等，从而更有效地抑制肿瘤血管生成，切断肿瘤的营养供应，抑制肿瘤的生长和转移。5.2研究的临床应用前景本研究中，青蒿琥酯与顺铂联合用药在小鼠恶性黑色素瘤模型上展现出显著的抗瘤效果，这为其在临床治疗恶性黑色素瘤方面提供了极具潜力的应用前景。从治疗效果角度来看，联合用药组在抑制肿瘤生长方面表现出色。无论是肿瘤体积的增长速度，还是最终的瘤重，联合用药组均显著低于单药组和对照组。在黑色素瘤的临床治疗中，有效抑制肿瘤生长是提高患者生存率和生活质量的关键。目前临床上对于晚期黑色素瘤的治疗效果仍不理想，联合用药的这一优势有可能改变这一现状。例如，对于无法进行手术切除的晚期黑色素瘤患者，青蒿琥酯与顺铂联合使用或许能够更有效地控制肿瘤的进展，延长患者的无进展生存期，为患者争取更多的治疗时间和生存机会。在安全性方面，青蒿琥酯在一定程度上减轻了顺铂的不良反应，提高了小鼠对药物的耐受性。在临床实践中，顺铂的肾毒性、胃肠道反应、神经毒性等副作用常常限制了其使用剂量和疗程，导致治疗效果无法达到预期。而青蒿琥酯与顺铂联合使用，有望在不降低治疗效果的前提下，减轻顺铂的这些不良反应。这意味着患者在接受治疗时，能够更好地耐受药物，减少因不良反应而中断治疗的情况发生，提高治疗的依从性。例如，对于一些身体状况较差、无法承受顺铂高剂量治疗的患者，联合用药可以在保证一定治疗效果的同时，降低药物对身体的损害，使患者能够顺利完成治疗过程。联合用药还可能具有潜在的经济优势。黑色素瘤的治疗，尤其是新型的免疫治疗和靶向治疗，药物价格昂贵，给患者家庭带来了沉重的经济负担。而青蒿琥酯作为一种从天然植物中提取的药物，相对成本较低。如果青蒿琥酯与顺铂联合用药能够在临床治疗中取得良好效果，将为患者提供一种更为经济实惠的治疗选择，有助于提高治疗的可及性，使更多患者受益。综上所述，青蒿琥酯与顺铂联合用药在恶性黑色素瘤的临床治疗中具有广阔的应用前景。未来，通过进一步的临床前研究和临床试验，深入评估其疗效和安全性，有望为黑色素瘤患者提供一种新的、有效的治疗策略，改善患者的预后和生活质量。六、参考文献[1]许鹏飞，焦宇，韦振菁，等。治疗恶性黑色素瘤的靶向药物研究进展[J].广州化工，2013,41(5):26-29.[2]张琳婧，梁羽茜，王媛媛，等。黄芪和天花粉配伍治疗黑色素瘤的文献挖掘[J].中医药学报，2019,47(1):43-46.[3]MadridA,CardileV,GonzálezC,etal.Psoraleaglandulosaasapotentialsourceofanticanceragentsformelanomatreatment[J].IntJMolSci,2015,16(4):7944-7959.[4]StricklandLR,PalHC,ElmetsCA,etal.Targetingdriversofmelanomawithsyntheticsmallmoleculesandphytochemicals[J].CancerLett,2015,359(1):20-35.[5]GirottiMR,LopesF,PreeceN,etal.Paradox-breakingRAFinhibitorsthatalsotargetSRCareeffectiveindrug-resistantBRAFmutantmelanoma[J].CancerCell,2015,27(1):85-96.[6]夏姣娥，曹培国。青蒿琥酯与顺铂联合对小鼠恶性黑色素瘤的抗瘤作用研究[D].中南大学，2008.[7]孙德忠，高天文，王琳，等。青蒿素联合顺铂对人子宫颈癌HeLa细胞株的作用[J].中国皮肤性病学杂志，2013,27(3):222-225.[8]Qing-pingWen,Chun-yanZhao,QianHe,etal.Synergisticantitumoractivityofartemisininandcisplatininhumanovariancancercellsinvitroandinvivo[J].OncolLett,2017,14(3):3453-3459.[9]崔玉环，冯继锋，刘宝瑞，等。青蒿琥酯增强顺铂对人结肠癌细胞株的毒作用及其机制[J].中国新药杂志，2017,26(11):1313-1318.[10]WoerdenbagHJ,SchellensJHM,deVriesEGE,etal.CytotoxicactivityofartemisininanditsderivativesonmurineleukaemiaL1210cells[J].JournalofEthnopharmacology,1993,40(2):117-120.[11]LaiJL,NguyenTTH,ChungJG,etal.Antitumoreffectsofdihydroartemisinin,asemisyntheticderivativeofartemisinin,onhumanovariancancercells[J].CancerChemotherapyandPharmacology,2003,51(5):413-419.[12]EfferthT,LiPA,PaulkeBR,etal.Artemisininforcancertreatment:preclinicalandclinicalevidence[J].InternationalJournalofOncology,2007,30(5):1155-1160.[13]李颖，高宏，刘心，等。青蒿琥酯对K562细胞凋亡及相关基因表达的影响[J].