CN114507700B Gh10木聚糖酶、gh62阿拉伯呋喃糖苷酶、研磨方法以及其他应用 （诺维信公司）

PCT/CN2016/1072812016.11.201780040290.42017.11.24US2009220480A1,2009.09.032所述具有GH62阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽选自a)与SEQIDNO:1的成熟多肽或SEQIDNO:3的成熟多肽具有100％序列同一性的多b)由与SEQIDNO:2的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有100％序列同一性的多核所述具有GH10木聚糖酶活性的多肽选自b)由与SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有100％序列同一性的多核2.权利要求1的酶组合物，其中所述具有GH62阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽衍生自曲4.权利要求1-3中任一项的酶组合物，其中所述具有GH10木聚糖酶活性的多肽衍生自a)与SEQIDNO:1的成熟多肽或SEQIDNO:3的成熟多肽具有100％序列同一性的多b)由与SEQIDNO:2的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有100％序列同一性的多核b)由与SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有100％序列同一性的多核3本发明还涉及包含一种或多种适于本发明的方法的酶活性的酶组方法使用蛋白酶以在玉米湿磨过程中显著减少总的处理时间并消除了对作为加工剂的二4[0014]WO2002/002644公开了一种洗涤自研磨方法的淀粉谷蛋白分离步骤获得的淀粉性并促进果实从束秆中剥离。将棕榈小果实排放到通常称为消化器(digester)的容器中，[0017]WO2012/011130公开了用于棕榈油提取的方法中的酶组合物(具有外纤维素水糖苷酶活性的多肽和/或具有GH10木聚糖酶活性的多肽的存在下处理所述浸泡的籽粒或所[0023]在一个实施方案中，本发明提供了上述方法，其中在0.01％-1优选0.05％-[0024]在一个实施方案中，本发明提供了上述方法，其中所述作物籽粒来自玉米(玉蜀多种水解酶在生物体例如里氏木霉(Trichoderma5[0031]a)与SEQIDNO:1的成熟多肽或SEQIDNO:3的成熟多肽具有至少85例如至少多肽衍生自芽孢杆菌(Bacillus)属的菌株，例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的菌6[0051]在一个实施方案中，本发明的具有GH10木聚糖酶活性的多肽衍生自曲霉属的菌改进来自玉米籽粒的总淀粉产率和/或谷蛋白产率，或用于在如前述实施方案的任一项中聚糖酶和/或所述GH30木聚糖酶在前述实施方案的积200μl中100mM乙酸钠pH5的5mg中等粘度小麦阿拉伯木聚糖(MegazymeInternational7HPX-87H柱层析(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)进行阿拉伯糖分析来测[0062]如本文所定义的草料还包括粗饲料。草芸苔(brassica)(例如羽衣甘蓝(kale)、油菜籽(rapeseed)(芥花(canola))、大头菜(例如百慕大草(Bermudagrass)、雀麦(brome)、假燕麦草(falseoatgrass)、羊茅科植物的茎和叶；以及用于动物或人类消费或来自燃料生产或其他行业的谷物精炼的级始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤8催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内切水解。木聚糖酶活性可以在37℃下在0.01%TRITON@X-100和200mM磷酸钠(pH6)中用0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物来测定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃、pH6下，在200mM磷酸钠(pH6)中从作为底物的萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从而从链的还原性末端(纤维二糖水解酶I)或非还原性末端(纤维二糖水解酶II)释放纤维二糖(Teeri,1997,TrendsinBiotechnologyetal.,1988,Eur.J.Biochem.170:575-581所描述的程序来测定纤维二糖水总纤维素水解活性测定是使用沃特曼№1滤纸作为底物的滤纸测定。该测定法是由国际纯粹与应用化学联合会(InternationalUnionofPureandAppliedChemistry,IUPAC)建立的(Ghose,1987,PureAppl.C或多种纤维素水解酶对纤维素材料的水解过程中产生/释放的糖的增加来测定纤维素水解析(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)进行糖9地衣淀粉中的1,4-β-D-糖苷键和混合β-1,3-1,4葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖以及包含纤维素组分的其他植物材料中的β-1,4键的内切水解。