CN114594248B 一种基于外力调控的单分子动态检测方法和系统 （上海交通大学）

bindingkineticsforultrasensibiomarkerdetection.PNAS.e2120379119.一种基于外力调控的单分子动态检测方法本发明公开了一种基于外力调控的单分子成像系统获得单分子成像信息并分析所述目标2其中，所述捕获探针的末端与目标分子的头部互补，所述合物与目标分子结合后，在所述外力调控模块驱动下被牵引到检测探针或捕获探针附近，所述外力调控模块施加的外力范围在0.01-1003.如权利要求2所述的单分子动态检测方法，其特征在于，电场调控使用电化学工作5.如权利要求2所述的单分子动态检测9.如权利要求1所述的单分子动态检测方法，其315.如权利要求10所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述棱镜耦合型SPRi为17.如权利要求16所述的单分子动态检测方法，其特征在于，当所述目标分子为核酸或小分子时，所述捕获探针与目标分子的结合常数kon≥1010M-1s-1，解离常数koff≤21.如权利要求20所述的单分子动态检测方法，其特征在于，所述检测腔室为PDMS腔23.如权利要求22所述的单分子动态检测方424.如权利要求23所述的单分子动态检测方法，25.如权利要求20所述的单分子动态检测方法，其特26.如权利要求20所述的单分子动态检27.如权利要求20所述的单分子动态检28.如权利要求27所述的单分子动态检测方29.如权利要求28所述的单分子动态检测方法，30.如权利要求20所述的单分子动态检测方法，其32.如权利要求31所述的单分子动态检测合物和所述目标分子前，先加入PBS缓冲液或SSC缓冲液或含300mMNaCl的Tris-HCL缓冲33.如权利要求32所述的单分子动态检测方法，其特34.如权利要求31所述的单分子动态检测方并分析所述目标分子的动态的帧率为16.7或35.如权利要求31所述的单分子动态检测方法，其36.如权利要求31所述的单分子动态结合时间分布进行单指数拟合所得的估算值，通过origin-指数拟合-ExpGo1模型拟合而538.如权利要求37所述的单分子动态检测39.如权利要求37所述的单分子动态检测43.如权利要求42所述的单分子动态检44.如权利要求42所述的单分子动态检测方45.如权利要求42所述的单分子动态检测方法，（ii）如权利要求1~47任一项所述的单分子动态检测方法中所定义的检测探针或捕获49.如权利要求48所述的系统，其特征在于，所述系统还包括如权利要求分子动态检测方法中所定义的单分子成像系统和/或所定义的外力6测和治疗评估中发挥着重要作用。目前临床中80％以上的疾病诊断都依靠体外诊断技术。分子水平(<pM)的超灵敏生物传感器具有重大意义。单分子阵列SiMoA和单分子计数SMC是SMC的检测通量不足，对光学系统和环境稳定性要求严苛，且两项技术的检测时间普遍过点读出检测(Endpointreadoutassay)，这带来了浓度限制(concentrationlimit)和热分析免疫检测的耗时过长。基于泊松平衡的单分子识别技术SiMREPS作为一种动态检测技7待检测分子抵达传感器表面在低浓度下耗时更久(远大于60min，ELISA中为最可能低的检8[0017]在一些优选的实施例中，所述单分子成像系统包括SPRi、TIRFM、暗场成像和[0018]较佳地，所述SPRi的结构包括物镜耦合型SPRi和棱镜耦合型SPRi，物镜耦合型SPRi优选物镜式SPRM，例如全内反射显微镜改建的物镜式SPRM，棱镜耦合型SPRi例如Kretschmann棱镜耦合结构；和/或，所述SPRi的光源包括SLED光源或600-800nm的激光光[0023]生物小分子的化学探针的原理与对miRNA等核酸类目标分子并无本质区别，如对9[0030]用生物素-亲和素系统制备抗体包被的纳米颗粒例如金纳米颗粒和