《人皮肤类器官》

附件二ICS07.080

CCSA40

团体标准

T/CSCBXXXX—XXXX

XXXX

人皮肤类器官

Humannormalskinorganoid

（征求意见稿）

XXXX-XX-XX发布中国细胞生物学学会发布XXXX-XX-XX实施

前言

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规

则》的规则起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利责任。

本文件由中国人民解放军军事科学院军事医学研究院提出。

本文件由中国细胞生物学学会归口

本文件起草单位：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院。

本文件主要起草人：XXXX。

人皮肤类器官

1范围

本文件规定了人皮肤类器官的伦理要求、技术要求、检测方法要求。

本文件适用于人体干细胞来源人皮肤类器官的制备和检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，标注日

期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不标注日期的引用文件，其最新版本（包

括所有的修改单）适用于本文件。

WS213丙型肝炎诊断

WS293艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准

WS299乙型病毒性肝炎诊断标准

中华人民共和国药典（2020年版）

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

类器官organoid

由干细胞或前体细胞体外自组织形成，由组织器官特异性的多种细胞组成，具有特定器

官关键结构和功能特性的三维（3D）细胞培养物。

3.2

人皮肤类器官humanskinorganoid

由人体干细胞（包括人胚胎干细胞和诱导多能干细胞）通过体外逐步诱导形成的，可以

在体外扩增并重现人体胚胎皮肤形态、结构、遗传特征，在体内具有再生能力的类器官。

3.3

人体干细胞humanstemcells

人体中一类能够自我更新、具有分化成一种或多种功能细胞类型的细胞。

3.4

传代passage

体外培养的类器官经过物理、化学或生物方法，将原有类器官分成更小细胞簇甚至是单

细胞，重新接种到与原培养条件相同的新培养体系中进行体外培养的过程。

3.5

冻存cryopreservation

类器官暂时脱离生长状态，并保持其细胞组成、基因表达特征及功能特性的低温冷冻过

程。

3.6

复苏thawing

冻存的类器官重新获得生长活力的过程。

3.7

表皮epidermis

位于皮肤最外层，为角化复层鳞状上皮，由外向内可分为角质层、颗粒层、有棘层、基

底层4层。

3.8

真皮dermis

位于表皮下层，结构从上至下可分为乳头层和网状层，真皮突起无数乳头，嵌入表皮深

面，并伴有神经、血管、淋巴管及皮肤附属器（如毛囊、皮脂腺等）等组织构成。

3.9

毛囊hairfollicle

毛发分为两部分：突出皮面的部分称为毛干，而生长于皮肤内的是毛囊。毛囊的上皮性

成分分为内毛根鞘和外毛根鞘，结缔组织性成分包含真皮鞘及毛乳头。

3.10

感觉神经元sensoryneuron

感觉神经元亦称为受体神经元，会将神经刺激由受体或感觉器官传送到中枢神经系统。

传入神经的结构包含有光滑圆形神经细胞体、一长条的树状突及一较短的轴突；树突接受其

他神经元轴突传来的冲动并传给细胞体；轴突接受外来刺激，再由细胞体传出。

3.11

皮脂腺sebaceousgland

大多位于毛囊及立毛肌之间，由一个或几个囊状的腺泡与一个共同的短导管构成。分泌

部呈囊泡状，由多层腺细胞构成。腺泡周边紧贴基膜的细胞较小，呈扁平或立方形，称为基

细胞。新生的腺细胞不断向中心移动，体积增加，胞质内的小脂滴越来越多，腺泡中心的细

胞更大，细胞核固缩、细胞器消失，胞质内充满脂滴。

3.12

胶原collagen

胶原蛋白是一种细胞外蛋白质，具有独特的三股螺旋结构，是细胞外基质中最重要的

组成部分，皮肤中的胶原以I型和III型为主。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

Ct：循环数的荧光阈值（Cycle-threshold）

DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）