中国药理学通报，2005,21(1):114-117.[14]WangJX,TangW,ShiLP,etal.InvestigationoftheimmunosuppressiveactivityofartemetheronT-cellactivationandproliferation[J].BritishJournalofPharmacology,2007,150(5):652-661.[15]LiuH,TianQ,AiX,etal.DihydroartemisininattenuatesautoimmunethyroiditisbyinhibitingtheCXCR3/PI3K/AKT/NF-κBsignalingpathway[J].Oncotarget,2017,8(70):115028-115040.[16]金慧玲，余其斌，高玉祥。青蒿琥酯外用对银屑病样小鼠模型的影响[J].中国皮肤性病学杂志，2004,18(11):651-653.[17]ZhouWL,WuJM,WuQL,etal.Anovelartemisininderivative,3-(12-beta-artemisininoxy)phenoxylsuccinicacid(SM735),mediatesimmunosuppressiveeffectsinvitroandinvivo[J].ActaPharmacologicaSinica,2005,26(11):1352-1358.[18]HouLF,HeSJ,LiX,etal.OraladministrationofartemisininanalogSM934ameliorateslupussyndromesinMRL/lprmicebyinhibitingTh1andTh17cellresponses[J].Arthritis&Rheumatism,2011,63(8):2445-2455.[19]朱卫星，顾军。青蒿琥酯对狼疮样小鼠肾脏白介素6和转化生长因子β的影响[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志，2003,2(1):25-27.[20]高弼虎，刘盼盼，于铁，等。青蒿鳖甲汤治疗阴虚内热型系统性红斑狼疮疗效及对Th1/Th2平衡的影响[J].现代中西医结合杂志，2017,26(3):322-324.[21]曹向东。青蒿鳖甲汤治疗系统性红斑狼疮疗效及对Th1/Th2平衡的影响[J].中国继续医学教育，2018,10(30):154-156.[22]王泽辉，褚宏飞，朱艳灵，等。黄莺教授治疗火热炽盛型银屑病经验[J].中医临床研究，2011,3(6):95-97.[23]莫正魁，李立，王建忠。青蒿素对小鼠迟发型超敏反应的免疫抑制作用[J].昆明医学院学报，2005,(4):55-59.[24]惠海英，吴娜，孙晶莹，等。双氢青蒿素对UVB照射小鼠皮肤损伤的光保护作用[J].中国皮肤性病学杂志，2017,31(10):1061-1064.[25]惠海英，白静静，孙晶莹，等。双氢青蒿素对UVB诱导的人皮肤HaCaT细胞凋亡的保护作用[J].中国麻风皮肤病杂志，2017,33(10):580-584.[26]ChengC,NgDS,ChanTK,etal.Anti-allergicactionofanti-malarialdrugartesunateinexperimentalmastcell-mediatedanaphylacticmodels[J].Allergy,2013,68(2):195-203.[27]刘畅，张莹莹，王宇，安月鹏。青蒿化光合剂联合湿润烧伤膏治疗日光性皮炎临床研究[J].山东中医杂志，2015,34(11):835-837.[28]马建国。清骨散皮肤科新用[J].山东中医杂志，2006,25(7):496-497.[29]熊运海，冉烈，王玫。藿香与青蒿挥发油及其复合物抑菌活性及化学成分研究[J].食品科学，2010,31(7):135-139.[30]张丽勇。青蒿提取物抗真菌作用初探[J].中外妇儿健康，2011,19(7):215-216.[31]陈德宇，郑久安，黄淑芳。青蒿油搽剂抗真菌作用实验及疗效观察[J].中国皮肤性病学杂志，1990,4(1):18-19.[32]张雄辉，陆皞然。青蒿素类化合物新用途相关专利现状分析[J].中国发明与专利，2018,15(10):6-10.[33]王子见，李怡瑞，吴文成，等。青蒿素及其衍生物的药理学作用研究进展[J].广西医学，2018,40(10):1222-1224.[34]李向阳，朱宇同，王艳芳，等。青蒿油纳米脂质体制剂对痤疮致病菌的抑制作用[J].广州中医药大学学报，2004,21(2):122-124.[35]李婷，胡阳，俞爱华，等。口服青蒿琥酯治疗酒渣鼻31例临床观察[J].中国皮肤性病学杂志，2015,29(3):330-332.[36]李小雯，樊海宁，李梦轩。青蒿琥酯抗病毒作用的研究进展[J].临床医药文献杂志，2018,5(87):190.[37]张芊，王艺萌，姜蔚蔚，等。双氢青蒿素单独和联合甲氨蝶呤在皮肤T细胞淋巴瘤细胞系的抗肿瘤作用[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志，2018,17(2):112-117.[38]江忠勇，周德山。青蒿琥酯抑制人表皮鳞癌细胞A431增殖及机制研究[D].第三军医大学，2010.