可以通过测量底物粘度的降低或通过还原糖测定所确定的还原性末端的增加来确定内切葡聚糖酶活性(Zhangetal.,2006,BiotechnologyAdvances24:452-481)。还可以根据Ghose,1987,Pureand[0093]在一方面，GH62阿拉伯呋喃糖苷酶的成熟多肽编码序列是SEQIDNO:2的核苷酸[0094]在另一方面，GH10木聚糖酶的成熟多肽编码序列是SEQIDNO:5的核苷酸58至含一个或多个控制序列。[0098]序列同一性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关联性通过参数[0099]出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwGenet.16:276-277)(优选3.0.0版或更新版本)的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(NeedlemanandWunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来确定两个氨基酸序[0101]出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwGenet.16:276-277)(优选3.0.0版或更新版本)的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(NeedlemanandWunsch,1970,同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的Puchard,2006,JournaloftheScienceofFoodandAgriculture86(11):1636-1647；SpanikovaandBiely,2006,FEBSLetters580BiochemicalJournal321:37[0110]总木聚糖降解活性可以通过测定由不同类型的木聚糖(包括例如燕麦(oattestingofmethodsforassayofxylanaseactivity,JournalofBiotechnology23(3):257-270中。木聚糖酶活性还可以在37℃下在0.01％TRITON@X-100和200mM磷酸钠[0111]木聚糖降解活性可以是通过测量由一种或多种木聚糖降解酶在以下典型条件下如Lever,1972,Anal.Biochem.47:273-279所述使用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定进行糖使底物分解并从中果皮释放棕榈油的方法。消化可以在消化罐和/或配有挡板的预煮罐中[0125]研磨籽粒，以便打开结构并且允许进一步加工并且或获得了更高的产率和/或使用更少的加工时间。另一种优势可以是可以减少或甚至完全除去需要使用的化学品(例如SO2和Na[0132]更特别地，将玉米籽粒以及其他作物籽粒降解为适于将淀粉转化为单糖和寡糖、加例如0.1％二氧化硫(SO2)和/或NaHSO3以防止细菌在温暖环境中过多生长。随着玉米膨[0140]在一个实施方案中，在浸泡过程中可以添加0.01％-1[0144]将来自纤维洗涤步骤的淀粉-谷蛋白悬浮液(称作研磨淀粉)分离成淀粉和谷蛋[0156]本发明的一个实施方案中，包含棕榈油的底物在与酶组合物接触之前进行灭转搅拌棒(rotarybeaterbar)的固定滚筒的机械化系统中进行，所述旋转搅拌棒将果实[0161]下文中公开涉及具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的GH62多肽的本发明的方面的优选氨基酸变化可以是次要性质[0170]具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽可以获自任何属的微生物。出于本发明的目clavatus)或温特曲霉(Aspergilluswentii)或来自踝节菌属(Talaromyces)或来自嗜松踝节菌(Talaromycespin孢链霉菌(Streptomycesnitrosporeus)或北疆链霉菌(Streptomycesbeijiangensis)(Streptosporangiaceae)，或来自链孢子囊菌(Streptosporangium)属或来自链孢子囊菌胞培养物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)方区域研究中心农业研究服务专利培养物保藏中心(AgriculturalResearchService栖息地分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一种微生物隆多核苷酸(参见例如Sambrook氨基酸变化可以是次要性质[0189]在另一个实施方案中，多肽是Talaromycesleycettanus多肽，例如获自Talaromycesleycettanus菌株CBS398.