或磁纳米颗[0033](a)将制备好的检测芯片置于所述单分子成像系统的观测位置，往检测腔室中加[0037]在一些更优选的实施例中，当所述外力调控模块施加的外力为电场力时，施加-0.6v-+1.0v例如-0.4V-+0.8V的电压；较佳地，先使用正电场例如0-0.8V(不含0)优选+膦盐酸盐TCEP和二硫苏糖醇DTT，其中后者在运用中需要葡聚糖凝胶柱(比如NAP-25)进行发明的第一方面所定义的单分子成像系统和/或如本发明的第一方面所定义的外力调控模[0051]本发明的第三方面提供一种如本发明第二方面所述的系统在检测单分子动态中[0056]2.通过外力调控解决了动态检测方案中目标分子例如抗体分子不具有普适性的[0059]图1为基于Kretschmann棱镜耦合结构的表面等离子体共振成像SPRi平台改建的[0060]图2为基于蒙特卡洛仿真得[0064]图6显示了本发明的工作流程和miRNA的浓度响应曲线：a.基于电场力调控下[0066]现有单分子动态分析技术受限于抗体的筛选不能成为一种通用的检测技术去取代终点检测，同时经过复杂设计和筛选的抗体的弱亲和力进一步加剧了浓度限制的问题，同大小和方向的外力，借助外力对纳米颗粒的调控，对受配体结合检测(ligandbinding案的核心原理在于运用外力去调控与纳米颗粒结合的目标分子与芯片表面的受体结合解[0078]2)根据上述仿真结果，本发明使用纳米颗粒作为报告分子(reportingagent)和操纵分子(manipulatingagent)构建类似酶联免疫吸附ELISA的夹心结构，优化施加外力和检测探针分别结合于目标分子的不同位点，如捕获探针和检测探针分别结合在多肽的N[0083]3)本发明提出的表面等离子共振成像(Surfaceplasmonresonanceimaging，型SPRi能实时检测到金纳米颗粒(粒径≥30nm)和磁纳米颗粒(超顺磁颗粒内核，外壳二氧了外力调控的单分子动态检测，对25个碱基配对长度的核酸目标分子和检测探针施加-颗粒绘制的浓度响应曲线图证明，5-500s(优选25-250s)范围内的结合时间更倾向于是外[0092]8)本发明不同于SiMoA和SMC的一大特点是低成本和快速高通量地实现超灵敏检0.0002s-1；解离平衡常数KD≤0.2fM；标准情况下的分子结合自由能(standardfree化学工作站为检测体系提供电场力。目标核酸与检测探针的碱基互补链长为25basepair观察视野为512×512pixels(fullfieldofview:33.28×33.28μm2)。采用micro[0099](3)用盐老化法制备核酸包被的金纳米颗粒。将10巯基功能化检测探针(与目标核酸的另一端的25bp特异性结合)在50mM的氯化钠NaCl溶液粒表面已通过盐老化法连接上巯基功能化的25bp检测探针和含有目标核酸的样品溶液1μ标核酸和纳米颗粒的扩散，后对颗粒施加向上的斥力10min，调整分子的结合时间，以[0103]实施例1中使用高分辨率的表面等离子共振显微镜SPRM作为单分子成像平台进行此又称目标核酸)与检测探针的碱基互补链长为25basepair(以下简称bp，互补链长可以为12～50bp或更长)的目标核酸的外力调控动态分析核酸检[0104](1)在光学平台上基于Kretschmann棱镜耦合结构的表面等离子体共振成像SPRi采购自Thorlabs和大恒光电，气浮光学平台来自麓邦技术(LBTEK)。选用放大倍数2-12倍溶液还原捕获探针内二硫键1h，紧接着在PDMS与金片构成的检测腔室内加入浓度为1μM巯基聚乙二醇的孵育30s以钝化金表面，用1×PBS清洗三遍后加入含有浓度为50nM的捕获探针(与目标核酸的互补长度为25bp的锁核酸单链，其中锁核酸占整体链段的10-50优选500mM-1M的NaCl缓冲液中依然×SSC缓冲液，然后缓慢通入混有纳米颗粒和目标分子的样品溶液，其中，颗粒浓度为[0108](5)样品检测，优选地，先对带负电的金纳米颗粒施加向下的吸引力15min(正电[0110](7)对特异性吸附的结合和解离事件进行累积统计以得到动态分析结果，结合解离事件的总数和结合时间(该结合时间为对总体结合时间分布进行单指数拟合所得的估算[0112]微小核酸miRNA作为肿瘤早筛的一项生物标志物具有广阔的应用前景，本实例选[0113](1)在光学平台上基于Kretschmann棱镜耦合结构的表面等离子体共振成像SPRi)。