HBV：乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）

HCV：丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）

HIV：人免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）

PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferSaline）

PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）

RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）

STR：短串联重复序列（ShortTandemRepeat）

5总体要求

5.1签署知情同意

应与人体组织供者签署书面的合法有效的知情同意通知书，包括但不限于，合适条件下

潜在研究及治疗的应用，研究成果潜在的商业应用及其它问题所适用的内容。

5.2伦理要求

人皮肤类器官的生产和研究方案应由伦理审查委员会审查通过。

6核心技术要素

6.1形态

6.1.1人干细胞来源皮肤类器官形态

人干细胞来源皮肤类器官应为边缘光滑的白色三维囊性结构，直径在3-4毫米之间；应

由分层表皮、富含脂肪的真皮和带有皮脂腺的色素毛囊组成，形态致密，应具有极化结构，

头部应具有黑色或白化毛发及毛囊结构。

6.1.2人组织来源皮肤类器官形态

组织来源皮肤类器官应为边缘光滑的三维囊性结构，外侧应为紧密接触的基底层细胞，

内侧应为同心圆排列的表皮多层细胞结构。

6.2染色体核型

正常核型应为46，XY或46，XX。

6.3细胞组成

6.3.1人干细胞来源皮肤类器官细胞类型

人干细胞来源皮肤类器官应由表皮、真皮、神经细胞、毛囊和皮脂腺组成。

6.3.2人干细胞来源皮肤类器官细胞标志基因

表皮结构应检测到以下标志物：中间层细胞标志基因KRT5，基底层细胞标志基因KRT15，

棘层细胞标志基因KRT10，表皮层细胞标志基因CD49F；

真皮结构应检测到以下标志物：真皮乳突结构标志基因SOX2和P75，真皮成纤维细胞标

志基因PDGFRα，真皮脂肪细胞标志基因LipidTOX；

毛囊结构应检测到以下标志物：毛囊内毛根鞘结构标志基因GATA3和KRT71，毛囊外

毛根鞘结构标志基因KRT17；

感觉神经元细胞标志基因ISL1或TUJ1，皮脂腺细胞标志基因SCD1。

6.3.3人组织来源皮肤类器官细胞类型

人组织来源皮肤类器官细胞应呈同心圆样排列，由外而内，外圈细胞排列紧密应为表皮

干/祖细胞，内部细胞数量少应为成熟分化细胞。

6.3.4人组织来源皮肤类器官细胞标志物

人组织来源皮肤类器官应检测到以下标志基因：表皮干/祖细胞标志基因CK14，CK5，

Integrinα6和P63，与皮肤基底层对应，成熟分化细胞标志基因Involucrin、CK1和CK10。

6.4胶原

皮肤类器官中应含有I型和III型胶原蛋白。

6.5体外培养及生长

6.5.1人体干细胞培养成的皮肤类器官应能在体外维持培养超过140天，140-160天内整体

细胞数量不减少，形态不发生改变。

6.5.2供者来源的皮肤组织在体外初次培养为类器官后，在保证整体数量不减少的前提下，

应能在体外传代至少3代，新传代的类器官与上一代类器官应具有相同的形态、细胞组成、

细胞核型等特征。

6.5.3当类器官传代后，应能进行体外重建成为新的类器官，且应能维持自我更新和皮肤

干/祖细胞的分化能力。

6.6存活率

新复苏的类器官细胞存活率应不低于90%，且存活的类器官在体外应可以进行传代

培养。

6.7微生物

真菌、细菌、支原体、HBV、HCV、HIV、外源病毒等应为阴性。

6.8STR

体外培养的类器官，进行STR检测及分型鉴定，应与供体STR一致。

6.9检测方法

6.9.1形态

体外三维培养类器官，使用倒置相差显微镜和体式显微镜直接观察，并按照附录A的

方法检测。

6.9.2染色体核型

按照《中华人民共和国药典（2020年版）》中“生物制品生产检定用动物细胞基质制备

及质量控制”检测。

6.9.3细胞组成

按照附录B的方法检测。

6.9.4数量

体外培养类器官通过体式显微镜进行拍照，显微镜附带比例尺进行类器官的直径测量并

进行统计。同时，对类器官的个数进行直接计数。

6.9.5胶原

按照附录B和附录C的方法检测。

6.9.6存活率

按照附录D的方法检验。

6.9.7微生物

6.9.7.1真菌及真菌

