抗血小板抗体检测及临床应用研究进展总结2026

抗血小板抗体检测及临床应用研究进展总结2026血小板具有复杂的抗原系统，主要包括血小板特异性抗原（humanplateletantigen，HPA），ABO血型系统抗原，人类白细胞抗原（humanleukocyteantigen，HLA）以及与单核-巨噬细胞及有核红细胞共有的抗原-血小板膜糖蛋白Ⅳ［plateletmembraneglycoproteinⅣ，GPⅣ，又称分化群36（clusterofdifferentiation，CD36）］等。在血小板抗原中，GPⅡb/Ⅲa受体复合物是血小板质膜中含量最丰富的黏附受体，其次是GPⅠb/Ⅸ受体复合物。GPIa/Ⅱa受体复合物是血小板上的胶原蛋白结合受体，虽非血小板特有，但是在胎儿和新生儿同种免疫性血小板减少症（fetalandneonatalalloimmunethrombocytopenia，FNAIT）中是一种常见的抗原载体。近年来，GPV和P-选择素的潜在临床应用价值也逐渐受到关注。人类血小板抗原（humanplateletantigens，HPA）是GP上的同种抗原，因编码GP的基因单核苷酸多态性而存在差异。HPA系统在健康和疾病状态下都具有高度多态性，如HPA-1a和HPA-5b抗体是引起高加索人同种免疫性血小板减少最常见的抗体，其次是HPA-1b、HPA-3b、HPA-15系统抗体，而HPA-3和HPA-15是汉族人群中最常见的多态性系统。HLA抗原又称组织抗原，免疫原性强，易引起同种免疫反应，是引起血小板输注无效（platelettransfusionrefractoriness，PTR）的主要免疫因素

［

1］

。抗血小板抗体是一类能与血小板表面抗原特异性结合的免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig），通过多种机制参与血小板减少和功能异常，抗血小板抗体快速有效地检测有助于明确发病机制和临床诊断。抗体介导的血小板减少分为可结晶片段（fragmentcrystallizable，Fc）受体依赖途径和非Fc受体依赖途径，Fc受体依赖途径为抗血小板抗体通过IgG-Fcγ受体（fragmentcrystallizableγreceptor，FcγR）介导巨噬细胞对血小板的识别和清除，是重要的血小板清除途径；非Fc受体依赖途径是IgM型抗体或多聚IgG激活补体经典途径，生成补体3b（complement3b，C3b）、C5b-9膜攻击复合物，通过补体受体介导血小板被吞噬，或直接破坏血小板膜完整性

［

2,3］

。另一方面，抗血小板抗体还可通过交叉反应攻击骨髓中的巨核细胞或抑制血小板生成素的产生，抑制其增殖，分化及成熟。Fc半乳糖基化的升高通过增强Fc-Fc相互作用和IgG六聚体形成，推动经典补体途径激活，导致供体血小板清除，Fc唾液酸化水平升高也有辅助增强作用

［

4］

。近年来，随着免疫学和材料科学的不断发展，抗血小板抗体检测逐渐转变为高通量精准化模式，在临床中的应用逐渐从辅助性诊断工具演变为指导治疗的核心技术，本文旨在探讨抗血小板抗体检测的发展以及其在疾病诊断，治疗以及预后中的应用价值及问题。一、抗血小板抗体检测技术进展早期抗血小板抗体的检测主要经历了3个阶段。第1阶段以血小板的功能特性作为检测终点，例如血小板聚集试验、血清素释放和补充固定技术等，这类检测由于特异度和敏感度低，无法直接区分抗体类型，且易受干扰等因素逐渐被淘汰。20世纪70年代，放射性标记或免疫荧光标记的抗人免疫球蛋白的出现衍生出了第2阶段血小板抗体检测技术，例如放射免疫分析，酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA），血小板免疫荧光测试和混合被动血凝分析，这类检测技术可以直接或间接检测患者血清中或患者血小板上结合的抗体。但是，血小板表面共表达HLA-Ⅰ类抗原和FcγRⅡa，导致难以区分HLA抗体与HPA抗体，以及存在非特异性结合，进而限制了其在临床上的应用。为了避免抗体干扰问题，研究者们发现氯喹可以去除血小板表面HLA抗原，但保持携带膜糖蛋白的HPA完整性

