CN114354936B 一种用于筛选西妥昔单抗原发耐药生物标志物的方法、用该方法筛选的生物标志物及其用途 （上海交通大学医学院附属第九人民医院）

Yao,Yanlietal.Clinicalutilityofarchitecturechangesunderlyi一种用于筛选西妥昔单抗原发耐药生物标途本申请涉及一种用于筛选头颈鳞癌西妥昔癌患者肿瘤组织来源的小鼠异种移植瘤模型选择患者对应的PDX模型入组开展PDX模型临床头颈鳞癌西妥昔单抗原发耐药的生物标志物是预测头颈鳞癌患者对西妥昔单抗药效非常可靠21.一种利用患者肿瘤组织来源的异种移植瘤模型(PDX模型)临床替代性试验筛选头颈(4)开展西妥昔单抗PDX模型临床替代性试验：待头颈鳞癌PDX模型肿瘤体积达到一定瘤完全消退(mCR)，肿瘤体积至少减少402)肿瘤部分消退(mPR)，肿瘤体积减少20%~403)疾病进展(mPD)，肿瘤体积至少增加304)疾病稳定(mSD(6)借助模型临床替代性试验筛选原发耐药候选药效标志物：对所述原发耐药模型及(8)利用独立PDX模型临床替代性试验验证药效标志物：利用独立PDX模型临床替代性性生物标志物绘制受试者工作特征曲线(ReceiverOperatingCharacteristicCurve，终确定所述第一和第二队列中发现的所述头颈鳞癌西妥昔单抗原发耐药生物录元件结合蛋白KLF9(KruppelLikeFactor9)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶PARP3(Poly(ADP-Ribose)PolymeraseFamilyMember3)、细胞表面跨膜蛋白CD34家族的成员PODXL2转运辅助蛋白HEPHL1(HephaestinLike1)和神经递质转运体SLC6A(Solutecarrier34.一种试剂盒在制备头颈鳞癌患者西妥昔单抗原发耐药的预测制剂中的应用，其中，5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述试4头颈鳞癌唯一的靶向治疗策略。西妥昔单抗是一种阻断EGFR的嵌合体IgG1的单克隆抗体，与内源性EGFR配体竞争结合到易接近的细胞外结构域，随后阻断受体依赖的信号转导通单抗在头颈鳞癌治疗中的治疗疗效较低，单药治疗组的客观缓解率为13联合化疗组为5[0007]在结直肠癌中，一项来自7个欧洲国家的11个中心收集了自2001年至2008年间经进行检测。结果显示，KRAS突变型患者相比于野生型患者对西妥昔单抗的有效率更低建议KRAS野生型晚期转移性结直肠癌患者一线治疗选择西妥昔单抗联[0008]西妥昔单抗推荐适应症除转移性结直肠癌外，主要为一线治疗复发/转移性头颈在头颈鳞癌中突变频率极低(中国人群低于2％)，因此KRAS突变在头颈鳞癌中无法作为原至2016年间59例接受姑息治疗的头颈鳞癌患者进行了筛查，发现西妥昔单抗耐药性与年至2015年间使用西妥昔单抗治疗的118例头颈鳞癌患者的肿瘤标本进行PIK3CA和H/N/治疗效果与头颈鳞癌患者PIK3CA和KRAS/HRAS基因突变无关，且表皮生长因子受体EGFR的6[0010]目前还没有借助异种移植瘤模型临床替代性试验挖掘并验证的用于头颈鳞癌西利用PDX模型临床替代性试验筛选头颈鳞癌西妥昔单抗原发耐药生物标志物的方法。基于[0016](3)头颈鳞癌PDX模型第一队列(在下文中也称为PDX模型发现队列)的构建：依托如100-200mm3后，将每个PDX病例随机分为对照组和西妥昔单抗单药治疗组，开始药物治~403)疾病进展(mPD)，肿瘤体积至少增加304)疾病稳定(mSD)，肿瘤体积变化在[0019](6)借助模型临床替代性试验筛选原发耐药候选药效标志物：对所述原发耐药模7头颈鳞癌PDX模型生物样本库，根据对应患者的临床信息，再次随机筛选若干例头颈鳞癌[0021](8)利用独立PDX模型临床替代性试验验证药效标志物：利用独立PDX模型临床替预测性生物标志物绘制受试者工作特征曲线(ReceiverOperatingCharacteristic蛋白KLF9(KruppelLikeFactor9)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶PARP3(Poly(ADP-Ribose)PolymeraseFamilyMember3)、细胞表面跨膜蛋白CD34家族的成员PODXL2(PodocalyxinHEPHL1(HephaestinLike1)和神经递质转运体SLC6A(Solutec结合蛋白KLF9(KruppelLikeFactor9)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶PARP3(Poly(ADP-Ribose)PolymeraseFamilyMember3)和细胞表面跨膜蛋白CD34家族的成员PODXL2(PodocalyxinLike2)的高表达事件，以及细胞周期依赖性激酶CDK1(CRegulator)、膜铁转运辅助蛋白HEPHL1(HephaestinLike1)和神经递质转运体SLC6A(Solutecarrierfamily6)的基因扩增事件可作为西妥昔单抗原发耐药的SLC6A在制备头颈鳞癌患者临床应用西妥昔单抗疗少包括基因表达检测探针和/或拷贝数检测探针，其中，所述基因表达检测探针包括针对8剂中的一种或多种的试剂盒在制备头颈鳞癌患者西妥昔单抗原发耐药的预测制剂中的应[0034]本发明基于患者肿瘤组织来源的小鼠移植瘤PDX模型进行相关研究，可根据试验了大量临床患者用药取材过程中伦理审批的周期。