按照《中华人民共和国药典（2020年版）》中“1101无菌检查法”检测。

6.9.7.2支原体

按照《中华人民共和国药典（2020年版）》“3301支原体检查法”检测。

6.9.7.3HIV

按照WS293核酸法检测。

6.9.7.4HBV

按照WS299核酸法检测。

6.9.7.5HCV

按照WS213核酸法检验。

6.9.7.6外源病毒因子

按照《中华人民共和国药典（2020年版）》中“3302外源病毒因子检查法”项检测。

6.9.8STR

按照附录E检测。

7其他技术要素

7.1使用说明

应至少包括以下内容：

7.1.1产品名称：宜为人正常皮肤类器官

7.1.2类器官代次：干细胞来源皮肤类器官应为原代类器官；组织来源皮肤类器官宜为原

代、一代或二代。

7.1.3类器官数量：干细胞来源皮肤类器官宜24孔板每孔1个；组织来源皮肤类器官宜24孔

板每孔10-30个。

7.1.4生产日期；宜以皮肤类器官成熟日期为准。

7.1.5储存条件：皮肤类器官应在37℃，5%CO2细胞培养箱长期储存；冻存的组织来源皮

肤类器官应用液氮储存。

7.1.6运输条件：干细胞来源皮肤类器官可2-8℃或室温短途运输；组织来源皮肤类器官可

2-8℃、室温短途运输，也可冻存后干冰或液氮运输。

7.1.7使用方法：室温运输的干细胞来源皮肤类器官应放入37℃，5%CO2细胞培养箱恢复

24小时后，再用于后续实验操作；冻存的组织来源皮肤类器官应使用37℃水浴锅快速解冻复

苏，用基质胶包裹后种植于24孔组织培养板中，放入37℃，5%CO2细胞培养箱培养8天后形

成类器官用于后续实验。

7.2包装

应选择对人正常皮肤类器官关键质量属性无影响的材料和容器。

7.3冻存

7.3.1应在液氮环境下储存。

7.3.2冻存的类器官应标明名称、培养条件、代次、操作人名字或首写字母和冻存日期等。

冻存细胞应具有唯一标识，与其采集、分离、扩增等过程对应。

7.3.3应符合冻存原则，最大限度降低冷冻保存过程中冰晶与溶质对细胞生物学特性的影

响。并做好对应细胞冻存记录。

7.4运输

7.4.1根据细胞的使用要求，选择合适的运输方式和运输条件，保证细胞的生物学特性的

稳定性、安全性和有效性。

7.4.2细胞的运输应考虑但不限于细胞特性、承载细胞的容器、运输路线、运输条件、运

输设备、运输方式、运输风险和保障措施等因素。

7.4.3运输条件的控制应包括但不限于温度范围、振荡、无污染、设备性能和包装等。

7.4.4细胞的运输应记录，包括但不限于细胞运输的方式和条件、路径、时间、人员、地

址及细胞信息等。

7.4.5冻存的细胞应在干冰或低于-130℃条件下运输，非冻存细胞建议在2℃～8℃下运输。

7.5复苏

7.5.1复苏过程应在37℃水浴融化快速融化，最大程度确保细胞存活率和生物学活性。

7.5.2应明确标明细胞信息，包括但不限于细胞名称、代次、培养条件、操作人名字或首

写字母及复苏时间等。

附录A

（规范性）

类器官组织学检测苏木素-伊红染色法

A.1仪器和设备

A.1.1石蜡包埋仪

A.1.2石蜡切片机

A.1.3光学显微镜

A.2试剂

除特别说明外，所用试剂均为分析纯，检测用水均为去离子水。

A.2.1磷酸盐缓冲液：pH为7.4。

A.2.24%多聚甲醛溶液。

A.2.3商品化苏木素-伊红染色试剂盒。

A.3检测步骤

A.3.1类器官样本固定

将体外培养的类器官从培养基中吸出，用磷酸盐缓冲液(A.2.1)洗两次，用4%多聚甲醛

溶液(A.2.2)固定类器官过夜。

A.3.2类器官石蜡切片制作

利用石蜡包埋仪(A.1.1)和石蜡切片机(A.1.2)进行类器官石蜡切片的制作，石蜡切片厚

度为4µm，具体操作按照仪器说明书进行。

A.3.3苏木素-伊红染色

按照商品化苏木素-伊红染色试剂盒(A.2.3)进行类器官石蜡切片的染色，具体操作按照

试剂盒说明书进行。

A.3.4观察

通过光学显微镜进行观察及拍照。

附录B

（规范性）

类器官细胞组成检测免疫荧光染色法

B.1仪器和设备

激光共聚焦显微镜

B.2试剂

除特别说明外，所用试剂均为分析纯，检测用水均为去离子水。

B.2.1商品化免疫荧光染色试剂盒。

B.2.2目标蛋白质抗体。

B.3检测步骤

B.3.1类器官免疫荧光染色

按照商品化免疫荧光染色试剂盒(B.2.1)将类器官石蜡切片(A.3.2)进行染色，具体操作

按照试剂盒及目标蛋白质抗体(B.2.2)说明书进行。

B.3.2观察

通过激光共聚焦显微镜进行观察及拍照，具体操作按照仪器及抗体说明书进行。

B.3.3免疫荧光染色阳性细胞检测分析