［

5］

。随着GP特异性单克隆抗体的成功制备，第3代检测方法应运而生，这类方法能够检测结合在微孔板孔内捕获的血小板膜糖蛋白上的抗体，主要包括单克隆抗体特异性血小板抗原捕获法（monoclonalantibody-specificimmobilizationofplateletantigen，MAIPA），改良的抗原捕获ELISA以及Luminex磁珠法。商用的抗血小板抗体检测试剂盒（例如PakLx试剂盒等）其原理是采用注入了2种荧光染料组合的聚苯乙烯微珠，两者同时被635nm波长的红色激光激发，该系统可以同时识别多达100个独特的微球，每个微球都携带特定的抗原，通过R-藻红蛋白相连的二抗检测抗体，Luminex200仪器检测和抗体匹配软件对数据进行分析

［

6,7］

。尽管当前市面上有很多商用HPA抗体检测试剂盒，但在国际输血协会血小板免疫学项目中，大部分参与的实验室仍采用MAIPA试验进行抗体检测和鉴定，MAIPA试验具有高敏感度和特异度，被视为抗HPA抗体检测的“金标准”，也是抗血小板抗体检测的参考方法。随着蛋白磁珠阵列技术的兴起，抗血小板抗体检测逐渐从定性转变为定量，从低敏感度、低特异度演变为高特异度、高敏感度、高通量。抗血小板抗体检测以改良固相免疫检测为主流，兼顾特异性与临床实用性。Campbell等

［

8］

研发了一种改良的MAIPA方法，主要通过对致敏阶段缓冲液、血小板数量、血清体积、溶解缓冲液以及孵育条件和时间进行优化，不仅可以缩短检测时间（从8h缩短至5h），而且与传统的MAIPA检测结果完全一致。改良的MAIPA检测HPA-1a抗体的灵敏度甚至达纳克级，对HPA-1a和HPA-5b抗体灵敏度标准品的滴定终点等于或高于国际研讨会记录的平均值。Mörtberg等

［

9］

发现，使用生物素化单克隆抗体，链霉亲和素包被微珠改良MAIPA，并通过流式细胞术进行检测，抗HPA-1a、抗HPA-3a和抗HPA-5b敏感度增强，还可以检测抗HPA-15（CD109），其检测抗HPA-1a定量下限（0.4U/ml）低于标准MAIPA的定量下限（1U/ml）。针对血小板特异性膜糖蛋白抗体检测，研究人员开发了一种新的定量检测方法-流式细胞免疫微球阵列（flowcytometricimmuno-microspherearray，FCIA），当联合检测抗GPⅨ、抗GPⅠb、抗GPⅡb、抗GPⅢa和抗P-选择素抗体时，定量FCIA的敏感度，特异度和准确性分别为73.13%、81.98%和78.65%，而MAIPA的敏感度、特异度和准确性分别为41.46%、90.41%和72.81%

［

10］

，定量FCIA检测试剂盒在预测免疫性血小板减少症（immunethrombocytopenia，ITP）方面比MAIPA和放射免疫分析检测试剂盒具有更好的灵敏度和准确性。而且，该方法变异系数范围为3.8%~9.4%，重复性更优，低于定性FCIA检测的变异系数范围（29.9%~46.8%），这种定量检测血小板自身抗体的方法有利于临床监测ITP患者对类固醇治疗的反应性。Luminex免疫磁珠法是一种基于荧光编码微珠的多重检测技术，2017年，Metzner等

［

11］

提出了基于Luminex系统的血小板抗体珠阵列新技术，可用于抗血小板抗体的检测与识别，进一步提升检测效率。2019年，Tao等

［

12］

将单克隆抗体包被于Luminex微珠表面，可成功实现HPA-1、HPA-2、HPA-3、HPA-5与HLA抗体的同时检测，具有高敏感度和特异度，尤其适用于低浓度HPA抗体。随后，研究者利用表达GPIIb-IIIa等位异构体的动物细胞系（如COS细胞、CHO细胞）和人类细胞系（如K562细胞、HEK293细胞）检测血小板同种抗体，但是在临床诊断中大多未能取得成功，部分原因在于这些细胞系所呈现的糖链可能与人类巨核细胞和血小板中GPⅡb所携带的糖链存在差异

［

13,14］

。为克服这一局限以及MAIPA检测需要大量新鲜标本的缺点，体外生成血小板成为当前的研究热点。诱导的多能干细胞或者从外周血，红细胞层或者血沉棕黄层中分离的CD34+细胞在体外分化为巨核细胞，构建出经基因工程改造的HLAⅠ类分子阴性，HPA等位基因特异性巨核细胞，利用流式细胞术检测抗HPA同种抗体