[39]LuYY,ChenTS,WangXP,etal.Single-cellanalysisofdihydroartemisinin-inducedapoptosisthroughreactiveoxygenspecies-mediatedcaspase-8activationandmitochondrialpathwayinASTC-a-1cellsusingfluorescenceimagingtechniques[J].JournalofBiomedicalOptics,2010,15(4):046028.[40]HwangYP,YunHJ,KimHG,etal.SuppressionofPMA-inducedtumorcellinvasionbydihydroartemisininviainhibitionofPKCalpha/Raf/MAPKsandNF-kappaB/AP-1-dependentmechanisms[J].BiochemicalPharmacology,2010,79(12):1714-1726.[41]李战，农晓琳，李佳荃，等。青蒿琥酯抑制增生性瘢痕成纤维细胞Smad3表达的研究[J].中国美容医学，2014,23(4):295-298.[42]江川，贺光照，冯登超。青蒿琥酯对体外疤痕疙瘩成纤维细胞的抑制作用[J].重庆医科大学学报，2009,34(10):1351-1353.[43]杨今言，林琳。二氢青蒿素对兔耳增生性瘢痕增生的影响研究[J].中国生化药物杂志，2015,35(1):89-90.[2]张琳婧，梁羽茜，王媛媛，等。黄芪和天花粉配伍治疗黑色素瘤的文献挖掘[J].中医药学报，2019,47(1):43-46.[3]MadridA,CardileV,GonzálezC,etal.Psoraleaglandulosaasapotentialsourceofanticanceragentsformelanomatreatment[J].IntJMolSci,2015,16(4):7944-7959.[4]StricklandLR,PalHC,ElmetsCA,etal.Targetingdriversofmelanomawithsyntheticsmallmoleculesandphytochemicals[J].CancerLett,2015,359(1):20-35.[5]GirottiMR,LopesF,PreeceN,etal.Paradox-breakingRAFinhibitorsthatalsotargetSRCareeffectiveindrug-resistantBRAFmutantmelanoma[J].CancerCell,2015,27(1):85-96.[6]夏姣娥，曹培国。青蒿琥酯与顺铂联合对小鼠恶性黑色素瘤的抗瘤作用研究[D].中南大学，2008.[7]孙德忠，高天文，王琳，等。青蒿素联合顺铂对人子宫颈癌HeLa细胞株的作用[J].中国皮肤性病学杂志，2013,27(3):222-225.[8]Qing-pingWen,Chun-yanZhao,QianHe,etal.Synergisticantitumoractivityofartemisininandcisplatininhumanovariancancercellsinvitroandinvivo[J].OncolLett,2017,14(3):3453-3459.[9]崔玉环，冯继锋，刘宝瑞，等。青蒿琥酯增强顺铂对人结肠癌细胞株的毒作用及其机制[J].中国新药杂志，2017,26(11):1313-1318.[10]WoerdenbagHJ,SchellensJHM,deVriesEGE,etal.CytotoxicactivityofartemisininanditsderivativesonmurineleukaemiaL1210cells[J].JournalofEthnopharmacology,1993,40(2):117-120.[11]LaiJL,NguyenTTH,ChungJG,etal.Antitumoreffectsofdihydroartemisinin,asemisyntheticderivativeofartemisinin,onhumanovariancancercells[J].CancerChemotherapyandPharmacology,2003,51(5):413-419.[12]EfferthT,LiPA,PaulkeBR,etal.Artemisininforcancertreatment:preclinicalandclinicalevidence[J].InternationalJournalofOncology,2007,30(5):1155-1160.[13]李颖，高宏，刘心，等。青蒿琥酯对K562细胞凋亡及相关基因表达的影响[J].中国药理学通报，2005,21(1):114-117.[14]WangJX,TangW,ShiLP,etal.InvestigationoftheimmunosuppressiveactivityofartemetheronT-cellactivationandproliferation[J].BritishJournalofPharmacology,2007,150(5):652-661.[15]LiuH,TianQ,AiX,etal.DihydroartemisininattenuatesautoimmunethyroiditisbyinhibitingtheCXCR3/PI3K/AKT/NF-κBsignalingpathway[J].Oncotarget,2017,8(70):115028-115040.