胞培养物保藏中心(DSMZ)、荷兰微生物菌种保藏中心(CBS)和北方区域研究中心农业研究栖息地分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一种微生物隆多核苷酸(参见例如Sambrook[0196]GH30多肽是指具有酶活性的多肽，该多肽在糖类活性酶(CAZymes)数据库氨基酸变化可以是次要性质胞培养物保藏中心(DSMZ)、荷兰微生物菌种保藏中心(CBS)和北方区域研究中心农业研究栖息地分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一种微生物隆多核苷酸(参见例如Sambrook和/或金小孢子菌属(Chrysosporium)的菌株，例如勒克瑙金小孢子菌(Chrysosporium苷酶融合蛋白(WO2008/057637)和橙色嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)GH61A多肽(WO2005/074656)的里氏木霉纤维素含具有纤维素水解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO2005/074656)和米曲霉β-葡一步包含具有纤维素水解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO2005/074656中的序列号2)和烟曲霉(Aspergillusfumigatus)β-葡糖苷酶(一步包含WO2011/041397中公开的具有纤维素水解增强活性的埃默森青霉(Penicillium[0217]在实施方案中，纤维素水解组合物包含含有囊状长毛盘菌(Trichophaeasaccata)GH10木聚糖酶(WO2011/057083)和埃默森踝节菌(Talaromycesemersonii)β-木糖苷酶的里氏木霉纤维素酶制剂。[0219]本发明还提供了由GH62阿拉伯呋喃糖苷酶、GH10木聚糖酶和/或GH30木聚糖酶构1997/05245、WO1998/54980、WO1998/55599、W[0237]GH62阿拉伯呋喃糖苷酶A：衍生自黑曲霉的GH62阿拉伯呋喃糖苷酶(SEQIDNO:[0238]GH62阿拉伯呋喃糖苷酶B：衍生自黑曲霉的GH62阿拉伯呋喃糖苷酶(SEQIDNO:从分离自爱尔兰的黑曲霉菌株分离的基因组DNA中PCR扩增具有SEQIDNO:2的阿拉伯呋喃糖苷酶编码基因。将PCR扩增产物克隆到已经用限制酶BamHI和XhoI消化的曲霉表达载体pMStr57(WO04/032648)述于Christensenetal.,1988,Biotechnology6,1419-1422和WO04/032648的方法将表板中在30℃下在YPG培养基(WO05/066338)中培养4天并通过SDS监测阿拉伯呋喃糖[0245]为了更大规模生产重组阿拉伯呋喃糖苷酶，将选择的转化体在含有150mlDAP-4C-1培养基(WO12/103350)的500ml带挡板的烧瓶中培养。将培养物在旋转台上以150RPM[0247]将经过滤的样品的pH调节至约pH7.5并加入1.8M硫酸铵。将样品施加至AktaExplorer上的5mlHiTrapTMPhenyl(HS)柱。在上样之前，已将柱在5个柱体积(CV)的5[0248]GH62阿拉伯呋喃糖苷酶编码序列和GH62阿拉伯呋喃糖苷酶的全长氨基酸序列分组DNA提取试剂盒(BiospinFungusGenomicDNAExtractionKit)(BioerTechnology[0253]基于来自公共数据库的DNA信息，设计如下所示的寡核苷酸引物以扩增黑曲霉GH10木聚糖酶的编码序列。GH10木聚糖酶编码序列和全长氨基酸序列显示为SEQIDNO:5ACACAACTGGGGATCCACCatggttcagatcaaggtagctCCCTCTAGATCTCGAGctagagagcatttgc表示作为翻译过程的起始的Kozark序列。[0256]在实施例1中制备基因组DNA。PhusionTM高保真DNA聚合酶(PhusionTMHigh-体pCaHj505中。表达载体pCaHj505含有衍生自米曲霉的TAKA-淀粉酶启动子和黑曲霉葡糖1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，并使用illustraGFXPCRDNA和凝胶条带纯化试剂盒(Gel[0258]通过使用ILLUSTRATMGFXTMPCRDNA和凝胶条带纯化试剂盒从溶液中纯化PCR产[0259]然后通过使用FusionTMDry-downPCR克隆[0260]所有5μl连接溶液用于转化大肠杆菌TOP10感受态细胞(TIANGENBiotech[0261]挑取2个菌落以使用3730XLDNA分析仪(AppliedBiosystemsInc,FosterCity,CA,USA)测序。确认序列后，接种具有正确插入的菌落用于使用SpinMiniprep试剂盒(QIAGENGmbH，Hilden，Germany)通过遵循制造商的说明进行质粒DNA提[0263]根据Christensenetal.,1988,Bio/Technology6:1419-1422的方法制备米曲30℃,150rpm温育。温育3天后，在NuPAGENovex4-12％Bis-Tris凝胶w/MES(Invitrogen用InstantBlue(ExpedeonLtd.,BabrahamCambridge,UK)染色所得的凝胶。培养物的SDS概况(profile)显示所有4个转化体均具有35kDa处的蛋白质条带。将每个基因具[0265]2个斜面的表达菌株O34EQ8用于接种12个2升的烧瓶，每个烧瓶含有400mlDap4C约52℃)下和在1至4小时之间的时间段内温育湿纤维样品，所述湿纤维样品在纤维压制后从湿磨厂获得并在乳酸缓冲液中重悬至含有5％干固体纤维(其等于来自100克玉米干物质GH10木聚糖酶A和来自Celluclast的剩余80％组成。用于比较，包括仅含有Celluclast和淀粉和10.44％残余蛋白质的玉米纤维作为底物。对以下指定剂量从玉米纤维中释放的淀GH62阿拉伯呋喃糖苷酶B可以显著提高玉米湿磨方法中淀粉