结合激光共聚焦成像结果指征，判断类器官是否检测到目标蛋白质的表达。

附录C

（规范性）

类器官胶原检测天狼星红染色法

C.1仪器和设备

光学显微镜

C.2试剂

除特别说明外，所用试剂均为分析纯，检测用水均为去离子水。

商品化天狼星红染色试剂盒。

C.3检测步骤

C.3.1类器官天狼星红染色

按照商品化天狼星红染色试剂盒(C.2.1)将类器官石蜡切片(A.3.2)进行染色，具体操作按

照试剂盒说明书进行。

C.3.2观察

通过光学显微镜进行观察及拍照。

附录D

（规范性）

类器官细胞存活率检测Live/Dead染色法

D.1仪器和设备

激光共聚焦显微镜

D.2试剂

除特别说明外，所用试剂均为分析纯，检测用水均为去离子水。

D.2.1皮肤类器官培养基。

D.2.2磷酸盐缓冲液：pH为7.4。

D.2.3Live/Dead染液的配置

使用皮肤类器官培养基(D.2.1)配制Live/Dead染液，使Ethidiumhomodimer-1（EthD-1）

工作浓度达到4µM，CalceinAM工作浓度达到2µM。

D.3检测步骤

D.3.1类器官染色

将Live/Dead染液(D.2.3)与待测类器官混匀后置于室温避光环境孵育1小时，到达时间后，

用磷酸盐缓冲液(D.2.2)缓慢清洗掉染液，加入新鲜培养基后用于拍照。

D.3.2类器官活/死细胞定量

使用激光共聚焦显微镜对类器官进行分层扫描，层间距设为10µm，高度区间为10-

200µm，将扫描后的图像叠加成一张平面图，对类器官进行计数。用激光共聚焦显微镜的488

激光通道拍摄绿色荧光图像，568激光通道拍摄红色荧光图像，类器官中的活细胞在荧光显

微镜下显示为绿色且边缘清晰，类器官中的死细胞在荧光显微镜下显示为红色。使用ImageJ

软件分别计算红色荧光和绿色荧光强度。

D.4类器官细胞存活率计算

类器官细胞存活率按照公式（D.1）进行计算：

X=（N活/（N死+N活））×100%…（D.1）

式中：

X——类器官细胞存活率；

N活——类器官中代表活细胞的绿色荧光强度；

N死——类器官中代表死细胞的红色荧光强度。

D.5计算与分析

统计5个类器官为一组，计算类器官细胞存活率，在重复性条件下获得3组独立测定结果

的平均值，记为类器官细胞平均存活率。

附录E

（规范性）

类器官STR鉴定

E.1仪器和设备

E.1.1离心机

E.1.2PCR仪

E.1.3电泳仪

E.2试剂

除特别说明外，所用试剂均为分析纯，检测用水均为去离子水。

E.2.1磷酸盐缓冲液：pH为7.4。

E.2.2商品化细胞DNA抽提试剂盒。

E.2.3商品化STR细胞鉴定试剂盒。

E.3样品保存

样品制备好后，于-80℃以下保存。

E.4检测步骤

E.4.1类器官样品制备

将体外培养的类器官从培养基中吸出，用磷酸盐缓冲液(E.2.1)洗两次，用剪刀将皮肤类

器官剪碎用于后续DNA的提取。

E.4.2类器官DNA提取

a）按商品化细胞DNA抽提试剂盒(E.2.2)说明书对类器官和原干细胞DNA进行提取；

b）紫外分光光度计检测提取后的DNA的吸光度A260/A280的比值在1.8~2.0之间；

c）DNA样本要求：DNA体积≥20μL，浓度≥50ng/μL。

E.4.3PCR扩增

a）使用商品化STR细胞鉴定试剂盒(E.2.3)对STR位点进行扩增，具体操作按照试剂盒说

明书进行。

b）设置阴性对照组、样本检测组和阳性对照组。阴性对照组采用无菌水位模板进行PCR

扩增，样本检测组以类器官和原始干细胞样本提取的DNA为模板进行PCR扩增，阳性对照组

采用DNA模板进行扩增。

c）采用琼脂糖凝胶电泳确认PCR扩增产物、阴性对照组和阳性对照组。阴性对照组无

目的条带，阳性对照组有清晰的目的条带。

E.4.4STR基因分型检测

使用毛细管电泳基因分析仪对PCR扩增产物进行检测，并得到STR遗传图谱数据。阳性

对照组有清晰的目的条带。类器官与原始干细胞的扩增条带应该一致。

E.4.5结果分析

a）当STR位点的等位基因含有相同重复次数时，图谱仅出现1个等位基因峰；当含有不

同重复次数时，图谱会出现2个等位基因峰。且当阴性对照组无等位基因峰出现，阳性对照

组检测结果与其标准基因分型数据一致时视为有效检测。

b）在检测有效的前提下，若受检样本STR位点出现2个以上的等位基因峰，经过重复实

验排除引物结合区突变等干扰因素后，判定受检样本存在交叉污染。

参考文献

[1]T/CSCB0001—2020干细胞通用要求

[2]国际医学科学组织理事会世界卫生组织涉及人的生物医学研究的国际伦理准则

2020

