超40种双抗生产经验从分子设计到功能验证的抗体开发全流程解决方案

超40种双抗生产经验，从分子设计到功能验证的抗体开发全流程解决方案据Nature旗下的BioPharmaDealmakers期刊介绍，2025年全球药品交易额前20的项目中，双特异性抗体（BsAb）数量达到25%。20多年的发展，双抗的结构形式已超过100种。这些结构形式的不同会影响抗体的结合位点数量、空间关系、药代动力学、半衰期等等。根据是否含有Fc区分为IgG-like和Non-IgG-like双特异性抗体。义翘神州依托成熟的重组蛋白表达平台，满足高通量、快速的双抗生产需求。义翘神州拥有超过40种双抗的生产经验，涵盖BiTE、Diabody、CrossMab、DVD-IgG等主流形式，为候选分子筛选、机制研究及功能验证提供技术服务。一、BsAb结构设计与优化双特异性抗体（BsAb）结构设计需要平衡多个目标，比如效力与半衰期、稳定性与组织穿透力、可制造性与复杂性。稳定性、溶解性及其它与成药相关的参数构成双抗分子的可开发性评估数据。双抗在开发过程中可能会改变其结合区域的分子大小、排列、价位、柔性和几何结构。BsAb的物理结构、臂间距离、连接器灵活性及其结合位点决定着成败。比如膜近端结合会增加细胞桥接功能，而远端表位可能更适合阻断配体结合。长而灵活的连接器有助于增加抗体可及性，但会降低稳定性。“2+1”多价结合能够增强对高密度抗原细胞的选择性。mAbs期刊发表了一篇来自罗氏研发中心UlrichBrinkmann与斯图加特大学的RolandE.Kontermann的综述文章，以截止2025年底的全球临床数据为基础，梳理501个多特异性抗体的研究进展，并将112种结构的分子形态划分为无Fc区结构（非IgG样BsAb）与含Fc结构（IgG样BsAb）两大类别。多特异性抗体的分子结构（源自文献：doi:10.1080/19420862.2026.2613548）01Non-IgG样双特异性抗体这类BsAb不含Fc区，通过抗原结合特性发挥相应的效应机制，主要有BiTE、DART、TandAb、Bi-Nanobody、TandemscFvs、Dock-and-lock（DNL）等。分子量通常低于100kDa，肿瘤组织穿透力强，但不能介导Fc对应的生物学功能，且半衰期短。全球首个获批的CD19×CD3双抗是T细胞衔接器（BiTE）类型。02IgG样双特异性抗体含Fc结构域的双抗是主流，约占临床在研分子的88%（源自以上综述文章），主要有KIH、CrossMab、DutaMab、Ortho-FabIgG、DVDIgG等。Fc片段通过FcRn介导的循环作用将半衰期延长至数周，并保留ADCC、CDC和ADCP等功能，还具有稳定性强、易生产的优势。Faricimab是罗氏以CrossMAb（交叉Fab）技术结合Knob-into-Hole（KiH）技术构建的IgG样双抗，靶向VEGF-A+Ang-2。研究人员还开发出混合型BsAb，比如将scFv片段与Fc片段连接，兼具scFv的靶向性和Fc的效应功能，有利于延长半衰期。Bi-nanobody技术结合VHH与Fc片段，提高稳定性和穿透性，适用于靶向难治性靶点或需要快速穿透组织的场景。双抗的结合位点设计需要综合考虑靶点特性、作用机制、亲和力、空间构象、稳定性及安全性等因素，常见的价位有“1+1”（双价）、“2+2”（四价）。双价BsAb分子量较小、渗透性强，但四价BsAb具有更高的亲和力和稳定性。连接子长度、灵活性和氨基酸组成也会影响双抗的结合活性和稳定性。柔性连接子（如G4Slinker）有利于靶点结合。引入二硫键、优化连接肽或采用特定的平台（如KIH、CrossMab等），同样能够增强双抗的稳定性，减少错配和聚集体形成。所以，需要通过合理的结构设计和优化，实现双抗的高效、安全靶向治疗。二、如何提高双抗产量和质量？单链可变片段（scFv）是具有单一的抗原结合位点，是抗体功能的最小形式，分子量在25kDa。目前主要有双特异性T细胞衔接器(BiTE）、双亲和重靶向蛋白（DARTs）和串联二抗（TandAbs）3种双抗形式。稳定的scFv通过环接法（loopgrafting）和诱变法构建。环接法将CDRs移植到具有适当生物物理特性的框架上，Borras等人将15种不同兔单抗的CDR嫁接到人scFv上，实现兔可变结构域的人源化和稳定性，产生了相似亲和力但物理特性显著改善的抗体。通过诱变方法可实现位点特异性优化或蛋白质定向进化，提高其稳定性。IgG样双抗生产面临如何确保抗体片段组装正确的挑战。载体系统的进化和表达平台的多样性，为其提供关键的解决方案。早期载体构建，肽链分别由不同的质粒编码，通过共转染进入宿主细胞，存在错配和批次重复差。后来发展出单载体、双载体/四载体及附加载体系统，提升正确组装率。目前主流的双抗表达系统有原核系统（大肠杆菌）、哺乳动物细胞（CHO、HEK293）、无细胞表达系统。大肠杆菌优势在于成本低、操作简单。从接种到收获仅需24-48小时，适合早期候选抗体的快速筛选。而大肠杆菌无糖基化修饰、易形成包涵体，主要用于生产非IgG样双抗。CHO细胞是目前双抗生产的首选系统，具有翻译后修饰、避免免疫原性、高产量等优势。通过培养基和培养工艺优化，CHO细胞的抗体滴度可达10-15g/L。据统计，全球获批的双抗中，80%以上由CHO生产。HEK293细胞的优势在于瞬转效率高，其糖基化更接近人类天然抗体。但由于其滴度低于CHO细胞、长期培养稳定性差，因此主要用于临床前研究或小批量生产。无细胞蛋白合成系统以外源DNA或mRNA为模板，实现蛋白的体外合成，表达过程缩短至几小时，更加快速、高效。双抗从结构设计、表达、工艺到成药性分析的整个流程（源自文献doi:10.1016/j.chroma.2025.465722）三、义翘神州解决方案义翘神州拥有超40种双特异性抗体生产经验，包括BiTE、Diabody、CrossMab、DVD-IgG等多种形式，建有自主优化的CHO、HEK293和无细胞表达平台，支持负责双抗分子设计与表达。义翘神州技术平台双抗生产服务成功率超过90%，高通量哺乳动物表达平台具有每月10000+的抗体生产能力，支持IgG、scFv、VHH等多种抗体形式的表达制备。如下图所示，双特异性抗体采用Knobs-into-Holes（KiH）重链异源二聚化设计。经过蛋白A亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤三步纯化后，单体纯度由68.5%提升至96.6%。义翘神州拥有丰富的靶点蛋白产品，涵盖免疫检查点、肿瘤相关靶点、细胞因子受体等，可用于结合活性验证及功能评估。靶点蛋白经过抗体结合活性验证，部分还经过生物类似药（biosimilar）活性验证。义翘神州还提供多样化的体外功能验证服务，包括SPR/BLI亲和力检测、体外活性检测等，全面助力双特异性抗体的开发需求。【参考文献】1.AndrewMarshall,Theyearofthebispecificinoncologyandbeyond.BioPharmaDealmakers,2025./10.1038/d43747-025-00111-42.UlrichBrinkmannaandRolandE.Kontermann,Themakingofmultispecificimmunoglobulins-aclinicalperspective.MABS,2026./10.1080/19420862.