［

15,16］

。与现有的检测方法相比，当患者样本中同时存在HLAⅠ类抗体时，使用HLAⅠ类分子阴性的巨核细胞进行检测更能体现出优势，有望克服目前MAIPA测试的局限性。目前，随着检测方法的不断成熟与标准化，商品化的血小板抗体检测试剂盒越来越多。用于临床原发性或继发性ITP辅助诊断的抗血小板膜糖蛋白GPⅠb/Ⅸ抗体和GPⅡb/Ⅲa抗体流式细胞术检测试剂盒；用于体外定性检测血小板抗体和血小板交叉配型的固相凝集法和微柱凝胶法筛检血小板抗体的试剂盒相继获得我国国家药品监督管理局的批准。在美国，食品药品监督管理局也批准了LIFECODESLSA系列试剂盒和LIFECODESPak系列试剂盒用于检测血小板自身抗体和（或）HLA抗体。这些获批的商品化临床试剂盒也加速了血小板抗体检测的临床应用。二、抗血小板抗体在临床中的应用ITP是一种常见的自身免疫性出血性疾病，抗血小板自身抗体检测是ITP诊断的重要依据之一，对于鉴别免疫性与非免疫性血小板减少具有重要价值，这些自身抗体主要靶向GPⅡb/Ⅲa（70%~80%）和GPIb/Ⅸ（20%~40%）

［

17,18,19］

。在临床检测中，仅有50%~60%的ITP患者在外周血中检测到这些抗体，单独骨髓检测的敏感度和特异度为69%和100%，单独外周血检测的敏感度和特异度为60%和90%，而联合骨髓和外周血检测敏感度和特异度提升至72%和90%

［

20］

。糖皮质激素和静脉注射免疫球蛋白G（intravenousIgG，IVIG）是原发性ITP的一线推荐治疗方法，多项研究显示抗GPIb/Ⅸ阳性ITP患者对糖皮质激素，IVIG和重组人血小板生成素治疗反应不佳，而抗GPⅡb/Ⅲa阳性患者对利妥昔单抗、糖皮质激素和IVIG治疗反应更好。利妥昔单抗（抗CD20免疫抑制剂）已成为持续性或慢性ITP患者脾切除术前常见的治疗选择，40%~50%的ITP患者对利妥昔单抗单药治疗初始有反应，1年、2年和5年的应答维持率分别为38%、31%和21%。大剂量地塞米松联合利妥昔单抗治疗ITP时，抗GPⅠb/Ⅸ单阳性患者在4周和6个月时的反应比值比（37.5%和29.2%）低于抗GPⅡb/Ⅲa单阳性患者（78.3%和78.3%），且无反应率更高

［

21］

。GPⅤ是血小板表面的一种糖蛋白，属于黏附分子家族，主要参与血小板活化和凝血过程。对60例未经治疗的ITP患者进行MAIPA检测，85%患者检测到血小板相关自身抗体，其中61%ITP患者抗GPⅤ抗体阳性

［

22］

，Vollenberg等

［

23］

也证实了GPⅤ抗体在ITP发病机制中的重要作用。P-选择素（又称颗粒膜蛋白140，GMP-140）是一种血小板活化标志物，可介导血小板聚集，抗P-选择素抗体可破坏血小板并损害血小板功能。研究发现，与非ITP患者相比，ITP患者的P-选择素抗体水平升高，在新诊断的ITP患者中，GP特异性抗体阳性且抗P-选择素抗体阳性的患者对类固醇治疗的反应不如抗P-选择素抗体阴性的患者

［

24］

。疫苗诱导的血栓性血小板减少症是疫苗接种后罕见但严重的并发症，以血小板减少和血栓形成为特征，与肝素诱导的血小板减少症在临床特征和潜在机制上有相似之处，均为抗血小板因子4IgG通过FcγRⅡa介导血小板活化

［

25,26,27］

。一项研究发现在232例临床疑似疫苗诱导的血栓性血小板减少症患者中，19%患者检测到抗GPⅡb/Ⅲa、GPⅤ和GPⅠb/Ⅸ抗体阳性的患者分别占39%、32%和86%，主要与血小板减少相关

［

28］

。药物诱导的血小板减少症（drug-inducedthrombocytopenia，DITP）可以由多种药物（如奎宁药物和磺胺类等）和免疫机制诱导机体产生抗血小板抗体

［

29］

，导致轻度到重度不等的血小板减少，血小板计数通常低于10000/μl。当服用新药后大约1周出现血小板减少症时，可怀疑是DITP，通过流式细胞术检测药物依赖性的抗血小板抗体，可明确DITP的诊断，从而及时停用相关药物