[3]国家卫生计生委涉及人的生物医学研究理论审查办法2016

[4]LeeJ,RabbaniCC,GaoH,SteinhartMR,WoodruffBM,PflumZE,etal.Hair-bearing

humanskingeneratedentirelyfrompluripotentstemcells.Nature.2020;582(7812):399-404.

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[7]AgarwalR,DittmarT,BeerHD,KunzM,MüllerS,KapposEA,ContassotE,Navarini

AA.Humanepidermisorganotypiccultures,areproduciblesystemrecapitulatingtheepidermisin

vitro.ExpDermatol.2023Jul;32(7):1143-1155.doi:10.1111/exd.14823.Epub2023Apr

28.

目次

前言..................................................................................................................................................3

1范围..........................................................................................................................................4

2规范性引用文件.......................................................................................................................4

3术语和定义..............................................................................................................................4

4缩略语......................................................................................................................................6

5总体要求..................................................................................................................................6

6核心技术要素...........................................................................................................................7

7其他技术要素...........................................................................................................................9

附录A（规范性）类器官组织学检测苏木素-伊红染色法....................................................12

附录B（规范性）类器官细胞组成检测免疫荧光染色法.....................................................13

附录C（规范性）类器官胶原检测天狼星红染色法.............................................................14

附录D（规范性）类器官细胞存活率检测LIVE/DEAD染色法...........................................15

附录E（规范性）类器官STR鉴定...........................................................................................