采用micromanager控制CCD相机(Ph径0.2mm的打孔器在固化的PDMS上制造出检测腔室)固定在金片表面并用导电银胶将导线选的浓度为5μM)，紧接着在PDMS与金片构成的检测腔室内加入浓度为1μM巯基聚乙二醇的孵育30s以钝化金表面，用1×PBS清洗三遍后加入含有浓度为10-500nM(优选50nM)的捕获探针(与目标miRNA的互补长度为12bp的锁核酸单链，插入整体链段的10-50％的锁核酸分[0115](3)用生物素-亲和素系统(biotin-streptavidinsystem，BAS)制备核酸包被的+0.4V)，加速目标核酸和纳米颗粒的扩散，后对颗粒施加向上的斥力15min(负电场，-25-250s的时间窗口内浓度标准曲线有着较好的线性拟合优度R2＝0.98(图5的a)，图5的b[0121]为了证明本发明具有快速超灵敏检测核酸的能力，本实例选取两种癌症相关[0122](1)在光学平台上基于Kretschmann棱镜耦合结构的表面等离子体共振成像SPRim2除去表面颗粒杂质同时进一步提升金膜平整度；之后把可重复使用的硅基细胞培养板1μM-50μM的TCEP(三羧乙基膦)溶液还原捕获探针内二硫键1h(TCEP物质的量需要在DNA物[0124](3)用生物素-亲和素系统(biotin-streptavidinsystem，BAS)制备核酸包被的+0.4V)，加速目标核酸和纳米颗粒的扩散，后对颗粒施加向上的斥力15min(负电场，-离事件的mean+3std(n＝3)作为基线，计算出两种目标核酸的检测限(limitof[0131](1)在光学平台上基于Kretschmann棱镜耦合结构的表面等离子体共振成像SPRi的强度在140mA，功率为2mW，观察视野为2048×2048pixels(fieldofview:1.33×)。采用micromanager控制CCD相机(PhotometricsPrime)记录SPRi的成像信号。除去表面颗粒杂质同时进一步提升金膜平整度；之后把可重复使用的硅基细胞培养板1μM-50μM的TCEP(三羧乙基膦)溶液还原捕获探针内二硫键1h(本发明中，TCEP物质的量需片构成的检测腔室内加入浓度比例为50:1～500:1(优选100:1)的巯基聚乙二醇甲氧基端修饰了生物素的捕获抗体(多克隆抗体clone12F4，特异性结合Aβ1-42的C-terminus，通道先往检测腔室内注入内含浓度为300mM的NaCl的Tris-HCL缓冲液，然后缓慢通入混有+0.4V)，加速目标蛋白和纳米颗粒的扩散，后对颗粒施加向上的斥力15min(负电场，-[0137](7)对特异性吸附的结合和解离事件进行累积统计以得到动态分析结果(图7的亲和力较强的抗原抗体的结合难以实现满意的调控，后续选用更大的外力对颗粒进行调[0140](1)在光学平台上基于Kretschmann棱镜耦合结构的表面等离子体共振成像SPRi强度在140mA，功率为2mW，观察视野为2048×2048pixels(fieldofview:3.325×3.325mm2除去表面颗粒杂质同时进一步提升金膜平整度；之后把可重复使用的硅基细胞培养板捕获探针内二硫键1h(TCEP物质的量需要在DNA物质的量的100倍或以上，优选的浓度为5μ1)的巯基聚乙二醇甲氧基(HS-mPEG，Mw＝500Da)和巯基聚乙二醇生物素(HS-PEG5K-功能化检测抗体(多克隆抗体clone6E10，特异性结合Aβ1-42的N-terminus，BioLe