总体而言，利用PDX模型临床替代性试[0035]本发明提供的头颈鳞癌西妥昔单抗原发耐药的生物标志物，其在PDX模型发现队9[0037]图1：本发明实施例1提供的涵盖49例PDX模型的西妥昔单抗临床替代性试验(PDX模型发现队列)中PDX模型对西妥昔单抗的药物响应情[0038]图2：本发明实施例1提供的1例西妥昔单抗敏感患者的PDX模型与临床疗效的比[0042]图6：本发明实施例3提供的涵盖61例PDX模型的西妥昔单抗临床替代性试验(PDX模型验证队列)中PDX模型对西妥昔单抗的药物响应情[0044]图8：本发明实施例3提供的受试者工作特征曲线(ROC)评价SIX2、KLF9、PARP3、PODXL2甄别西妥昔单抗原发耐药和敏感样本的能力图示。其中图A表示发现队列的转录组和方法等均按照常规或者制造厂商所建议的划生育科学研究所实验动物经营部(动物许可证号：SCXK(沪)2018-0006)。小鼠饲养符合每个患者组织接种3-5只小鼠。建模1-2周后开始追踪PDX模型生长轨迹，当肿瘤体积超过天内复发且未达到mCR标准的模型进入获得性耐药研究中。待复发模型肿瘤体积达到100-表现为mPR或mCR的模型定义为可逆的药物耐受持久性(drug-tolerantpersister,DTP)状展(mPD)定义为原发耐药(n＝21)占比42.86肿瘤完全缓解(mCR)且90天内未复发定义为敏感(n＝9)占比18.37给药后肿瘤控制(mCR+mPR+mSD)并在90天内复发则再次给药，再次给药后肿瘤疾病进展(mPD)定义为继发耐药(n＝8)占比16.33再次给药后肿瘤mPR或mCR的模型定义为可逆的药物耐受持久性状态(n＝3)占比6.12另有4例组由于组内差异与西妥昔单抗临床应用中13％的应答率相吻合，反映出该PDX模型治疗队列能准确模拟临[0061]本发明中PDX模型对西妥昔单抗的药效与患者临床使用西妥昔单抗的药效相吻图3所示为一例西妥昔单抗相对不敏感患者，其对应PDX模型也表现为对西妥昔单抗不敏[0063]本发明在PDX模型发现队列中收集的样本均从小鼠身上获取后进行液氮速冻保[0064]全外显子测序：液氮速冻的患者肿瘤及PDX样本使用IlluminaNovaseq6000平台鼠源性基因，通过Burrows-WheelerAligner(BWA)将人类与小鼠杂交基因组(hs37d5andmm10)映射到测序数据中，使用SAMtools、GenomeAnalysisToolkit(GATK-UnifiedGenotyper)与FreeBayes(GarrisonandMarth)过滤人源[0065]RNA测序：使用IlluminaHiseq平台进行RNA建库，通过Hisat2v2.0.5将测序reads映射到人类及小鼠基因组中并使用Cufflinksv2.2.1组装转录本，估计转录本的丰[0066]本发明通过分析敏感组及原发耐药组PDX样本的突变基因、基因拷贝数及表达差差异均有统计学意义(P<0.05)的基因突变和拷贝数变异显示于图4中，并且可发现敏可能是潜在的药效标志物。此外图5展示了敏感模型和耐药模型存在着显著差异的基因表[0068]本发明为了验证PDX模型发现队列中筛选出的西妥昔单抗耐药相关药效生物标志[0069]本发明按照前述PDX模型接种及传代方法，构建多例稳定传代并具备完整组织学[0071]本发明收取PDX模型验证队列的给药前样本对潜在生物标志物进行qRT-PCR检测，并利用受试者工作曲线(ReceiverOperatingCharacteristicCurve,ROC)判断各标[0074]用于检测头颈鳞癌西妥昔单抗原发耐药性的试剂盒，该试剂盒由DNA提取试剂、[0075]其中DNA提取试剂(Thermofisher，10503027)、RNA提取试剂(Thermofisher，合进行TaqManprobe-based拷贝数变异检测及qRT-PC[0080](1)将不同样品DNA(从头颈鳞癌肿瘤组织及癌旁组织中提取的DNA)或cDNA(从头颈鳞癌肿瘤组织及癌旁组织中提取的RNA，逆转录成cDNA)约10-50ng加入至各PCR反应管[0088]将目标基因对应的质粒作为标准品进行梯度稀释，PCR反应中加入五个浓度梯度