［

30］

。一项研究发现通过开发机器学习模型早期识别DITP高危患者，在提升患者安全方面具有潜力，通过在药物使用时或入院时生成风险预测，模型可帮助临床医生主动干预，从而降低DITP严重出血并发症的发生概率

［

31］

。CD36缺乏症的发生率在种族之间差异很大，亚洲人群中发生频率明显高于高加索人群。CD36缺乏症患者可能因输血或妊娠产生抗CD36抗体，抗CD36抗体是继HLA抗体和HPA抗体之后最常见的血小板抗体，与PTR、FNAIT、输血后紫癜和输血相关急性肺损伤相关。CD36缺乏虽罕见，但是CD36缺陷（先天性或获得性）与其他GP缺陷（也可为先天性或获得性）合并存在时，可能会加重出血症状

［

32］

。CD36缺乏症分为2种类型：Ⅰ型的特征是血小板和单核细胞上缺乏CD36表达，Ⅱ型的特征是仅血小板上缺乏CD36表面表达

［

33］

。流式细胞术是目前实验室中检测血小板CD36表达最广泛最直接的方法，但很少用于临床输血科室

［

34］

。及时快速检测抗CD36抗体有助于提供交叉配型兼容的血小板，优化输血效果

［

35］

。FNAIT是一种罕见疾病，其并发症主要为颅内出血及神经系统后遗症

［

36］

。抗HPA-1a和HPA-5b是引发FNAIT的主要因素（90%），且此类病例严重出血并发症的复发率较高

［

37］

。目前，已制备出多种针对人类HPA-1a的单克隆抗体，包括通过分离HPA-1a特异性B细胞获得的D-204和M-204，杂交瘤技术获得的SZ21、通过噬菌体技术获得的ML152、B2G1以及26.4

［

38］

。一项Ⅰ期临床试验表明单克隆抗HPA-1a抗体RLYB212可以作为FNAIT的预防性治疗药物，可在高危妊娠中预防母体HPA-1a同种免疫

［

39］

。HPA-9b是FNAIT的第三大致病抗原，但常规血清学检测难以检出抗HPA-9b抗体，可能由于GPⅡb上的O-连接唾液酸残基掩盖了HPA-9b同种抗原表位，研究发现去唾液酸化可提升其检测灵敏度

［

40］

。虽然HPA是FNAIT的主要预测因子，但是Bertrand等

［

41］

发现1例父亲ITGB3基因第9外显子存在低频单核苷酸变异，导致糖蛋白GPⅢa出现R360C氨基酸改变，形成新的血小板同种抗原Efs²

a，母亲对该抗原产生同种免疫反应，最终引发FNAIT。FNAIT产前诊断分为有创方式（羊膜穿刺或绒毛膜取样）和无创方式（母体血液），由于羊膜穿刺存在约0.5%的并发症风险，近年来无创产前诊断技术逐渐兴起。通过检测母体血浆中的HPA抗体，可作为检测同种免疫妊娠传统方法的替代方案，筛查检测应包括HPA-1、3和5，在亚洲患者中应包括HPA-4

［

42］

。由于现有血小板抗体检测方法存在各自的局限性，国际血栓与止血学会血小板免疫学科学小组委员会在最近的FNAIT诊断建议中，推荐使用2种不同的方法检测HPA同种抗体。PTR可分为非免疫性和免疫性2类诱因，免疫因素主要包括：HLA抗体（80%~90%）、HPA抗体、HPA和HLA抗体，错配的ASO抗体和血小板自身抗体

［

43］

。PTR诊断可以通过LuminexSAB技术、ELISA、MAIPA或流式细胞术等方法进行

［

44］

，检测血液样本中抗HLA抗体的金标准为微球-流式细胞术技术。实验室解决PTR的方法主要有2种：一是通过血清学血小板交叉配型试验筛选HLA/HPA特异性血小板，二是建立已知HLA和HPA基因型的供者血小板库，采用血清学配型和HLA/HPA基因配型输注血小板可提高血小板输注的疗效，保证输血的安全性和有效性

［

45,46,47］

。临床上，一方面通过输注不含任何HLA-Ⅰ类分子的血小板或者体外生成HLA-Ⅰ类缺陷型血小板克服血小板输注无效，另一方面依库珠单抗（抑制补体C5成分的单克隆抗体），IVIG或血浆置换可有效治疗PTR患者

［

1，48］

。三、抗血小板抗体检测的局限和展望血小板免疫学的研究与进展提升了中国人群对免疫性血小板疾病的临床诊断、治疗（包括输血）及预防水平，国内大部分实验室已建立并完善了血小板抗体检测与HPA基因分型技术

［

49］

。由