[16]金慧玲，余其斌，高玉祥。青蒿琥酯外用对银屑病样小鼠模型的影响[J].中国皮肤性病学杂志，2004,18(11):651-653.[17]ZhouWL,WuJM,WuQL,etal.Anovelartemisininderivative,3-(12-beta-artemisininoxy)phenoxylsuccinicacid(SM735),mediatesimmunosuppressiveeffectsinvitroandinvivo[J].ActaPharmacologicaSinica,2005,26(11):1352-1358.[18]HouLF,HeSJ,LiX,etal.OraladministrationofartemisininanalogSM934ameliorateslupussyndromesinMRL/lprmicebyinhibitingTh1andTh17cellresponses[J].Arthritis&Rheumatism,2011,63(8):2445-2455.[19]朱卫星，顾军。青蒿琥酯对狼疮样小鼠肾脏白介素6和转化生长因子β的影响[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志，2003,2(1):25-27.[20]高弼虎，刘盼盼，于铁，等。青蒿鳖甲汤治疗阴虚内热型系统性红斑狼疮疗效及对Th1/Th2平衡的影响[J].现代中西医结合杂志，2017,26(3):322-324.[21]曹向东。青蒿鳖甲汤治疗系统性红斑狼疮疗效及对Th1/Th2平衡的影响[J].中国继续医学教育，2018,10(30):154-156.[22]王泽辉，褚宏飞，朱艳灵，等。黄莺教授治疗火热炽盛型银屑病经验[J].中医临床研究，2011,3(6):95-97.[23]莫正魁，李立，王建忠。青蒿素对小鼠迟发型超敏反应的免疫抑制作用[J].昆明医学院学报，2005,(4):55-59.[24]惠海英，吴娜，孙晶莹，等。双氢青蒿素对UVB照射小鼠皮肤损伤的光保护作用[J].中国皮肤性病学杂志，2017,31(10):1061-1064.[25]惠海英，白静静，孙晶莹，等。双氢青蒿素对UVB诱导的人皮肤HaCaT细胞凋亡的保护作用[J].中国麻风皮肤病杂志，2017,33(10):580-584.[26]ChengC,NgDS,ChanTK,etal.Anti-allergicactionofanti-malarialdrugartesunateinexperimentalmastcell-mediatedanaphylacticmodels[J].Allergy,2013,68(2):195-203.[27]刘畅，张莹莹，王宇，安月鹏。青蒿化光合剂联合湿润烧伤膏治疗日光性皮炎临床研究[J].山东中医杂志，2015,34(11):835-837.[28]马建国。清骨散皮肤科新用[J].山东中医杂志，2006,25(7):496-497.[29]熊运海，冉烈，王玫。藿香与青蒿挥发油及其复合物抑菌活性及化学成分研究[J].食品科学，2010,31(7):135-139.[30]张丽勇。青蒿提取物抗真菌作用初探[J].中外妇儿健康，2011,19(7):215-216.[31]陈德宇，郑久安，黄淑芳。青蒿油搽剂抗真菌作用实验及疗效观察[J].中国皮肤性病学杂志，1990,4(1):18-19.[32]张雄辉，陆皞然。青蒿素类化合物新用途相关专利现状分析[J].中国发明与专利，2018,15(10):6-10.[33]王子见，李怡瑞，吴文成，等。青蒿素及其衍生物的药理学作用研究进展[J].广西医学，2018,40(10):1222-1224.[34]李向阳，朱宇同，王艳芳，等。青蒿油纳米脂质体制剂对痤疮致病菌的抑制作用[J].广州中医药大学学报，2004,21(2):122-124.[35]李婷，胡阳，俞爱华，等。口服青蒿琥酯治疗酒渣鼻31例临床观察[J].中国皮肤性病学杂志，2015,29(3):330-332.[36]李小雯，樊海宁，李梦轩。青蒿琥酯抗病毒作用的研究进展[J].临床医药文献杂志，2018,5(87):190.[37]张芊，王艺萌，姜蔚蔚，等。双氢青蒿素单独和联合甲氨蝶呤在皮肤T细胞淋巴瘤细胞系的抗肿瘤作用[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志，2018,17(2):112-117.[38]江忠勇，周德山。青蒿琥酯抑制人表皮鳞癌细胞A431增殖及机制研究[D].第三军医大学，2010.[39]LuYY,ChenTS,WangXP,etal.Single-cellanalysisofdihydroartemisinin-inducedapoptosisthroughreactiveoxygenspecies-mediatedcaspase-8activationandmitochondrialpathwayinASTC-a-1cellsusingfluorescenceimagingtechniques[J].JournalofBiomedicalOptics,2010,15(4):046028.[40]HwangYP,YunHJ,KimHG,etal.SuppressionofPMA-inducedtumorcellinvasionbydihydroartemisininviainhibitionofPKC